Summary
Her præsenteres en eksperimentel arbejdsgang, der muliggør påvisning af caspase-8-behandling direkte ved det dødsfremkaldende signalkompleks (DISC) og bestemmer sammensætningen af dette kompleks. Denne metode har brede anvendelser, fra optrævling af de molekylære mekanismer i celledødsveje til dynamisk modellering af apoptosenetværk.
Abstract
Ekstrinsisk apoptose medieres ved aktivering af dødsreceptorer (DRs) såsom CD95/Fas/APO-1 eller tumornekrosefaktorrelateret apoptosefremkaldende ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering af disse receptorer med deres cognate ligands fører til samlingen af det dødsfremkaldende signalkompleks (DISC). DISC består af DR, adapterproteinet Fas-associeret protein med dødsdomæne (FADD), prokapaser-8/-10 og cellulær FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konvertering af enzymhæmningstrumende proteiner (c-FLIPs). DISC fungerer som en platform for procaspase-8 behandling og aktivering. Sidstnævnte sker via sin dimerization /oligomerisering i død effector domæne (DED) filamenter samlet på DISC.
Aktivering af procaspase-8 efterfølges af dens behandling, som forekommer i flere trin. I dette arbejde beskrives en etableret eksperimentel arbejdsgang, der gør det muligt at måle DISC-dannelse og behandling af procaspase-8 i dette kompleks. Arbejdsgangen er baseret på immunprecipitation teknikker understøttes af vestlige blot analyse. Denne arbejdsgang giver mulighed for omhyggelig overvågning af forskellige trin i procaspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling og er yderst relevant for at undersøge molekylære mekanismer af extrinsisk apoptose.
Introduction
En af de bedst studerede død receptorer (DRs) er CD95 (Fas, APO-1). Den ydre apoptotiske vej starter med DR's interaktion med dens cognate ligand, dvs. CD95L interagerer med CD95 eller TRAIL binder sig til TRAIL-Rs. Dette resulterer i dannelsen af DISC på den tilsvarende DR. DISC består af CD95, FADD, procaspase-8/-10, og c-FLIP proteiner1,2. Desuden samles DISC'en ved interaktioner mellem dødsdomæne (DD)-holdige proteiner, såsom CD95 og FADD, og DED-holdige proteiner som FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP (Figur 1). Procaspase-8 gennemgår oligomerisering via sammenslutningen af sine DED'er, hvilket resulterer i dannelsen af DED filamenter, efterfulgt af procaspase-8 aktivering og behandling. Dette udløser en caspase kaskade, som fører til celledød (Figur 1)3,4. Procaspase-8 er således en central initiator caspase af den ydre apoptosevej, der er medieret af CD95 eller TRAIL-R'erne, aktiveret på den tilsvarende makromoekylær platform, DISC.
To isoforme procaspase-8, nemlig procaspase-8a (p55) og -8b (p53), er kendt for at blive rekrutteret til DISC5. Begge isoformer består af to DED'er. DED1 og DED2 er placeret på N-terminal del af procaspase-8a/b efterfulgt af katalytiske p18 og p10 domæner. Detaljeret kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) analyse af procaspase-8 DEDs afslørede samlingen af procaspase-8 proteiner i filamentøse strukturer kaldet DED filamenter4,6. Bemærkelsesværdigt, den lineære procaspase-8 kæder blev oprindeligt foreslået at være involveret i dimerization efterfulgt af procaspase-8 aktivering på DISC. Nu er det kendt, at disse kæder kun er en understruktur af procaspase-8 DED glødetråd, sidstnævnte bestående af tre kæder samlet i en tredobbelt helix3,4,6,7.
Ved dimerisering ved DED-glødetråden fører kropslige ændringer i procaspase-8a/b til dannelsen af det aktive center for procaspase-8 og dets aktivering3,8. Dette efterfølges af procaspase-8 behandling, som medieres via to veje: den første går via generering af et p43/p41 kavalergangsprodukt og det andet via den første generation af et p30 kavalergangsprodukt. P43/p41-stien indledes ved kavalergang af procaspase-8a/b ved Asp374, hvilket resulterer i p43/p41 og p12 kavalergangsprodukter (figur 2). Desuden er disse fragmenter automatisk katalytisk kløvet ved Asp384 og Asp210/216, hvilket giver anledning til dannelsen af den aktive caspase-8 heterotetramer, p102/ p1829,10,11. Derudover blev det påvist, at procaspase-8a/b parallelt med p43/p41-forarbejdningsvejen også spaltes ved Asp216, hvilket fører til dannelsen af C-terminal kavalergangsproduktet p30, efterfulgt af dets proteolyse til p10 og p1810 (figur 2).
Procaspase-8a/b aktivering ved DED glødetråd er strengt reguleret af proteiner ved navn c-FLIPs12. C-FLIP-proteinerne forekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS)og c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle tre isoformer indeholder to DED'er i deres N-terminal-område. c-FLIPL har også en C-terminal katalytisk inaktiv caspase-lignende domæne12,13. Både korte isoforme af c-FLIP-c-FLIPS og c-FLIPR-virker på en anti-apoptotisk måde ved at forstyrre DED glødetråd dannelse på DISC6,14,15. Derudover kan c-FLIPL regulere caspase-8 aktivering på en koncentrationsafhængig måde. Dette kan resultere i både pro- og antiapptotiske virkninger16,17,18. Ved at danne den katalytisk aktive procaspase-8/c-FLIPL heterodimer fører c-FLIPL til stabilisering af det aktive centrum af procaspase-8 og dets aktivering. C-FLIPL's pro- eller antiapptotiske funktion afhænger direkte af dens mængde ved DED-filamenter og den efterfølgende mængde samlede procaspase-8/c-FLIP L-heterodimers 19. Lave eller mellemliggende koncentrationer af c-FLIPL ved DISC resulterer i tilstrækkelige mængder procaspase-8/c-FLIP L-heterodimerer ved DED-glødetråden, som understøtter aktiveringen af caspase-8. I modsætning hertil fører øgede mængder c-FLIPL direkte til dets antiapptotiske virkninger på DISC20.
Samlet set er aktivering og behandling af procaspase-8a/b på DISC en stærkt reguleret proces, der involverer flere trin. Dette papir diskuterer måling af procaspase-8 behandling direkte på DISC samt analysen af sammensætningen af dette kompleks. Dette vil blive præsenteret ved hjælp af CD95 DISC som det eksemplariske DR-kompleks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
T celle eksperimenter blev udført i henhold til den etiske aftale 42502-2-1273 Uni MD.
1. Forberedelse af celler til eksperimentet
BEMÆRK: Det gennemsnitlige antal celler til denne immunprecipitation er 1 × 107. Klæbende celler skal sås en dag før eksperimentet, så der er 1 × 107 celler på dagen for eksperimentet.
- Forberedelse af klæbeceller til eksperimentet
- Frø 5-8 × 106 klæbende celler i 20 mL medium (se materialetabellen for sammensætningen) for hver betingelse i 14,5 cm retter en dag før eksperimentet starter.
- På dagen for eksperimentet skal du sikre dig, at cellerne er 80-90% sammenløb og klæbende til skålen. Kassér mediet og tilsæt frisk medium til klæbende celler.
- Forberedelse af affjedringsceller til eksperimentet
- Placer forsigtigt 1 × 107 suspensionsceller i 10 gtL kulturmedium (se materialetabellen for sammensætningen) pr. betingelse i 14,5 cm retter umiddelbart før forsøget starter.
- Hvis du bruger primære celler, isoleres primære T-celler i henhold til den tidligere beskrevne procedure21. Primær T-celler behandles med 1 μg/mL phytohemagglutinin i 24 timer efterfulgt af 25 U/mL IL2-behandling i 6 dage.
- Placer forsigtigt 1 × 108 primære T-celler i 10 mL kulturmedium (se materialetabellen for sammensætningen) pr. tilstand i 14,5 cm retter umiddelbart før forsøget starter.
BEMÆRK: Dette højere antal primære T-celler anbefales, da disse celler er mindre.
2. CD95L stimulation
- Stimulere cellerne med CD95L (produceret som beskrevet tidligere20 eller kommercielt tilgængelige (se materialetabellen)).
BEMÆRK: Koncentrationen af CD95L og stimuleringstidspunktet ercelleafhængige 13,15,22,23,24,25. Forbered en stimulationstilstand to gange for at generere en 'perlekontrol' prøve parallelt.- Stimulere klæbende celler med den valgte koncentration af CD95L. Hold pladen i en vinkel og rør liganden ind i mediet uden at røre ved klæbende celler.
- Stimulere suspension celler med CD95L ved pipetter ligand opløsning i celle suspension.
3. Cellehøst og lysis
- Læg celleskålene på is.
BEMÆRK: Kassér ikke mediet. Døende celler flyder i mediet og er vigtige for analysen. - Tilsæt 10 mL kold fosfat-buffered saltvand (PBS) til celle suspension og skrabe de vedhæftede celler fra pladen. Indsaml celleaffjedringen i et 50 ML rør.
- Vask celleskålen med 10 mL kold PBS to gange, og læg vaskeopløsningen i det samme 50 mL rør. Centrifuge celleaffjedringen ved 500 × g i 5 min, 4 °C.
- Kassér supernatanten, og brug cellepillen igen med 1 mL kold PBS. Celleaffjedringen overføres til et 1,5 ML rør.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 500 × g i 5 min, 4 °C. Kassér supernatanten, og brug cellepillen igen med 1 mL kold PBS.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 500 × g i 5 min, 4 °C. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen med 1 mL lysisbuffer (indeholdende 4% proteasehæmmercocktail). Inkuber det i 30 minutter på is.
- Centrifuge lysatet ved maksimal hastighed (~17.000 × g)i 15 min, 4 °C.
- Overfør supernatanten (lysatet) til et rent rør. Kassér pellet. Tag 50 μL af lysatet i et andet rør. Analyser proteinkoncentrationen ved Bradford-analysen og tag mængden af lysat svarende til 25 μg protein i et hætteglas. Føj indlæsningsbufferen (se materialetabellen for sammensætningen) til hætteglasset. Opbevar den ved -20 °C som lysatstyring.
4. Immunprecipitation (IP)
- Der tilsættes 2 μL anti-APO-1 antistoffer og 10 μL protein En sepharoseperler (fremstillet som anbefalet af producenten) til lysatet. Der tilsættes kun 10 μL af perlerne til et separat rør, der indeholder lysat (stimuleret prøve) for at generere en 'perlekontrol'.
BEMÆRK: Brug pipetspidser med brede åbninger enten ved at skære spidserne eller købe specielle tips til IP, mens du håndterer proteinet En sepharoseperler. - Inkuberes blandingen af lysat med antistoffer/protein En sepharoseperler med skånsom blanding natten over ved 4 °C. Centrifuge lysaterne med antistoffer/protein En sepharoseperler ved 500 × g i 4 min, 4 °C. Kassér supernatanten, tilsæt 1 mL kold PBS til perlerne, og gentag dette trin mindst tre gange.
- Kassér supernatanten. Aspirere perlerne helst med en 50 μL Hamilton sprøjte.
5. Vestlige blot
- Der tilsættes 20 μL 4x belastningsbuffer (se materialetabellen for sammensætningen) til perlerne og varmen ved 95 °C i 10 min. Lysatkontrollerne opvarmes ved 95 °C i 5 min.
- Læg lysaterne, IPs og en proteinstandard på en 12,5% natrium dodecyl sulfat (SDS) gel (se materialetabellen til gelpræparatet) og kør med en konstant spænding på 80 V.
- Overfør proteinerne fra SDS gel til en nitrocellulose membran.
BEMÆRK: Her blev halvtørreteknikken, der var optimeret til interesseproteiner, brugt til overførsel over 12 min (25 V; 2,5 A= konstant). Blød nitrocellulosemembranen og to mini-størrelse overførselsstakke i elektroforesebuffer (se materialetabellen til sammensætningen, forbered i henhold til producentens anvisninger) i et par minutter før vestlig blotting. - Placer den blottede membran i en kasse og bloker den i 1 time i blokeringsopløsning (0,1% Tween-20 i PBS (PBST) + 5% mælk). Inkuber membranen med blokeringsopløsningen under blid omrøring.
- Vask membranen tre gange med PBST i 5 min hver vask.
6. Western blot afsløring
- Tilsæt det første primære antistof ved den angivne fortynding (se materialetabellen) til membranen, og inkuber det natten over ved 4 °C med skånsom omrøring.
- Vask membranen tre gange med PBST i 5 min hver vask.
- Inkuberes membranen med 20 mL sekundært antistof (fortyndet 1:10.000 i PBST + 5% mælk) med skånsom rystelser i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask membranen tre gange med PBST i 5 min hver vask.
- Kassér PBST og tilsæt ca. 1 mL peberrod peroxidasesubstrat til membranen.
- Detekter kemoluminescerende signal (se materialetabellen).
BEMÆRK: Eksponeringstiden og antallet af optagne billeder afhænger af mængden af protein i cellen og specificiteten af de anvendte antistoffer. Det skal etableres empirisk for hvert antistof, der anvendes til påvisning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at analysere caspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling på CD95 DISC, dette papir beskriver en klassisk arbejdsgang, som kombinerer IP af CD95 DISC med western blot analyse. Dette gør det muligt at påeskrive flere nøglefunktioner i caspase-8-aktivering på DISC: samling af caspase-8-aktiverende makromolekylær platform, rekruttering af procaspase-8 til DISC og behandling af denne initiator caspase (figur 1 og figur 2). Denne arbejdsgang omfatter behandling af følsomme celler med CD95L på en tidsafhængig måde, efterfulgt af deres lysis, immunprecipitation ved hjælp af anti-CD95 (anti-APO-1) antistoffer, og efterfølgende western blot analyse (Figur 3).
Livmoderhalskræft HeLa-CD95 celler blev brugt som et eksempel til at analysere DISC dannelse26. Stimulering af disse celler med CD95L resulterede i et højt niveau af CD95 DISC-dannelse, der overvåges via CD95-immunprecipitation (Figur 4). CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPs blev observeret i disse CD95-immunprecipitationer, hvilket indikerer effektiv DISC-dannelse. Det er vigtigt, at kavalergangsprodukterne af procaspase-8a/b: p43/p41, p30 og p18 blev opdaget på DISC, hvilket indikerer aktivering af procaspase-8 og den efterfølgende forarbejdning. Især blev kavalergangsprodukterne af procaspase-8 p43/p41 og p18 påvist, hvilket indikerer de to ovennævnte trin i p43-forarbejdningsvejen. Derudover blev p30-produktet opdaget, hvilket indikerer den alternative vej til caspase-8-forarbejdning. Desuden efterfølges aktivering af procaspase-8 på DISC af kavalergangen af dens substrater såsom c-FLIP proteiner.
Kavalergangsprodukterne af c-FLIP-p43-FLIP og p22-FLIP-blev påvist i immunpræcipitationerne, hvilket indikerer caspase-8 aktivering (Figur 4). Det er vigtigt, at hverken FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPs eller deres kavalergangsprodukter blev påvist i immunprecipitationsprøverne fra ubehandlede celler, hvilket understreger specificiteten af DISC-immunprecipitation (Figur 4). Der kan indhentes vigtige oplysninger fra disse forsøg ved at kvantificere de bånd, der svarer til de forskellige kavalergangsprodukter af procaspase-8 (figur 4). Disse oplysninger kan bruges i den matematiske modellering af apoptose netværk og giver kvantitativ indsigt i pathway regulering.
Niveauet for caspase-8 aktivering på DISC er moduleret af c-FLIPs. HeLa-CD95-celler, der overekspresserer c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15, blev derfor valgt som det andet eksempel (Figur 5). Virkningerne af c-FLIPL isoformen i disse forsøg kunne observeres, hvilket resulterede i en anden procaspase-8a/b-behandling til p43/p41 på DISC sammenlignet med den tilsvarende proteolyse af procaspase-8 på DISC i forældrenes HeLa-CD95-celler, som beskrevet af Hillert et al. 15. Svarende til observationerne i figur 4blev der ikke påvist rekruttering af FADD, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP-proteiner og deres kavalergangsprodukter i immunpræcitationerne fra HeLa-CD95-FL-celler uden CD95L-behandling, som understøtter specificiteten af disse immunprecipitationer. Mere dokumentation for immunoprecipitationernes specificitet er fraværet af rekruttering af procaspase-3 og poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP1) til DISC, som blev observeret i de CD95L-behandlede immunprecipitationer (figur 5). Disse proteiner er ikke en del af komplekset, og deres fravær i immunprecipitationssignalerne kan tjene som bevis for fraværet af uspecifik binding af rigelige cellulære proteiner.
Endelig blev immunprecipitationer af CD95 DISC fra suspensionsceller udført som et tredje eksempel, f.eks. Disse celler er også karakteriseret ved høje niveauer af CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10, og c-FLIPs, der blev observeret i anti-CD95-immunprecipitationer sammen med deres kavalergang produkter (Figur 6). Påvisning af procaspase-8 kavalergangsprodukter i immunprecipitationerne indikerer aktivering og behandling af denne initiator caspase i DISC-immunprecipitationen fra primære T-celler. Disse eksperimenter indikerer, at DISC kan immunpreciperes fra mange klæbende og suspension celler, og at caspase-8 behandling og aktivering kan valideres ved western blot analyse.
Figur 1: Skematisk præsentation af CD95-signalvejen. CD95L udløser DISC-assemblyen. DISC består af CD95, FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP. FADD binder sig til CD95 via sin DD, mens procaspase-8, procaspase-10, og c-FLIPs interagere via deres DED'er, der danner DED filamenter. Dannelse af DED filamenter fungerer som en platform for procaspase-8 dimerization, behandling og efterfølgende aktivering. Den aktive caspase-8 heterotetramer, p182/p102, aktiverer caspase-3 ved kavalergang, hvilket fører til apoptose. Forkortelser: CD = klynge af differentiering; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsfremkaldende signalkompleks; DD = dødsdomæne; FADD= Fas-associeret dødsdomæne; c-FLIP = cellulær FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konvertering af enzymhæmning protein; DED = død effektor domæne; c-FLIPL = c-FLIPLang. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Procaspase-8 behandling på DISC. To måder at procaspase-8a/b behandling på DISC er vist. Den første måde involverer p43/p41 generation efterfulgt af p18 dannelse. Den anden måde indebærer p30 generation efterfulgt af dens behandling til p18 og p10. Resterne er nummereret i henhold til rækkefølgen af procaspase-8a. Forkortelser: DED = death effector domæne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skematisk præsentation af den eksperimentelle opsætning af DISC-IP. Celler stimuleres med CD95L. Efter stimulering høstes og opsamles cellerne efterfulgt af forskellige vasketrin. Cellerne lyser derefter, og lysaterne indsamles. Efterfølgende blev protein A-sepharose perler og anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer tilsat til lysatet og inkuberet natten over. Efter flere vasketrin blev immunprecipitationerne analyseret ved vestlig blotting. Forkortelser: DISC = dødsfremkaldende signalkompleks; IP = immunprecipitation; CD95L = CD95 ligand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: CD95 DISC-formation i HeLa-CD95-celler. HeLa-CD95-celler blev stimuleret med 125 ng/mL CD95L i 30 min eller 1 time. CD95 DISC-IPs blev udført ved hjælp af anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer. Sammensætningen af IPs blev undersøgt ved western blot analyse ved hjælp af antistofferne for de angivne proteiner. Actin blev brugt som lastekontrol. Der vises input. Kvantificering af procaspase-8 kavalergangsprodukter på DISC er vist og normaliseret til CD95 signal. Forkortelser: l.e. = lang eksponering; s.e. = kort eksponering BC = kontrol IP med 'perler-only', uden tilsætning af antistoffer; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsfremkaldende signalkompleks; IP = immunprecipitation; FADD = Fas-associeret dødsdomæne; c-FLIP = cellulær FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konvertering af enzymhæmning protein; c-FLIPL = c-FLIPLong; c-FLIPS = c-FLIPShort; M = molekylvægt i kiloDalton (kDa). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: CD95 DISC-formation i c-FLIPL-overekspressing heLa-CD95-celler. HeLa-CD95-FL-celler blev stimuleret med 250 ng/mL CD95L for de angivne tidspunkter (1-3 timer). CD95 DISC-IPs blev udført ved hjælp af anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer. Sammensætningen af IPs blev undersøgt ved western blot analyse og analyseret for de angivne proteiner. Actin blev brugt som lastekontrol. Der vises input. Kvantificering af procaspase-8 kavalergangsprodukter på DISC'en vises og normaliseres til CD95-signalet. Et repræsentativt eksperiment ud af to er vist. Forkortelser: l.e. = lang eksponering; s.e. = kort eksponering BC = kontrol IP med 'perler-only', uden tilsætning af antistoffer; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsfremkaldende signalkompleks; IP = immunprecipitation; FADD = Fas-associeret dødsdomæne; c-FLIP = cellulær FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konvertering af enzymhæmning protein; c-FLIPL = c-FLIPLong; PARP1 = poly(ADP-ribose)polymerase 1; M = molekylvægt i kiloDalton (kDa). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: CD95 DISC-dannelse i primære T-celler. Primære aktiverede T-celler blev stimuleret med 500 ng/mL CD95L i 15 min. og 30 min. CD95 DISC-IPs blev udført ved hjælp af anti-APO-1 (anti-CD95) antistoffer. Sammensætningen af IPs blev undersøgt ved western blot analyse og analyseret for de angivne proteiner. Actin blev brugt som lastekontrol. Kvantificering af procaspase-8 kavalergangsprodukter på DISC'en vises og normaliseres til CD95-signalet. Der vises input. Forkortelser: l.e. = lang eksponering; s.e. = kort eksponering; CD95L = CD95 ligand; DISC = dødsfremkaldende signalkompleks; IP = immunprecipitation; FADD = Fas-associeret dødsdomæne; c-FLIP = cellulær FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konvertering af enzymhæmning protein; c-FLIPL = c-FLIPLong; M = molekylvægt i kiloDalton (kDa). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne fremgangsmåde blev først beskrevet af Kischkel et al.27 og er med succes blevet udviklet siden da af flere grupper. Flere vigtige spørgsmål skal overvejes for effektiv DISC-immunprecipitation og overvågning caspase-8 behandling i dette kompleks.
For det første er det vigtigt at følge alle vasketrin under immunprecipitation. Særligt vigtigt er de sidste vasketrin af sepharose perler og tørring af sepharose perler. Dette skal gøres korrekt for at øge signal/støj-forholdet mellem immunprecipitation, hvilket gør det muligt at påeskrive caspase-8-rekruttering og -behandling på DISC. Det er vigtigt, at et "præclearing-trin" for meget følsomme analytiske teknikker, såsom massespektrometri, også kan være vigtigt for at reducere støjen. Flere undersøgelser har imidlertid vist , at dette præclearing-trin ikke er afgørende for påvisning af caspase-8-rekruttering til DISC ved vestlig blotting7,23. Men som nævnt er vask af perlerne i slutningen af immunprecipitation afgørende for at opnå pålidelige resultater. Uspecifik binding af rigelige cellulære proteiner til sepharose perler kan hovedsagelig mindske de specifikke signaler af kernen DISC komponenter. Som en vigtig kontrol for fraværet af den uspecifikke binding, western blot analyse af proteinerne, rapporteret ikke at være til stede på DISC, kan udføres. Et eksempel på denne analyse er givet i figur 5, hvor rekrutteringen af PARP1 og caspase-3 til DISC-immunprecipitationen ikke blev observeret. Dette indikerer specificiteten af den særlige immunprecipitation og tilstrækkelig vask af sepharoseperlerne under forsøget.
For det andet er det afgørende at udføre negative kontroller såsom en kontrol, der kun består af perler, eller en immunprecipitationskontrol med et antistof med samme isotype som det antistof, der anvendes til immunprecipitationen. For anti-APO-1 antistoffer kan antimus-IgG3 antistoffer bruges som en isotype kontrol. For det tredje er det vigtigt at overvåge resultaterne af immunprecipitationen fra ubehandlede prøver, hvor kun CD95 skal observeres. Påvisning af FADD, c-FLIP eller procaspase-8 i disse prøver indikerer typisk tilstedeværelsen af nogle mangler i immunprecipitationsprotokollen eller vasketrinene. Dette kan give anledning til antagelser om stimulering-uafhængig sammenslutning af FADD eller c-FLIP med CD95, som måske ikke er helt korrekt, og i stedet indikerer fejl i immunprecipitation. For det fjerde skal input eller lysater for hver immunprecipitation omhyggeligt analyseres parallelt med måling af ekspression og posttranslationelle modifikationer af de kerneproteiner, der analyseres ved immunprecipitation.
For det femte gør tidsafhængig analyse det muligt at følge ændringer i komplekset over tid og giver endnu en vigtig bekræftelse på specificiteten af de proteiner, der rekrutteres til komplekset. I denne henseende er et vigtigt spørgsmål, at hver cellelinje har et andet niveau af CD95-udtryk og af intracellulære komponenter i dette kompleks. Derfor skal den nøjagtige timing af CD95 DISC-formationen omhyggeligt fastlægges for hver bestemt celletype. Endelig er det afgørende spørgsmål for analysen af DISC-dynamikken sammenligningen af mængden af protein i hver immunprecipitation. For CD95 DISC-immunprecipitationer, der udføres ved hjælp af anti-APO-1 antistoffer, er mængden af CD95 et vigtigt mål for den samme mængde af de komplekser, der sammenlignes. Dette kan være vanskeligt, fordi intensiteten af CD95-signalet i immunpræcitationerne er relativt høj. Man skal dog finde det optimale tidsinterval til måling af det tilsvarende vestlige blot-signal. En anden hindring er, at CD95 er et meget glycosyleret protein, som også bidrager til vanskelighederne med dets påvisning i immunprecipitation på grund af tilstedeværelsen af et bestemt mønster af flere 'slørede' bånd28.
DISC-immunprækningsanalyse giver et optimalt grundlag for at opdage caspaseaktivering og -behandling. Immunprecipitation kombineret med vestlig blotting giver mulighed for kvantitativ påvisning af kavalergangsprodukter af procaspase-8a/b: p43/p41, p30 og p18, som vist i denne undersøgelse (Figur 4, Figur 5og Figur 6). Dette gør det igen muligt for forsøgspersonerne at følge ændringer i procaspase-8a/b-behandling over tid og skelne mellem forskellige kavalergangstrin i procaspase-8. Denne fremgangsmåde er med succes blevet brugt til at beskrive caspase-8 aktivering i matematiske modeller og skelne mellem inter- og intramolekylær procaspase-8 behandling på DISC7,20,29. Desuden har måling af caspase-8 kavalergangsprodukter ved vestlig blotting klare fordele i forhold til de konventionelle caspase-8 aktivitetsanalyser baseret på IETD-substrat. I sidstnævnte tilfælde er det veletableret, at IETD også fungerer som substrat for de andre caspaser. Derfor er der stigende beviser for, at påvisning af IETD-aktivitet indikerer en generel stigning i caspase aktivitet i cellen. I modsætning hertil kan ved hjælp af western blot analyse hjælpe specifikt tildele de tilsvarende bånd i den vestlige blot til caspase-8, så forskeren at være sikker på, at caspase-8 er aktiveret i dette kompleks. Desuden, som nævnt ovenfor, måling caspase-8 behandling på DISC præsenterer et glimrende værktøj til matematisk modellering og systemer biologi undersøgelser. Samlet set præsenteres en klassisk arbejdsgang for at muliggøre overvågning af forskellige trin i procaspase-8 aktivering og behandling, hvilket er afgørende for optrævlingen af celledødens molekylære mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansieret af EU-programmet EFRU (Den Europæiske Fond for Regionaludvikling) og DFG (LA 2386) for at støtte vores arbejde. Vi takker Karina Guttek for at støtte vores eksperimenter. Vi anerkender Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) for at give os primære T-celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
