Summary
Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.
Abstract
A apoptose extrínseca é mediada pela ativação de receptores de morte (DRs) como CD95/Fas/APO-1 ou ligante indutor de fator de necrose tumoral (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). A estimulação desses receptores com seus ligantes cognatos leva à montagem do complexo de sinalização indutor da morte (DISC). O DISCO compreende dr, a proteína adaptadora Fas com domínio de morte (FADD), procaspases-8/-10, e interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteínas inibitórias de enzimas (c-FLIPs). O DISCO serve como uma plataforma para processamento e ativação procaspase-8. Este último ocorre por meio de sua dimerização/oligomerização nos filamentos de domínio de efeito de morte (DED) montados no DISC.
A ativação do procaspase-8 é seguida pelo seu processamento, que ocorre em várias etapas. Neste trabalho, descreve-se um fluxo de trabalho experimental estabelecido que permite a medição da formação de DISC e o processamento do procaspase-8 neste complexo. O fluxo de trabalho é baseado em técnicas de imunoprecipitação apoiadas pela análise de manchas ocidentais. Este fluxo de trabalho permite um monitoramento cuidadoso de diferentes etapas do recrutamento procaspase-8 para o DISCO e seu processamento e é altamente relevante para investigar mecanismos moleculares de apoptose extrínseca.
Introduction
Um dos receptores de morte (DRs) mais bem estudados é o CD95 (Fas, APO-1). A via poptótica extrínseca começa com a interação do DR com seu ligante cognato, ou seja, o CD95L interage com cd95 ou trail liga-Rs. Isso resulta na formação do DISCO no DR. DISC correspondente composto por CD95, FADD, procaspase-8/-10 e proteínas c-FLIP1,2. Além disso, o DISCO é montado por interações entre proteínas contendo domínio de morte (DD), como CD95 e FADD, e proteínas contendo DED, como FADD, procaspase-8/-10 e c-FLIP(Figura 1). O Procaspase-8 passa por oligomerização via associação de seus DEDs, resultando na formação de filamentos de DED, seguido pela ativação e processamento do Procaspase-8. Isso desencadeia uma cascata de caspase, que leva à morte celular(Figura 1)3,4. Assim, o procaspase-8 é um caspase iniciador central da via de apoptose extrínseca mediada por CD95 ou trail-Rs, ativada na plataforma macromolecular correspondente, DISC.
Dois isóformes de procaspase-8, ou seja, procaspase-8a (p55) e -8b (p53), são conhecidos por serem recrutados para o DISC5. Ambas as isoformas compreendem dois DEDs. DED1 e DED2 estão localizados na parte n-terminal do procaspase-8a/b seguido pelos domínios catalíticos p18 e p10. A análise detalhada da microscopia crio-elétron (crio-EM) dos DEDs procaspase-8 revelou a montagem de proteínas procaspase-8 em estruturas filamentos filamentos de ded chamados filamentos DED4,6. Notavelmente, as cadeias lineares procaspase-8 foram inicialmente sugeridas para serem engajadas na dimerização seguida pela ativação procaspase-8 no DISC. Agora, sabe-se que essas cadeias são apenas uma subestrutura do filamento procaspase-8 DED, este último compreendendo três cadeias montadas em uma tríplice hélice3,4,6,7.
Após a dimerização no filamento de DED, alterações conformais no procaspase-8a/b levam à formação do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação3,8. Isso é seguido pelo processamento procaspase-8, que é mediado por duas vias: a primeira passa pela geração de um produto de decote p43/p41 e a segunda através da geração inicial de um produto de decote p30. A via p43/p41 é iniciada pelo decote de procaspase-8a/b em Asp374, resultando em produtos de decote p43/p41 e p12(Figura 2). Além disso, esses fragmentos são auto-catalicamente cortados em Asp384 e Asp210/216, dando origem à formação do heterotetramer caspase ativo-8, p102/p1829,10,11. Além disso, mostrou-se que paralelamente à via p43/p41 de processamento, o procaspase-8a/b também é cortado em Asp216, o que leva à formação do produto de decote terminal C p30, seguido por sua proteólise para p10 e p1810 (Figura 2).
A ativação procaspase-8a/b no filamento DED é estritamente regulada por proteínas chamadas c-FLIPs12. As proteínas c-FLIP ocorrem em três isoformas: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)e c-FLIPRaji (c-FLIPR). Todos os três isoforms contêm dois DEDs em sua região n-terminal. c-FLIPL também possui um terminal C catalyticamente inativo como o domínio caspase12,13. Ambos os isoformes curtos de c-FLIP-c-FLIPS e c-FLIPR-ajam de forma anti-apoptótica interrompendo a formação de filamento de DED no DISC6,14,15. Além disso, o C-FLIPL pode regular a ativação caspase-8 de forma dependente da concentração. Isso pode resultar em efeitos pró e anti-apoptóticos16,17,18. Ao formar o catalisticamente ativo procaspase-8/c-FLIPL heterodimer, c-FLIPL leva à estabilização do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação. A função pró ou anti-apoptótica do c-FLIPL depende diretamente de sua quantidade nos filamentos de DED e da quantidade subsequente de heterímeros procaspase-8/c-FLIPL 19. Concentrações baixas ou intermediárias de c-FLIPL no DISCO resultam em quantidades suficientes de heterodimers procaspase-8/c-FLIPL no filamento DED, que suporta a ativação de caspase-8. Em contraste, o aumento das quantidades de c-FLIPL levam diretamente aos seus efeitos anti-apoptóticos no DISC20.
Em conjunto, a ativação e processamento do procaspase-8a/b no DISCO é um processo altamente regulamentado envolvendo várias etapas. Este artigo discute a medição do processamento procaspase-8 diretamente no DISCO, bem como a análise da composição deste complexo. Este será apresentado utilizando o CD95 DISC como o complexo dr exemplar.
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Protocol
Os experimentos com células T foram realizados de acordo com o acordo ético 42502-2-1273 Uni MD.
1. Preparando células para o experimento
NOTA: O número médio de células para esta imunoprecipitação é de 1 × 107. Células aderentes devem ser semeadas um dia antes do experimento para que haja 1 × 107 células no dia do experimento.
- Preparando células aderentes para o experimento
- Semente 5-8 × 106 células aderentes em 20 mL de meio (ver a Tabela de Materiais para a composição) para cada condição em pratos de 14,5 cm um dia antes do início do experimento.
- No dia do experimento, certifique-se de que as células são 80-90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes.
- Preparando células de suspensão para o experimento
- Coloque cuidadosamente 1 × 107 células de suspensão em 10 mL de meio de cultura (ver a Tabela de Materiais para a composição) por condição em pratos de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
- Se usar células primárias, isole as células T primárias de acordo com o procedimento descrito anteriormente21. T tratar células T primárias com fitohemagglutinina de 1 μg/mL por 24 h, seguido por 25 tratamento U/mL IL2 por 6 dias.
- Coloque cuidadosamente 1 × 108 células T primárias em 10 mL de meio de cultura (ver a Tabela de Materiais para a composição) por condição em pratos de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
NOTA: Recomenda-se um maior número de células T primárias, uma vez que essas células são menores.
2. Estimulação CD95L
- Estimule as células com CD95L (produzido como descrito anteriormente20 ou comercialmente disponível (ver a Tabela de Materiais).).
NOTA: A concentração do CD95L e o tempo de estimulação são dependentes do tipo celular13,15,22,23,24,25. Prepare duas vezes uma condição de estimulação para gerar uma amostra de "controle de contas".- Estimule as células aderentes com a concentração selecionada de CD95L. Segure a placa em um ângulo e coloque a ligadura no meio sem tocar nas células aderentes.
- Estimule as células de suspensão com CD95L, canalização da solução de ligadura na suspensão celular.
3. Colheita celular e lise
- Coloque os pratos de celular no gelo.
NOTA: Não descarte o meio. Células moribundas flutuam no meio e são importantes para a análise. - Adicione 10 mL de soro fisiológico a frio (PBS) à suspensão celular e raspe as células anexadas da placa. Colete a suspensão da célula em um tubo de 50 mL.
- Lave o prato da célula com 10 mL de PBS frio duas vezes e coloque a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mL. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C.
- Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular com 1 mL de PBS frio. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular com 1 mL de PBS frio.
- Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C. Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota celular com 1 mL de tampão de lise (contendo 4% de coquetel inibidor de protease). Incuba-lo por 30 minutos no gelo.
- Centrifugar o lysate em velocidade máxima (~17.000 × g) por 15 min, 4 °C.
- Transfira o supernatante (lise) para um tubo limpo. Descarte a pelota. Tome 50 μL do lysate em outro tubo. Analise a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford e tome a quantidade de lise correspondente a 25 μg de proteína em um frasco. Adicione o tampão de carga (consulte a tabela de materiais para a composição) ao frasco. Armazene-o a -20 °C como controle de lise.
4. Imunoprecipitação (IP)
- Adicione 2 μL de anticorpos anti-APO-1 e 10 μL de proteínaS A sepharose (preparada conforme recomendado pelo fabricante) ao liseto. Adicione apenas 10 μL das contas a um tubo separado contendo liseto (amostra estimulada) para gerar um "controle de contas".
NOTA: Use pontas de pipet com orifícios largos, cortando as pontas ou comprando dicas especiais para IP enquanto manuseia as contas de proteína A sepharose. - Incubar a mistura de liseto com anticorpos/proteínaSA contas de sepharose com mistura suave durante a noite a 4 °C. Centrifugar os lises com anticorpos/proteínaS Uma semente de sepharose a 500 × g por 4 min, 4 °C. Descarte o supernatante, adicione 1 mL de PBS frio às contas e repita esta etapa pelo menos três vezes.
- Descarte o supernatante. Aspire as contas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 μL.
5. Mancha ocidental
- Adicione 20 μL de tampão de carga de 4x (consulte a tabela de materiais para a composição) às contas e aqueça a 95 °C por 10 min. Aqueça os controles de lise a 95 °C por 5 min.
- Carregue os lises, IPs e um padrão proteico em um gel de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) de sódio de 12,5% (veja a tabela de materiais para a preparação do gel) e corra com uma tensão constante de 80 V.
- Transfira as proteínas do gel SDS para uma membrana nitrocelulose.
NOTA: Aqui, a técnica semi-seca, otimizada para as proteínas de interesse, foi utilizada para a transferência ao longo de 12 min (25 V; 2,5 A= constante). Mergulhe a membrana de nitrocelulose e duas mini-pilhas de transferência em tampão de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais para a composição, prepare-se de acordo com as instruções do fabricante) por alguns minutos antes da mancha ocidental. - Coloque a membrana manchada em uma caixa e bloqueie-a por 1h na solução de bloqueio (0,1% Tween-20 em PBS (PBST) + 5% de leite). Incubar a membrana com a solução de bloqueio sob agitação suave.
- Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.
6. Detecção de manchas ocidentais
- Adicione o primeiro anticorpo primário na diluição indicada (ver a Tabela de Materiais) à membrana e incuba-o durante a noite a 4 °C com agitação suave.
- Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.
- Incubar a membrana com 20 mL de anticorpo secundário (diluído 1:10.000 em PBST + 5% de leite) com agitação suave por 1h à temperatura ambiente.
- Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.
- Descarte PBST e adicione aproximadamente 1 mL de substrato de peroxidase de rabanete à membrana.
- Detecte o sinal quimioluminescente (ver a Tabela de Materiais).
NOTA: O tempo de exposição e o número de imagens capturadas dependem da quantidade de proteína na célula e da especificidade dos anticorpos utilizados. Deve ser estabelecido empiricamente para cada anticorpo utilizado para a detecção.
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Representative Results
Para analisar o recrutamento caspase-8 para o DISCO e seu processamento no DISCO CD95, este artigo descreve um fluxo de trabalho clássico, que combina IP do CD95 DISC com análise de manchas ocidentais. Isso permite a detecção de várias características-chave da ativação caspase-8 no DISCO: a montagem da plataforma macromolecular ativante caspase-8, o recrutamento do procaspase-8 para o DISCO e o processamento desta caspase iniciadora(Figura 1 e Figura 2). Este fluxo de trabalho envolve o tratamento de células sensíveis com CD95L de forma dependente do tempo, seguido de sua lise, imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-CD95 (anti-APO-1) e análise subsequente de manchas ocidentais(Figura 3).
Câncer cervical As células HeLa-CD95 foram utilizadas como exemplo para analisar a formação de DISC26. A estimulação dessas células com CD95L resultou em um alto nível de formação de DISCO CD95, monitorado via CD95-imunoprecipitação(Figura 4). CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPs foram observados nessas imunoprecipitações CD95-imunoprecipitações, indicando formação eficiente de DISC. É importante ressaltar que os produtos de decote do procaspase-8a/b: p43/p41, p30 e p18 foram detectados no DISCO, o que indica ativação do procaspase-8 e seu processamento subsequente. Em particular, foram detectados os produtos de decote do procaspase-8 p43/p41 e p18, indicando as duas etapas acima mencionadas da via de processamento p43. Além disso, foi detectado o produto p30, indicando a via alternativa do processamento caspase-8. Além disso, a ativação do procaspase-8 no DISCO é seguida pelo decote de seus substratos, como proteínas c-FLIP.
De fato, os produtos de decote de c-FLIP-p43-FLIP e p22-FLIP foram detectados nas imunoprecipitações, indicando ativação do invólucro-8(Figura 4). É importante ressaltar que nem FADD, procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPs, nem seus produtos de decote foram detectados nas amostras de imunoprecipitação de células não tratadas, o que sublinha a especificidade da imunoprecipitação disc(Figura 4). Informações importantes podem ser obtidas a partir desses experimentos quantificando as bandas correspondentes aos diferentes produtos de decote do procaspase-8 (Figura 4). Essas informações podem ser usadas na modelagem matemática das redes de apoptose e fornecem insights quantitativos sobre a regulação da via.
O nível de ativação caspase-8 no DISCO é modulado por c-FLIPs. Assim, as células HeLa-CD95 que superexpressam c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 foram selecionadas como o segundo exemplo(Figura 5). Os efeitos do isoforme c-FLIPL nesses experimentos puderam ser observados, resultando em uma taxa diferente de processamento procaspase-8a/b para p43/p41 no DISCO em comparação com a proteólise correspondente da procaspase-8 no DISCO nas células HeLa-CD95 parentais, como descrito por Hillert et al. 15- Semelhante às observações na Figura 4, não foi detectado o recrutamento de células FADD, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP e seus produtos de decote nas imunoprecipitações das células HeLa-CD95-FL sem tratamento CD95L, que suporta a especificidade dessas imunoprecipitações. Mais evidências para a especificidade das imunoprecipitações é a ausência do recrutamento de procaspase-3 e poli(ADP-ribose)polimerase 1 (PARP1) para o DISCO, o que foi observado nas imunoprecipitações tratadas com CD95L(Figura 5). Essas proteínas não fazem parte do complexo, e sua ausência nos sinais de imunoprecipitação pode servir de prova para a ausência de ligação inespecífica de proteínas celulares abundantes.
Finalmente, as imunoprecipitações do CD95 DISC das células de suspensão foram realizadas como terceiro exemplo, por exemplo, células T primárias ativadas(Figura 6). Essas células também são caracterizadas por altos níveis de CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPs que foram observados em imunoprecipitações anti-CD95, juntamente com seus produtos de decote(Figura 6). A detecção de produtos de decote procaspase-8 nas imunoprecipitações indica a ativação e processamento deste caspase iniciador na imunoprecipitação DISC-das células T primárias. Esses experimentos indicam que o DISCO pode ser imunoprecipitado de muitas células aderentes e suspensas e que o processamento e ativação do caspase-8 podem ser validados pela análise de manchas ocidentais.
Figura 1: Apresentação esquemática da via de sinalização CD95. Cd95L aciona a montagem do DISCO. O DISCO é composto por CD95, FADD, procaspase-8/-10 e c-FLIP. FADD liga-se ao CD95 através de seu DD, enquanto procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPs interagem através de seus DEDs, formando filamentos DED. A formação dos filamentos DED serve como plataforma para dimerização, processamento e ativação subsequente do procaspase-8. O heterotetramer caspase-8 ativo, p182/p102,ativa caspase-3 por decote, o que leva à apoptose. Abreviaturas: CD = cluster de diferenciação; CD95L = Ligadura CD95; DISC = complexo de sinalização indutor de morte; DD = domínio de morte; FADD= Domínio de morte associado à Fas; c-FLIP = interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteína inibidora de enzimas; DED = domínio do efeito morte; c-FLIPL = c-FLIPLong. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processamento procaspase-8 no DISCO. Duas formas de processamento procaspase-8a/b no DISCO são mostradas. A primeira via envolve a geração p43/p41 seguida pela formação p18. A segunda forma envolve a geração P30 seguida de seu processamento para p18 e p10. Os resíduos são numerados de acordo com a sequência de procaspase-8a. Abreviaturas: DED = efeito morte ou domínio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Apresentação esquemática da configuração experimental do DISC-IP. As células são estimuladas com CD95L. Após a estimulação, as células são colhidas e coletadas, seguidas de diferentes passos de lavagem. As células são então liseadas, e os lises são coletados. Posteriormente, as contas de proteína A-sepharose e os anticorpos anti-APO-1 (anti-CD95) foram adicionados ao liseto e incubados durante a noite. Após várias etapas de lavagem, as imunoprecipitações foram analisadas por manchas ocidentais. Abreviaturas: DISC = complexo de sinalização indutor de morte; IP = imunoprecipitação; CD95L = Ligante CD95. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Formação de DISCO CD95 em células HeLa-CD95. As células HeLa-CD95 foram estimuladas com anticorpos CD95L de 125 ng/mL para 30 min ou 1 h. CD95 DISC-IPs foram realizados utilizando anticorpos anti-APO-1 (anti-CD95). A composição dos IPs foi examinada pela análise de manchas ocidentais utilizando os anticorpos para as proteínas indicadas. Actin foi usado como controle de carga. As entradas são mostradas. A quantificação dos produtos de decote procaspase-8 no DISCO é mostrada e normalizada para o sinal CD95. Abreviaturas: l.e. = exposição longa; s.e. = exposição curta; BC = controle IP com 'somente contas', sem a adição de anticorpos; CD95L = Ligadura CD95; DISC = complexo de sinalização indutor de morte; IP = imunoprecipitação; FADD = Domínio de morte associado ao Fas; c-FLIP = interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteína inibidora de enzimas; c-FLIPL = c-FLIPLong; c-FLIPS = c-FLIPCurto; M = peso molecular em kiloDalton (kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Formação de DISCO CD95 em células HeLa-CD95 que superexpressam C-FLIPL. As células HeLa-CD95-FL foram estimuladas com 250 ng/mL CD95L para os pontos de tempo indicados (1-3 h). Os DISC-IPs CD95 foram realizados utilizando anticorpos anti-APO-1 (anti-CD95). A composição dos IPs foi examinada pela análise de manchas ocidentais e analisada para as proteínas indicadas. Actin foi usado como controle de carga. As entradas são mostradas. A quantificação dos produtos de decote procaspase-8 no DISCO é mostrada e normalizada para o sinal CD95. Um experimento representativo de dois é mostrado. Abreviaturas: l.e. = exposição longa; s.e. = exposição curta; BC = controle IP com 'somente contas', sem a adição de anticorpos; CD95L = Ligadura CD95; DISC = complexo de sinalização indutor de morte; IP = imunoprecipitação; FADD = Domínio de morte associado ao Fas; c-FLIP = interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteína inibidora de enzimas; c-FLIPL = c-FLIPLong; PARP1 = poli (ADP-ribose)polimerase 1; M = peso molecular em kiloDalton (kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Formação de DISCO CD95 em células T primárias. As células T ativadas primárias foram estimuladas com anticorpos CD95L de 500 ng/mL para 15 min e 30 min. CD95 DISC-IPs foram realizados utilizando anticorpos anti-APO-1 (anti-CD95). A composição dos IPs foi examinada pela análise de manchas ocidentais e analisada para as proteínas indicadas. Actin foi usado como controle de carga. A quantificação dos produtos de decote procaspase-8 no DISCO é mostrada e normalizada para o sinal CD95. As entradas são mostradas. Abreviaturas: l.e. = exposição longa; s.e. = exposição curta; ; CD95L = Ligadura CD95; DISC = complexo de sinalização indutor de morte; IP = imunoprecipitação; FADD = Domínio de morte associado ao Fas; c-FLIP = interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteína inibidora de enzimas; c-FLIPL = c-FLIPLong; M = peso molecular em kiloDalton (kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Esta abordagem foi descrita pela primeira vez por Kischkel et al.27 e foi desenvolvida com sucesso desde então por vários grupos. Várias questões importantes devem ser consideradas para a eficiente imunoprecipitação disc-imunoprecipitação e monitoramento do processamento caspase-8 neste complexo.
Em primeiro lugar, é essencial seguir todas as etapas de lavagem durante a imunoprecipitação. Especialmente importantes são as etapas finais de lavagem das contas de sepharose e a secagem das contas de sepharose. Isso deve ser feito corretamente para aumentar a relação sinal/ruído da imunoprecipitação, permitindo a detecção de recrutamento e processamento caspase-8 no DISCO. Importante, para técnicas analíticas muito sensíveis, como espectrometria de massa, um "passo pré-claro", que inclui a incubação dos lisatos apenas com as contas de sepharose ou anticorpos de controle de isótipo, também pode ser importante na redução do ruído. No entanto, vários estudos têm demonstrado que essa etapa pré-eclarante não é essencial para a detecção do recrutamento caspase-8 para o DISCO por mancha ocidental7,23. No entanto, como mencionado, a lavagem das contas no final da imunoprecipitação é essencial para a obtenção de resultados confiáveis. A ligação inespecífica de proteínas celulares abundantes às contas de sepharose pode essencialmente diminuir os sinais específicos dos componentes disc principais. Como um importante controle para a ausência da ligação inespecífica, a análise ocidental das proteínas, relatadas para não estar presente no DISCO, pode ser realizada. Não foi observado um exemplo dessa análise na Figura 5, na qual não foi observada a contratação de PARP1 e caspase-3 para a imunoprecipitação disc-3. Isso indica a especificidade da imunoprecipitação particular e lavagem suficiente das contas de sepharose durante o experimento.
Em segundo lugar, é crucial realizar controles negativos, como um controle somente de contas ou um controle de imunoprecipitação com um anticorpo com o mesmo isótipo do anticorpo usado para a imunoprecipitação. Para anticorpos anti-APO-1, anticorpos anti-mouse IgG3 podem ser usados como um controle de isótipo. Em terceiro lugar, é importante monitorar os resultados da imunoprecipitação a partir de amostras não tratadas, nas quais apenas o CD95 deve ser observado. A detecção de FADD, c-FLIP ou procaspase-8 nessas amostras normalmente indica a presença de algumas deficiências no protocolo de imunoprecipitação ou etapas de lavagem. Isso poderia dar origem a suposições sobre a associação independente de estimulação de FADD ou c-FLIP com CD95, que podem não estar totalmente corretos, e em vez disso indicar falhas na imunoprecipitação. Em quarto lugar, para cada imunoprecipitação, os insumos ou lises devem ser cuidadosamente analisados paralelamente para medir a expressão e modificações pós-transicionais das proteínas centrais analisadas pela imunoprecipitação.
Em quinto lugar, a análise dependente do tempo permite que mudanças no complexo sejam seguidas ao longo do tempo e fornece mais uma confirmação importante sobre a especificidade das proteínas recrutadas para o complexo. Nesse sentido, uma questão importante é que cada linha celular tem um nível diferente de expressão CD95 e de componentes intracelulares deste complexo. Assim, o tempo exato da formação de DISCO CD95 deve ser cuidadosamente estabelecido para cada tipo de célula específica. Por fim, a questão crucial para a análise da dinâmica discal é a comparação da quantidade de proteína em cada imunoprecipitação. Para as imunoprecipitações CD95 DISC realizadas utilizando anticorpos anti-APO-1, a quantidade de CD95 é uma medida fundamental da quantidade igual dos complexos que estão sendo comparados. Isso pode ser difícil porque a intensidade do sinal CD95 nas imunoprecipitações é relativamente alta. No entanto, é preciso encontrar o intervalo de tempo ideal para medir o sinal de mancha ocidental correspondente. Outro obstáculo é que o CD95 é uma proteína altamente glicosilizada, que também contribui para as dificuldades em sua detecção na imunoprecipitação devido à presença de um padrão particular de várias bandas 'embaçadas'28.
A análise de imunoprecipitação disc fornece uma base ideal para detectar ativação e processamento de caspase. De fato, a imunoprecipitação combinada com a mancha ocidental permite a detecção quantitativa de produtos de decote de procaspase-8a/b: p43/p41, p30 e p18, como mostrado neste estudo(Figura 4, Figura 5e Figura 6). Isso, por sua vez, permite que os experimentadores acompanhem as alterações no processamento procaspase-8a/b ao longo do tempo e distinguem diferentes etapas de decote do procaspase-8. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para descrever a ativação caspase-8 em modelos matemáticos e distinguir entre o processamento de procaspase-8 inter e intramolecular no DISC7,20,29. Além disso, medir os produtos de decote caspase-8 por manchas ocidentais tem claras vantagens em comparação com os ensaios convencionais de atividade caspase-8 baseados no substrato IETD. Neste último caso, está bem estabelecido que o IETD também serve como um substrato para as outras caspases. Portanto, há evidências crescentes de que a detecção da atividade do IETD indica um aumento geral da atividade caspase na célula. Em contraste, o uso da análise de manchas ocidentais pode ajudar especificamente a atribuir as bandas correspondentes na mancha ocidental ao caspase-8, permitindo que o pesquisador esteja confiante de que o caspase-8 é ativado neste complexo. Além disso, como mencionado acima, a medição do processamento de caspase-8 no DISCO apresenta uma excelente ferramenta para estudos de modelagem matemática e biologia de sistemas. Em conjunto, é apresentado um fluxo de trabalho clássico para permitir o monitoramento de diferentes etapas de ativação e processamento do Procaspase-8, essencial para desvendar os mecanismos moleculares da morte celular.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Reconhecemos a Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), o Centro de Sistemas Dinâmicos (CDS), financiado pelo Programa EUROPEU ERDF (European Regional Development Fund) e o DFG (LA 2386) por apoiar nosso trabalho. Agradecemos a Karina Guttek por apoiar nossas experiências. Reconhecemos o Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) por nos fornecer células T primárias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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