Summary
Her presenteres en eksperimentell arbeidsflyt som muliggjør deteksjon av caspase-8-behandling direkte ved det dødsinduserende signalkomplekset (DISC) og bestemmer sammensetningen av dette komplekset. Denne metodikken har brede anvendelser, fra å avdekke molekylære mekanismer for celledødsveier til dynamisk modellering av apoptosenettverk.
Abstract
Ekstrinsisk apoptose formidles ved aktivering av dødsreseptorer (DRs) som CD95/Fas/APO-1 eller tumornekrosefaktorrelatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL)-reseptor 1/reseptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering av disse reseptorene med deres cognate ligander fører til montering av dødsinduserende signalkompleks (DISC). DISC består av DR, adapterproteinet Fas-assosiert protein med dødsdomene (FADD), procaspases-8/-10 og cellulære FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzymhemmende proteiner (c-FLIPer). DISC fungerer som en plattform for procaspase-8-behandling og aktivering. Sistnevnte skjer via dimerisering/oligomerisering i dødseffektordomenet (DED) filamenter samlet på DISC.
Aktivering av procaspase-8 etterfølges av behandlingen, som skjer i flere trinn. I dette arbeidet beskrives en etablert eksperimentell arbeidsflyt som tillater måling av DISC-dannelse og behandling av procaspase-8 i dette komplekset. Arbeidsflyten er basert på immunoprecipitation teknikker støttet av vestlige blot analyse. Denne arbeidsflyten tillater nøye overvåking av ulike trinn i procaspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling og er svært relevant for å undersøke molekylære mekanismer for ekstrinsisk apoptose.
Introduction
En av de best studerte dødsreseptorene (DRs) er CD95 (Fas, APO-1). Den ekstrinsiske apoptotiske banen starter med samspillet mellom DR og konjakkligaden, det vil si at CD95L samhandler med CD95 eller TRAIL binder seg til TRAIL-Rs. Dette resulterer i dannelsen av DISC ved tilsvarende DR. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP proteiner1,2. Videre er DISC montert ved interaksjoner mellom dødsdomene (DD)-inneholdende proteiner, for eksempel CD95 og FADD, og DED-inneholdende proteiner som FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP (Figur 1). Procaspase-8 gjennomgår oligomerisering via assosiasjon av sine DED-er, noe som resulterer i dannelse av DED-filamenter, etterfulgt av procaspase-8 aktivering og behandling. Dette utløser en kaspasekaskade, som fører til celledød (Figur 1)3,4. Dermed er procaspase-8 en sentral initiator caspase av den ekstrinsiske apoptosebanen mediert av CD95 eller TRAIL-Rs, aktivert på den tilsvarende makromolekylære plattformen, DISC.
To isoformer av procaspase-8, nemlig procaspase-8a (p55) og -8b (p53), er kjent for å bli rekruttert til DISC5. Begge isoformene består av to DED-er. DED1 og DED2 er plassert på N-terminaldelen av procaspase-8a/b etterfulgt av katalytiske p18- og p10-domener. Detaljert kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) analyse av procaspase-8 DEDs avslørte montering av procaspase-8 proteiner i filamentøse strukturer kalt DED filamenter4,6. Bemerkelsesverdig nok ble de lineære procaspase-8-kjedene opprinnelig foreslått å være engasjert i dimeriseringen etterfulgt av procaspase-8-aktivering ved DISC. Nå er det kjent at disse kjedene bare er en understruktur av procaspase-8 DED-filamentet, sistnevnte består av tre kjeder samlet i en trippel helix3,4,6,7.
Ved dimerisering ved DED-filamentet fører konformasjonsendringer i procaspase-8a/b til dannelsen av det aktive sentrum av procaspase-8 ogaktiveringen 3,8. Dette etterfølges av procaspase-8-behandling, som formidles via to veier: den første går via genereringen av et p43 / p41 spaltingsprodukt og den andre via den første generasjonen av et p30 spaltingsprodukt. p43/p41-banen initieres av spaltingen av procaspase-8a/b ved Asp374, noe som resulterer i p43/p41- og p12-spaltingsprodukter (Figur 2). Videre er disse fragmentene automatisk katalytisk spaltet på Asp384 og Asp210/216, noe som gir opphav til dannelsen av den aktive caspase-8 heterotetramer, p102/p1829,10,11. I tillegg ble det vist at parallelt med p43/p41-behandlingsforløpet, er procaspase-8a/b også spaltet på Asp216, noe som fører til dannelsen av C-terminal spaltingsproduktet p30, etterfulgt av proteolyse til p10 og p1810 (Figur 2).
Procaspase-8a/b-aktivering ved DED-filamentet er strengt regulert av proteiner kalt c-FLIPer12. c-FLIP-proteinene forekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) og c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle tre isoformene inneholder to DED-er i N-terminalområdet. c-FLIPL har også et C-terminal katalytisk inaktivt caspase-lignende domene12,13. Både korte isoformer av c-FLIP-c-FLIPS og c-FLIPR-virker på en anti-apoptotisk måte ved å forstyrre DED-filamentformasjonen ved DISC6,14,15. I tillegg kan c-FLIPL regulere caspase-8-aktivering på en konsentrasjonsavhengig måte. Dette kan resultere i både pro- og anti-apoptotiske effekter16,17,18. Ved å danne den katalytisk aktive procaspase-8/c-FLIP L-heterodimeren, fører c-FLIPL til stabilisering av det aktive sentrum av procaspase-8 og aktiveringen. Den pro- eller anti-apoptotiske funksjonen til c-FLIPL er direkte avhengig av mengden ved DED-filamentene og den påfølgende mengden montert procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. Lave eller mellomliggende konsentrasjoner av c-FLIPL ved DISC resulterer i tilstrekkelige mengder procaspase-8/c-FLIP L-heterodimere ved DED-filamentet, som støtter aktivering av caspase-8. I motsetning fører økte mengder c-FLIPL direkte til sine anti-apoptotiske effekter ved DISC20.
Samlet sett er aktivering og behandling av procaspase-8a/b på DISC en svært regulert prosess som involverer flere trinn. Dette dokumentet diskuterer måling av procaspase-8-behandling direkte på DISC, samt analysen av sammensetningen av dette komplekset. Dette vil bli presentert ved hjelp av CD95 DISC som det eksemplariske DR-komplekset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
T-celleeksperimenter ble utført i henhold til den etiske avtalen 42502-2-1273 Uni MD.
1. Forbereder celler for eksperimentet
MERK: Gjennomsnittlig antall celler for denne immunseffreringen er 1 × 107. Adherent celler må frøs en dag før eksperimentet slik at det er 1 × 107 celler på dagen for eksperimentet.
- Forbereder tilhengerceller for eksperimentet
- Frø 5-8 × 106 adherentceller i 20 ml medium (se materialtabellen for sammensetningen) for hver tilstand i 14,5 cm retter en dag før eksperimentet starter.
- På eksperimentets dag må du sørge for at cellene er 80-90% sammenfallende og tilhenger av parabolen. Kast mediet og legg til friskt medium til tilhengercellene.
- Forbereder suspensjonsceller for eksperimentet
- Plasser forsiktig 1 × 107 suspensjonsceller i 10 ml kulturmedium (se materialtabellen for sammensetningen) per tilstand i 14,5 cm retter umiddelbart før eksperimentet starter.
- Hvis du bruker primærceller, isolerer du primære T-celler i henhold til den tidligere beskrevne prosedyren21. Behandle primære T-celler med 1 μg/ml fytohemagglutinin i 24 timer, etterfulgt av 25 U/ml IL2-behandling i 6 dager.
- Plasser forsiktig 1 × 108 primære T-celler i 10 ml kulturmedium (se materialtabellen for sammensetningen) per tilstand i 14,5 cm retter umiddelbart før eksperimentet starter.
MERK: Dette høyere antallet primære T-celler anbefales, da disse cellene er mindre.
2. CD95L stimulering
- Stimulere cellene med CD95L (produsert som beskrevet tidligere20 eller kommersielt tilgjengelig (se materiallisten)).
MERK: Konsentrasjonen av CD95L og stimuleringstidspunktet er celletypeavhengig13,15,22,23,24,25. Forbered en stimuleringstilstand to ganger for å generere en "perlekontroll" -prøve parallelt.- Stimulere tilhengerceller med den valgte konsentrasjonen av CD95L. Hold platen i en vinkel og rør liganden inn i mediet uten å berøre de tilhørende cellene.
- Stimulere suspensjonsceller med CD95L ved å pipettere ligandoppløsningen inn i celleopphenget.
3. Cellehøst og lysis
- Legg cellerettene på isen.
MERK: Ikke kast mediet. Døende celler flyter i mediet og er viktige for analysen. - Tilsett 10 ml kald fosfatbufret saltvann (PBS) til celleopphenget og skrap de vedlagte cellene av platen. Samle celleopphenget i et 50 ml rør.
- Vask cellefatet med 10 ml kald PBS to ganger og legg vaskeoppløsningen i samme 50 ml rør. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 × g i 5 min, 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspend cellepellet med 1 ml kald PBS. Overfør celleopphenget til et 1,5 ml rør.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 × g i 5 min, 4 °C. Kast supernatanten og resuspend cellepellet med 1 ml kald PBS.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 × g i 5 min, 4 °C. Kast den supernatante og resuspend cellepelleten med 1 ml lysisbuffer (inneholder 4% proteasehemmercocktail). Inkuber den i 30 min på is.
- Sentrifuger lysatet med maksimal hastighet (~17 000 × g) i 15 min, 4 °C.
- Overfør supernatanten (lysate) til et rent rør. Kast pelletsen. Ta 50 μL av lysatet i et annet rør. Analyser proteinkonsentrasjonen ved Bradford-analysen og ta mengden lysat som tilsvarer 25 μg protein i et hetteglass. Tilsett lastebuffer (se materialtabellen for sammensetningen) i hetteglasset. Oppbevar den ved -20 °C som lysatkontroll.
4. Immunoprecipitation (IP)
- Tilsett 2 μL anti-APO-1 antistoffer og 10 μL protein A sepharose perler (tilberedt som anbefalt av produsenten) til lysatet. Tilsett bare 10 μL perler i et separat rør som inneholder lysat (stimulert prøve) for å generere en 'perlekontroll'.
MERK: Bruk pipetspisser med brede åpninger enten ved å kutte spissene eller kjøpe spesielle tips for IP mens du håndterer proteinet A sepharose perler. - Inkuber blandingen av lysat med antistoffer/protein A sepharose perler med skånsom blanding over natten ved 4 °C. Sentrifuger lysatene med antistoffer/protein A sepharoseperler ved 500 × g i 4 min, 4 °C. Kast supernatanten, tilsett 1 ml kald PBS til perlene, og gjenta dette trinnet minst tre ganger.
- Kast supernatanten. Aspirer perlene fortrinnsvis med en 50 μL Hamilton sprøyte.
5. Vestlig blott
- Tilsett 20 μL 4x lastebuffer (se materialtabellen for sammensetningen) til perlene og varm ved 95 °C i 10 minutter. Varm opp lysatekontrollene ved 95 °C i 5 minutter.
- Last lysates, IPs og en proteinstandard på en 12,5% natriumdodecylsulfatgel (se materialtabellen for gelpreparatet) og kjør med en konstant spenning på 80 V.
- Overfør proteinene fra SDS gel til en nitrocellulosemembran.
MERK: Her ble den halvtørre teknikken, optimalisert for proteiner av interesse, brukt til overføringen over 12 min (25 V; 2,5 A = konstant). Bløtlegg nitrocellulosemembranen og to mini-størrelse overføringsstakker i elektroforesebuffer (se materialtabellen for sammensetningen, forbered i henhold til produsentens instruksjoner) i noen minutter før vestlig blotting. - Legg den flekkete membranen i en boks og blokker den i 1 time i blokkeringsløsning (0,1% Tween-20 i PBS (PBST) + 5% melk). Inkuber membranen med blokkeringsløsningen under mild agitasjon.
- Vask membranen tre ganger med PBST i 5 min hver vask.
6. Vestlig blottdeteksjon
- Tilsett det første primære antistoffet ved den angitte fortynning (se materialtabellen) i membranen og inkuber det over natten ved 4 °C med mild agitasjon.
- Vask membranen tre ganger med PBST i 5 min hver vask.
- Inkuber membranen med 20 ml sekundært antistoff (fortynnet 1:10.000 i PBST + 5% melk) med skånsom risting i 1 time ved romtemperatur.
- Vask membranen tre ganger med PBST i 5 min hver vask.
- Kast PBST og tilsett ca. 1 ml pepperrotperoksidasesubstrat i membranen.
- Oppdag kjemoluminescerende signal (se materialtabellen).
MERK: Eksponeringstiden og antall innspilte bilder avhenger av mengden protein i cellen og spesifisiteten til antistoffene som brukes. Det må etableres empirisk for hvert antistoff som brukes til påvisning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å analysere caspase-8-rekruttering til DISC og dens behandling på CD95 DISC, beskriver dette dokumentet en klassisk arbeidsflyt, som kombinerer IP av CD95 DISC med vestlig blotanalyse. Dette gjør det mulig å oppdage flere viktige funksjoner ved caspase-8-aktivering ved DISC: montering av caspase-8-aktiverende makromolekylær plattform, rekruttering av procaspase-8 til DISC, og behandling av denne initiator caspase (figur 1 og figur 2). Denne arbeidsflyten innebærer behandling av sensitive celler med CD95L på en tidsavhengig måte, etterfulgt av lysis, immunoprecipitation ved hjelp av anti-CD95 (anti-APO-1) antistoffer, og påfølgende vestlig blotanalyse (Figur 3).
Livmorhalskreft HeLa-CD95 celler ble brukt som et eksempel for å analysereDISC-formasjonen 26. Stimulering av disse cellene med CD95L resulterte i et høyt nivå av CD95 DISC-dannelse, overvåket via CD95-immunoprecipitation (Figur 4). CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPs ble observert i disse CD95-immunoprecipitations, noe som indikerer effektiv DISC-dannelse. Det er viktig at spaltingsproduktene til procaspase-8a/b: p43/p41, p30 og p18 ble oppdaget ved DISC, noe som indikerer aktivering av procaspase-8 og den påfølgende behandlingen. Spesielt ble spaltingsproduktene av procaspase-8 p43 / p41 og p18 oppdaget, noe som indikerer de to nevnte trinnene i p43-behandlingsforløpet. I tillegg ble p30-produktet oppdaget, noe som indikerer den alternative banen til caspase-8-behandling. Videre etterfølges aktivering av procaspase-8 på DISC av spaltingen av substratene som c-FLIP-proteiner.
Faktisk ble spaltingsproduktene til c-FLIP-p43-FLIP og p22-FLIP-oppdaget i immunoprecipitations, noe som indikerer caspase-8-aktivering (figur 4). Det er viktig at verken FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPs eller deres spaltingsprodukter ble oppdaget i immunoprecipitation-prøvene fra ubehandlede celler, noe som understreker spesifisiteten til DISC-immunoprecipitation (figur 4). Viktig informasjon kan fås fra disse eksperimentene ved å kvantifisere båndene som tilsvarer de forskjellige spaltingsproduktene til procaspase-8 (figur 4). Denne informasjonen kan brukes i matematisk modellering av apoptosenettverk og gir kvantitativ innsikt i baneregulering.
Nivået på caspase-8-aktiveringen ved DISC er modulert av c-FLIPer. Derfor ble HeLa-CD95-celler som overeksponerer c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15, valgt som det andre eksemplet (Figur 5). Effektene av c-FLIP L-isoformen i disse eksperimentene kunne observeres, noe som resulterte i en annen frekvens av procaspase-8a/ b-behandling til p43 / p41 ved DISC sammenlignet med den tilsvarende proteolysen av procaspase-8 ved DISC i foreldre HeLa-CD95-celler, som beskrevet av Hillert et al. 15. I likhet med observasjonene i figur 4, ble det ikke påvist rekruttering av FADD, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP-proteiner og deres spaltingsprodukter i immunoprecipitations fra HeLa-CD95-FL-celler uten CD95L-behandling, som støtter spesifisiteten til disse immunoprecipitations. Mer bevis for spesifisiteten av immunoprecipitations er fraværet av rekruttering av procaspase-3 og poly (ADP-ribose)polymerase 1 (PARP1) til DISC, som ble observert i CD95L-behandlede immunoprecipitations (Figur 5). Disse proteinene er ikke en del av komplekset, og deres fravær i immunoprecipitation signaler kan tjene som bevis for fravær av ikke-spesifikk binding av rikelig cellulære proteiner.
Til slutt ble immunoprecipitations av CD95 DISC fra suspensjonsceller utført som et tredje eksempel, for eksempel aktiverte primære T-celler (figur 6). Disse cellene er også preget av høye nivåer av CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPer som ble observert i anti-CD95-immunoprecipitations sammen med deres spaltingsprodukter (Figur 6). Påvisning av procaspase-8 spaltingsprodukter i immunoprecipitations indikerer aktivering og behandling av denne initiator caspase i DISC-immunoprecipitation fra primære T-celler. Disse eksperimentene indikerer at DISC kan immunoprecipitated fra mange tilhenger- og suspensjonsceller, og at caspase-8-prosessering og aktivering kan valideres ved vestlig blotanalyse.
Figur 1: Skjematisk presentasjon av CD95-signalbanen. CD95L utløser DISC-samlingen. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP. FADD binder seg til CD95 via DD, mens procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPer samhandler via sine DED-er og danner DED-filamenter. Dannelse av DED-filamentene fungerer som en plattform for procaspase-8 dimerisering, behandling og etterfølgende aktivering. Den aktive caspase-8 heterotetramer, p182/p102, aktiverer caspase-3 ved spalting, noe som fører til apoptose. Forkortelser: CD = klynge av differensiering; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsinduserende signalkompleks; DD = dødsdomene; FADD= Fas-assosiert dødsdomene; c-FLIP = cellulært FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzym-hemmende protein; DED = dødseffektordomene; c-FLIPL = c-FLIPLang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Procaspase-8-behandling ved DISC. To måter å behandle procaspase-8a/b på DISC vises. Den første måten innebærer p43/p41 generasjon etterfulgt av p18 formasjon. Den andre måten innebærer p30 generasjon etterfulgt av behandling til p18 og p10. Rester er nummerert i henhold til sekvensen av procaspase-8a. Forkortelser: DED = dødseffektordomene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk presentasjon av det eksperimentelle oppsettet av DISC-IP. Celler stimuleres med CD95L. Etter stimulering høstes cellene og samles, etterfulgt av forskjellige vasketrinn. Cellene blir deretter lysed, og lysatene samles. Deretter ble protein A-sepharose perler og anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer tilsatt til lysate og inkubert over natten. Etter flere vasketrinn ble immunoprecipitations analysert av vestlig blotting. Forkortelser: DISC = dødsinduserende signalkompleks; IP = immunoprecipitation; CD95L = CD95-liga. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: CD95 DISC-formasjon i HeLa-CD95-celler. HeLa-CD95 celler ble stimulert med 125 ng/ml CD95L i 30 min eller 1 t. CD95 DISC-IPer ble utført ved hjelp av anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer. Sammensetningen av IPs ble undersøkt av vestlig blotanalyse ved hjelp av antistoffene for de angitte proteinene. Actin ble brukt som lastekontroll. Innganger vises. Kvantifisering av procaspase-8 spaltingsprodukter på DISC vises og normaliseres til CD95-signal. Forkortelser: l.e. = lang eksponering; s.e. = kort eksponering; BC = kontrollere IP med 'kun perler', uten tilsetning av antistoffer; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsinduserende signalkompleks; IP = immunoprecipitation; FADD = Fas-assosiert dødsdomene; c-FLIP = cellulært FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzym-hemmende protein; c-FLIPL = c-FLIPLang; c-FLIPS = c-FLIPKort; M = molekylvekt i kiloDalton (kDa). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: CD95 DISC-formasjon i c-FLIPL-overekspresserende HeLa-CD95-celler. HeLa-CD95-FL-celler ble stimulert med 250 ng/ml CD95L for de angitte tidspunktene (1-3 t). CD95 DISC-IPer ble utført ved hjelp av anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer. Sammensetningen av IPs ble undersøkt av vestlig blotanalyse og analysert for de angitte proteinene. Actin ble brukt som lastekontroll. Innganger vises. Kvantifisering av procaspase-8 spaltingsprodukter på DISC vises og normaliseres til CD95-signalet. Ett representativt eksperiment av to vises. Forkortelser: l.e. = lang eksponering; s.e. = kort eksponering; BC = kontrollere IP med 'kun perler', uten tilsetning av antistoffer; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsinduserende signalkompleks; IP = immunoprecipitation; FADD = Fas-assosiert dødsdomene; c-FLIP = cellulært FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzym-hemmende protein; c-FLIPL = c-FLIPLang; PARP1 = poly(ADP-ribose)polymerase 1; M = molekylvekt i kiloDalton (kDa). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: CD95 DISC-formasjon i primære T-celler. Primæraktiverte T-celler ble stimulert med 500 ng/ml CD95L i 15 min og 30 min. CD95 DISC-IPer ble utført ved hjelp av anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer. Sammensetningen av IPs ble undersøkt av vestlig blotanalyse og analysert for de angitte proteinene. Actin ble brukt som lastekontroll. Kvantifisering av procaspase-8 spaltingsprodukter på DISC vises og normaliseres til CD95-signalet. Innganger vises. Forkortelser: l.e. = lang eksponering; s.e. = kort eksponering; ; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsinduserende signalkompleks; IP = immunoprecipitation; FADD = Fas-assosiert dødsdomene; c-FLIP = cellulært FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzym-hemmende protein; c-FLIPL = c-FLIPLang; M = molekylvekt i kiloDalton (kDa). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne tilnærmingen ble først beskrevet av Kischkel et al.27 og har blitt utviklet siden da av flere grupper. Flere viktige problemstillinger må vurderes for effektiv DISC-immunoprecipitation og overvåking caspase-8 behandling i dette komplekset.
For det første er det viktig å følge alle vasketrinn under immunoprecipitation. Spesielt viktig er de siste vasketrinnene til sepharose perler og tørking av sepharose perler. Dette må gjøres riktig for å øke signal-/støyforholdet mellom immunoprecipitation, slik at påvisning av caspase-8 rekruttering og prosessering ved DISC. Viktigst, for svært sensitive analytiske teknikker, for eksempel massespektrometri, et "preclearing step", som inkluderer inkubasjon av lysatene med bare sepharoseperler eller isotype kontrollantistoffer, kan også være viktig for å redusere støyen. Imidlertid har flere studier vist at dette preclearing trinnet ikke er avgjørende for påvisning av caspase-8 rekruttering til DISC ved vestlig blotting7,23. Men som nevnt er vasking av perlene på slutten av immunoprecipitation viktig for å oppnå pålitelige resultater. Ikke-spesifikk binding av rikelig cellulære proteiner til sepharose perler kan i hovedsak redusere de spesifikke signalene til kjernen DISC-komponenter. Som en viktig kontroll for fraværet av den ikke-spesifikke bindingen, kan vestlig blotanalyse av proteinene, rapportert ikke å være til stede på DISC, utføres. Et eksempel på denne analysen er gitt i figur 5, der rekruttering av PARP1 og caspase-3 til DISC-immunoprecipitation ikke ble observert. Dette indikerer spesifisiteten til den spesielle immunoprecipitation og tilstrekkelig vasking av sepharose perler under eksperimentet.
For det andre er det avgjørende å utføre negative kontroller som en beads-only kontroll eller en immunoprecipitation kontroll med et antistoff med samme isotype som antistoffet som brukes til immunoprecipitation. For anti-APO-1 antistoffer kan antimus IgG3 antistoffer brukes som en isotypekontroll. For det tredje er det viktig å overvåke resultatene av immunseffitering fra ubehandlede prøver, der bare CD95 skal observeres. Påvisning av FADD, c-FLIP eller procaspase-8 i disse prøvene indikerer vanligvis tilstedeværelsen av noen mangler i immunoprecipitation-protokollen eller vasketrinnene. Dette kan føre til antagelser om stimuleringsuavhengig assosiasjon av FADD eller c-FLIP med CD95, som kanskje ikke er helt korrekte, og i stedet indikerer feil i immunoprecipitation. For det fjerde, for hver immunoprecipitation, må inngangene eller lysatene analyseres nøye parallelt for å måle uttrykket og posttranslasjonsendringene til kjerneproteinene analysert ved immunsiplinering.
For det femte tillater tidsavhengig analyse at endringer i komplekset kan følges over tid og gir nok en viktig bekreftelse på spesifisiteten til proteinene som rekrutteres til komplekset. I denne forbindelse er et viktig problem at hver cellelinje har et annet nivå av CD95-uttrykk og intracellulære komponenter i dette komplekset. Følgelig må den nøyaktige timingen av CD95 DISC-formasjonen være nøye etablert for hver bestemt celletype. Til slutt er det avgjørende problemet for analysen av DISC-dynamikken sammenligningen av mengden protein i hver immunoprecipitation. For CD95 DISC-immunoprecipitations utført ved hjelp av anti-APO-1 antistoffer, er mengden CD95 et nøkkelmål på like mye av kompleksene som sammenlignes. Dette kan være vanskelig fordi intensiteten til CD95-signalet i immunoprecipitations er relativt høy. Imidlertid må man finne det optimale tidsintervallet for å måle det tilsvarende vestlige blolotsignalet. Et annet hinder er at CD95 er et svært glykosylert protein, som også bidrar til vanskelighetene ved deteksjon i immunoprecipitation på grunn av tilstedeværelsen av et bestemt mønster av flere 'uskarpe' bånd28.
DISC-immunoprecipitation analyse gir et optimalt grunnlag for å oppdage caspase aktivering og behandling. Faktisk tillater immunoprecipitation kombinert med vestlig blotting kvantitativ deteksjon av spaltingsprodukter av procaspase-8a/b: p43/p41, p30 og p18, som vist i denne studien (Figur 4, Figur 5og Figur 6). Dette gjør det igjen mulig for eksperimentere å følge endringer i procaspase-8a / b-behandling over tid og skille forskjellige spaltingstrinn av procaspase-8. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å beskrive caspase-8-aktivering i matematiske modeller og skille mellom inter- og intramolekylær procaspase-8-behandling ved DISC7,20,29. Videre har måling av caspase-8 spaltingsprodukter ved vestlig blotting klare fordeler sammenlignet med de konvensjonelle caspase-8 aktivitetsanalysene basert på IETD-substrat. I sistnevnte tilfelle er det godt fastslått at IETD også fungerer som et substrat for de andre caspasene. Derfor er det økende bevis på at påvisning av IETD-aktivitet indikerer en generell økning av caspaseaktivitet i cellen. I motsetning kan bruk av vestlig blotanalyse bidra til å spesifikt tildele de tilsvarende båndene i den vestlige blotten til caspase-8, slik at forskeren kan være trygg på at caspase-8 aktiveres i dette komplekset. Videre, som nevnt ovenfor, er måling av caspase-8-prosessering ved DISC et utmerket verktøy for matematisk modellering og systembiologistudier. Samlet presenteres en klassisk arbeidsflyt for å tillate overvåking av forskjellige trinn i procaspase-8 aktivering og behandling, noe som er viktig for å løse opp de molekylære mekanismene for celledød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansiert av EU-programmet ERDF (European Regional Development Fund) og DFG (LA 2386) for å støtte vårt arbeid. Vi takker Karina Guttek for at han støttet eksperimentene våre. Vi anerkjenner prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) for å gi oss primære T-celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
