Summary
ここでは、死誘導シグナル伝達複合体(DISC)で直接カスパーゼ-8処理を検出し、この複合体の組成を決定する実験的ワークフローを提示する。この方法論は、細胞死経路の分子機構の解明からアポトーシスネットワークの動的モデリングまで幅広い応用を有する。
Abstract
外因性アポトーシスは、CD95/Fas/APO-1または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体1/受容体2(TRAIL-R1/R2)などの死受容体(DR)の活性化によって媒介される。これらの受容体を同一性リガンドで刺激すると、死を誘発するシグナル伝達複合体(DISC)の組み立てにつながる。DISCはDR、アダプタータンパク質Fas関連タンパク質と死ドメイン(FADD)、プロサスアーゼ-8/-10、および細胞FADD様インターロイキン(IL)-1β変換酵素阻害タンパク質(c-FLIP)を含む。DISCは、プロカスパス8の処理とアクティベーションのプラットフォームとして機能します。後者 は、DISC で組み立てられたデスエフェクタードメイン(DED)フィラメントにおける二量体化/オリゴマー化によって生じる。
procaspase-8 の活性化は、その処理が続いて、いくつかのステップで発生します。本研究では、この複合体におけるDISC形成およびプロアスパス8の処理を測定することを可能にする確立された実験ワークフローについて説明する。このワークフローは、ウェスタンブロット分析でサポートされている免疫沈降技術に基づいています。このワークフローは、DISCとその処理に対するprocaspase-8採用の異なるステップを注意深く監視することを可能にし、外因性アポトーシスの分子メカニズムを調査するために非常に関連性が高い。
Introduction
最もよく研究された死の受容体(DR)の1つはCD95(Fas、APO-1)である。外因性アポトーシス経路は、DRと同結合リガンドとの相互作用から始まり、CD95LはTRAIL-Rsに結合するCD95またはTRAILと相互作用する。この結果、対応するDR. DISC での DISC の形成は、CD95、 FADD、 プロカスラーゼ-8/-10、および c-FLIP タンパク質1,2からなる 。さらに、DISCは、CD95やFADDなどの死ドメイン(DD)含有タンパク質、およびFADD、プロカスパス-8/-10、およびc-FLIPなどのDED含有タンパク質との相互作用によって組み立てられる(図1)。Procaspase-8は、そのDEの関連付けを介してオリゴマー化を行い、その結果、DEDフィラメントの形成、続いてプロカスパス8の活性化および処理を行う。これは、カスパーゼカスケードをトリガーし、細胞死(図1)3、4につながる。従って、プロカスパス症−8は、CD95またはTRAIL−Rsによって媒介される外因性アポトーシス経路の中心イニシエーターカスパーゼであり、対応する高分子プラットフォームDISCで活性化される。
プロカスパスゼ-8の2つのアイソフォーム、すなわちプロカスパス-8a(p55)および-8b(p53)は、DISC5に採用することが知られている。両方のアイソフォームは、2つのDEを含む。DED1およびDED2は、触媒p18およびp10ドメインが続く、プロアスパス症-8a/bのN末端部分に位置する。プロアスパス症-8DEの詳細なクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)分析は、プロサスパス8タンパク質のDEDフィラメント4,6と呼ばれる糸状構造への組み立てを明らかにした。驚くべきことに、リニアプロアスパス8鎖は、最初は二量体化に従事し、続いてDISCでプロスパパス8活性化に従事することが示唆された。さて、これらの鎖は、プロカスパス-8DEDフィラメントの一部構造に過ぎず、後者は三重らせん3、4、6、7に組み立てられた3つの鎖を含むことが知られている。
DEDフィラメントでの二量体化の際、プロカスパス8a/bの立体構造変化は、プロアスパス-8の活性中心の形成と、その活性化3、8を導く。これに続いて、2つの経路を介して媒介されるprocaspase-8処理が続きます:最初のものはp43 / p41切断産物の生成を介して行き、2番目のものはp30切断産物の初期生成を介して行きます。p43/p41経路はAsp374でのプロスパパス-8a/bの切断によって開始され、p43/p41およびp12切断産物を生じる(図2)。また、これらの断片は、Asp384およびAsp210/216で自動触媒的に切断され、活性カスパーゼ-8ヘテロトラマーの形成を生じさせる、p10 2/p1829、10、11。また、p43/p41処理経路と並行して、プロカスパス-8a/bもAsp216で切断され、C末端切断生成物p30の形成につながり、続いてp10およびp1810に対するタンパク質分解が行われることが示された(図2)。
DEDフィラメントにおけるプロカスパス症-8a/b活性化はc-FLIP12というタンパク質によって厳密に調節される。c-FLIPタンパク質は、c-FLIPLong (c-FLIP L)、c-フリップショート(c-FLIPS)、c-FLIPラジ(c-FLIPR)の3つのアイソフォームで発生します。3 つのアイソフォームはいずれも、N 端子領域に 2 つの DE を含んでいます。c-FLIPLはまたC末端触媒的に不活性なカスパーゼ様ドメイン12、13を有する。c-FLIP-c-FLIPSとc-FLIPRの両方の短いアイソフォーム-DISC6、14、15でDEDフィラメント形成を妨害することによって抗アポトーシス的な方法で作用する。さらに、c-FLIPLは濃度依存的な方法でカスパーゼ-8の活性化を調節することができる。これは、プロと抗アポトーシス効果16、17、18の両方をもたらすことができます。触媒活性プロアスパスを形成することによって-8/c-FLIPLヘテロダイマー、c-FLIPLは、プロアスパス8の活性中心の安定化とその活性化をもたらす。c-FLIPLのプロまたは抗アポトーシス関数は、DEDフィラメントにおけるその量および後に組み立てられたプロスパパス症-8/c-FLIPLヘテロダイマー19の量に直接依存する。DISCでのC-FLIPLの低濃度または中間濃度は、カスパーゼ-8の活性化をサポートするDEDフィラメントで十分な量のプロスパパス酵素-8/c-FLIPLヘテロ二量体をもたらす。対照的に、c-FLIPLの増加量は、直接DISC20でその抗アポトーシス効果につながります。
まとめると、DISCでのprocaspase-8a/bの活性化と処理は、いくつかのステップを伴う高度に規制されたプロセスです。本論文では、DISCにおけるプロカスパス8処理の測定と、この複合体の組成の分析について議論する。これは、例示的なDR複合体としてCD95 DISCを使用して提示されます。
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Protocol
T細胞実験は、倫理協定42502-2-1273 Uni MDに従って行った。
1. 実験用の細胞の準備
注: この免疫沈降の平均細胞数は 1 × 107です。 被着細胞は実験の日に107 個の細胞×されるように、実験の1日前に播種する必要があります。
- 実験用の接着細胞の準備
- 種子5〜8×、実験開始の前日に14.5cmの皿の各条件について、培地20mL(組成用材料表を参照)で106個の付着細胞を10個含みます。
- 実験の日に、細胞が80-90%コンフルエントであり、皿に付着していることを確認してください。培地を捨て、接着細胞に新鮮な培地を加えます。
- 実験用の懸濁液細胞の準備
- 実験開始直前に14.5cmの皿に10mLの培養培地(組成用材料表を参照)に1個の×を慎重に配置します。
- プライマリセルを使用する場合は、前述の手順21に従ってプライマリT細胞を単離する。1 μg/mL フィトヘマグルチニンを 24 時間、続いて 25 U/mL IL2 処理を 6 日間治療します。
- 実験開始直前に14.5cmの皿の条件ごとに1×108原T細胞を10mLの培養培地に入れてください(組成の材料表を参照)。
注: これらのセルは小さいため、このより多くのプライマリ T セルをお勧めします。
2. CD95L刺激
- CD95L(20または市販の(材料表を参照)で細胞を刺激する。
注意: CD95Lの濃度と刺激時間は細胞タイプ依存13、15、22、23、24、25です。1つの刺激条件を2回準備して、ビーズコントロールサンプルを並列に生成します。- 選択したCD95L濃度で接着細胞を刺激します。プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れることなくリガンドを培地にピペットします。
- リガンド溶液を細胞懸濁液にピペット化して、CD95Lで細胞の懸濁を刺激します。
3. 細胞の収穫とリシス
- 氷の上にセル皿を置きます。
メモ:メディアを破棄しないでください。死にかけている細胞は培地に浮かび、分析にとって重要です。 - 10 mLの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を細胞懸濁液に加え、取り付けた細胞をプレートから削り取ります。50 mLチューブにセル懸濁液を回収します。
- 冷たいPBSの10 mLでセル皿を2回洗い、洗浄液を同じ50mLチューブに入れます。500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。
- 上清を捨て、冷たいPBSの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。
- 500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、冷たいPBSの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。
- 500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、細胞ペレットを1mLのリシスバッファー(4%プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)で再懸濁します。氷の上で30分間インキュベートします。
- 最大速度(約17,000×g)で15分間、4°Cの間、最大速度でリゼートを遠心分離します。
- 清浄なチューブに上清(lysate)を移します。ペレットを捨てます。別のチューブに50μLのライセートを取ります。ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を分析し、バイアル中のタンパク質25μgに相当するリゼートの量を取ります。バイアルにロードバッファ( コンポジションの材料表 を参照)を追加します。-20 °Cで、ライセートコントロールとして保管してください。
4. 免疫沈降(IP)
- 2 μLの抗 APO-1 抗体と 10 μL のプロテイン A セファローズビーズ (メーカーが推奨するように調製) をライセートに加えます。ビーズの10 μLのみを、リセート(刺激されたサンプル)を含む別のチューブに加えることで、「ビーズコントロール」を生成します。
注:タンパク質Aセファローズビーズを扱いながら、チップをカットするか、IPのための特別なヒントを購入することによって、広いオリフィスでピペットのヒントを使用してください。 - 4°Cで一晩穏やかな混合と抗体/タンパク質Aセファロースビーズとのリゼートの混合物をインキュベート。 500 ×g の抗体/プロテインAセファローズビーズを用いたリゼートを4分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、1mLの冷たいPBSをビーズに加え、このステップを少なくとも3回繰り返します。
- 上清を捨てます。50 μL のハミルトンシリンジを使用してビーズを吸引することが好ましい。
5. ウェスタンブロット
- ビーズに20 μLの4倍のローディングバッファ(組成 用材料表 を参照)を加え、95°Cで10分間加熱します。95°Cで5分間、ライセートコントロールを加熱します。
- 12.5%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル(ゲル調製のための 材料表 を参照)に、ライセート、IP、およびタンパク質標準をロードし、80 Vの一定電圧で動作します。
- SDSゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移す。
注:ここでは、対象のタンパク質に最適化された半乾燥技術を、12分(25V;2.5 A=定数)以上の移動に使用しました。ニトロセルロース膜と2つのミニサイズの転写スタックを電気泳動バッファーに浸し(構成用 の材料表 を参照し、メーカーの指示に従って準備してください)、ウェスタンブロッティングの前に数分間浸します。 - ブロット膜を箱に入れ、ブロッキング溶液(PBS(PBS(PBS)+5%ミルクで0.1%Tween-20)で1時間ブロックします。穏やかな攪拌の下でブロッキング溶液で膜をインキュベート.
- 膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。
6. ウェスタンブロット検出
- 示された希釈液に最初の一次抗体を加え( 材料表を参照)、穏やかな攪拌で4°Cで一晩インキュベートします。
- 膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。
- 20 mLの二次抗体(PBST+5%乳で希釈)を室温で1時間穏やかに振って膜をインキュベートします。
- 膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。
- PBSTを廃棄し、約1mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ基材を膜に加えます。
- 化学発光シグナルを検出します( 材料表を参照)。
注:露光時間と撮影画像の数は、細胞内のタンパク質の量と使用される抗体の特異性によって異なります。検出に使用する抗体ごとに経験的に確立する必要があります。
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Representative Results
本論文では、CD95 DISCにおけるDISCへのカスパーゼ-8の採用と処理を分析するために、CD95 DISCのIPとウェスタンブロット分析を組み合わせた古典的なワークフローについて説明する。これにより、CASPASE-8活性化の複数の主要な機能をDISCで検出できます:カスパーゼ-8活性化高分子プラットフォームの組み立て、PROCASAS-8のDISCへの採用、およびこのイニシエーターカスパーゼの処理(図1 および 図2)。このワークフローは、時間依存的な方法でCD95Lを有する感受性細胞の治療を含み、その後、それらのリシス、抗CD95(抗APO-1)抗体を用いた免疫沈降、およびそれに続くウェスタンブロット分析(図3)を用いた。
子宮頸癌HeLa-CD95細胞をDISC形成26を解析する例として用いた。CD95Lによるこれらの細胞の刺激は、CD95-免疫沈降を 介して 監視される高レベルのCD95 DISC形成をもたらした(図4)。CD95、FADD、プロカスパス-8、プロカスパス-10、およびc-FLLIPは、これらのCD95-免疫沈降法において観察され、効率的なDISC形成を示す。重要なことに、プロカスプラーゼ-8a/bの切断産物:p43/p41、p30、およびp18は、PROCASPAS-8とその後の処理の活性化を示すDISCで検出された。特に、プロカスパス-8 p43/p41およびp18の切断産物が検出され、p43処理経路の2つの前述のステップを示す。また、p30生成物が検出された、カスパーゼ-8処理の代替経路を示す。さらに、DISCにおけるプロアスパス-8の活性化は、c-FLIPタンパク質などのその基質の切断に続く。
実際、c-FLIP-p43-FLIPおよびp22-FLIP-の切断産物が免疫沈降法で検出され、カスパーゼ-8活性化を示す(図4)。重要なのは、FADD、プロカスパスゼ-8、プロカスパス-10、およびc-FLLIP、およびそれらの切断産物も、DISC-免疫沈降の特異性を強調する未治療細胞からの免疫沈降サンプルで検出されなかった(図4)。これらの実験から重要な情報は、プロカスパス−8の異なる切断産物に対応するバンドを定量化することによって得ることができる(図4)。この情報は、アポトーシスネットワークの数学的モデリングに使用することができ、経路調節に関する定量的洞察を提供します。
DISC でのカスパーゼ 8 の活性化レベルは、c-FLLIP によって変調されます。したがって、C-FLIP L(HeLa-CD95-FL)15を過剰発現するHeLa-CD95細胞を2番目の例として選択した(図5)。 これらの実験におけるc-FLIPLアイソフォームの効果は観察され、ヒラートらが述べたように、親のHeLa-CD95細胞におけるPROCAspase-8の対応するタンパク質分解と比較して、DISCでp43/p41に対するプロアスパス-8a/b処理の速度が異なる結果となった。図4の観察と同様に、FADD、プロカスパス-8、プロカスパス-10、c-FLIPタンパク質、およびそれらの切断産物の募集は、これらの免疫沈降法の特異性を支持するCD95L治療なしでHeLa-CD95-FL細胞からの免疫沈降で検出された。免疫沈降の特異性に関するより多くの証拠は、CD95L処理免疫沈降法で観察されたDISCへのプロカスプラーゼ-3およびポリ(ADP-リボース)ポリ(PARP1)ポリ(PARP1)の採用の欠如である(図5)。これらのタンパク質は複合体の一部ではなく、免疫沈降シグナルに存在しないことは、豊富な細胞タンパク質の非特異的結合の欠如の証拠として役立つ可能性がある。
最後に、懸濁細胞からのCD95 DISCの免疫沈降を第3の例、 例えば、 活性化された初等T細胞として行った(図6)。これらの細胞はまた、高レベルのCD95、FADD、プロカスパス-8、プロアスパス-10、およびc-FLIPの高レベルを特徴とし、その切断産物と共に抗CD95免疫沈降法で観察された(図6)。免疫沈降におけるプロアスパス8切断産物の検出は、このイニシエーターカスパーゼの活性化および処理を、一次T細胞からのDISC-免疫沈降法で示している。これらの実験は、DISCが多くの付着細胞および懸濁細胞から免疫沈降することができ、カスパーゼ-8の処理および活性化がウェスタンブロット分析によって検証できることを示している。
図1: CD95シグナル伝達経路の概略的な提示 CD95L は、DISC アセンブリーをトリガーします。このディスクは、CD95、FADD、プロカスパス-8/-10、およびcフリップで構成されています。FADDはそのDD を介して CD95に結合し、一方、プロアスパス-8、プロアスパス-10、およびc-FLIPはDEを 介して 相互作用し、DEDフィラメントを形成する。DEDフィラメントの形成は、プロカスパス8二量体化、処理、およびその後の活性化のためのプラットフォームとして機能します。活性カスパーゼ-8ヘテロトトラマー、p182/p102は、切断によってカスパーゼ-3を活性化し、アポトーシスを引き起こします。略語: CD = 分化のクラスター;CD95L = CD95リガンド;DISC = 死を誘発するシグナリング複合体;DD = 死のドメイン;FADD= Fas 関連死ドメイン;c-FLIP = 細胞FADD様インターロイキン (IL)-1β変換酵素阻害タンパク質;DED = 死のエフェクター ドメイン;c-フリップL = c-フリップロング. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:DISCでのプロカスパスゼ-8処理 DISCでのプロアスパスゼ-8a/b処理の2つの方法を示す。第1の方法は、p43/p41生成に続いてp18形成を伴う。2 つ目の方法は、p30 生成とそれに続く p18 および p10 への処理を伴います。残基は、プロカスパス8aの配列に従って番号が付いている。略語: DED = 死亡エフェクタードメイン。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DISC-IPの実験セットアップの概略図 細胞はCD95Lで刺激される。刺激の後、細胞を収穫し、収集し、続いて異なる洗浄ステップを行う。次に細胞をライスし、ライセートを採取する。続いて、タンパク質A-セファローズビーズおよび抗APO-1(抗CD95)抗体を、リゼートに添加し、一晩インキュベートした。いくつかの洗浄工程の後、免疫沈降をウェスタンブロッティングにより分析した。略語: DISC = 死を誘発するシグナル伝達複合体;IP = 免疫沈降;CD95L = CD95リガンド この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:HELa-CD95細胞におけるCD95ディスク形成 HeLa-CD95細胞を30分間または1時間用に125ng/mL CD95Lで刺激した。IPの組成を、示されたタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット分析により調べた。アクチンは荷重制御として使用された。入力が表示されます。DISCにおけるプロカスパス8切断産物の定量化が示され、CD95シグナルに正規化される。略語: l.e. = 長時間露光;s.e. = 短い露出;BC = 抗体を添加せずに「ビーズのみ」でIPを制御します。CD95L = CD95リガンド;DISC = 死を誘発するシグナリング複合体;IP = 免疫沈降;FADD = Fas 関連死ドメイン;c-FLIP = 細胞FADD様インターロイキン (IL)-1β変換酵素阻害タンパク質;c フリップL = c-フリップロングc-フリップS = c-フリップショート;M = キロダルトン(kDa)における分子量。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:C-フリップL-HeLa-CD95細胞のCD95ディスク形成HeLa-CD95-FL細胞は、示された時点(1-3時間)について250 ng/mL CD95Lで刺激された。CD95 DISC-IPは、抗APO-1(抗CD95)抗体を用いて実施した。IPの組成をウェスタンブロット分析で調べ、示されたタンパク質について分析した。アクチンは荷重制御として使用された。入力が表示されます。DISCにおけるプロカスパス-8切断産物の定量化は、CD95信号に対して示され、正規化される。2つのうち1つの代表的な実験が示されている。略語: l.e. = 長時間露光;s.e. = 短い露出;BC = 抗体を添加せずに「ビーズのみ」でIPを制御します。CD95L = CD95リガンド;DISC = 死を誘発するシグナリング複合体;IP = 免疫沈降;FADD = Fas 関連死ドメイン;c-FLIP = 細胞FADD様インターロイキン (IL)-1β変換酵素阻害タンパク質;c フリップL = c-フリップロングPARP1 = ポリ (ADP-リボース)ポリメラーゼ 1;M = キロダルトン(kDa)における分子量。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: 原発性T細胞におけるCD95ディスク形成 一次活性化T細胞は、500ng/mL CD95Lを15分間および30分間刺激した。IPの組成をウェスタンブロット分析で調べ、示されたタンパク質について分析した。アクチンは荷重制御として使用された。DISCにおけるプロカスパス-8切断産物の定量化は、CD95信号に対して示され、正規化される。入力が表示されます。略語: l.e. = 長時間露光;s.e. = 短い露出;CD95L = CD95リガンド;DISC = 死を誘発するシグナリング複合体;IP = 免疫沈降;FADD = Fas 関連死ドメイン;c-FLIP = 細胞FADD様インターロイキン (IL)-1β変換酵素阻害タンパク質;c フリップL = c-フリップロングM = キロダルトン(kDa)における分子量。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このアプローチは、Kischkelら27 によって最初に記述され、それ以来いくつかのグループによって開発されました。この複合体における効率的なDISC-免疫沈降およびモニタリングカスパーゼ-8処理に関しては、いくつかの重要な問題を考慮する必要があります。
まず、免疫沈降の間に全ての洗浄工程に従う必要があります。特に重要なのは、セファロースビーズの最終洗浄工程とセファロースビーズの乾燥です。これは、免疫沈降のシグナル/ノイズ比を高めるために正しく行われ、DISCでカスパーゼ-8の採用と処理を検出することを可能にする必要があります。しかし、いくつかの研究は、この事前清算ステップは、ウェスタンブロッティング7、23によるDISCへのカスパーゼ-8募集の検出には不可欠ではないことを示している。しかしながら、前述のように、免疫沈降の終わりにビーズの洗浄は信頼できる結果を得るために不可欠である。豊富な細胞タンパク質のセファロースビーズへの非特異的結合は、コアDISC成分の特異的シグナルを本質的に減少させることができる。非特異的結合の欠如に対する重要なコントロールとして、タンパク質のウェスタンブロット分析は、DISCに存在しないと報告され、実施され得る。この分析の例は、図5に示され、DISC-免疫沈降に対するPARP1およびカスパーゼ-3の採用は認められなかった。これは、実験中のセファロースビーズの特定の免疫沈降および十分な洗浄の特異性を示す。
第2に、ビーズのみのコントロールや免疫沈降制御などの陰性制御を、免疫沈降に使用する抗体と同じアイソタイプの抗体で行うことが重要です。抗APO-1抗体の場合、抗マウスIgG3抗体はアイソタイプコントロールとして使用できます。第3に、CD95のみを観察すべき未処理サンプルからの免疫沈降の結果を監視することが重要である。これらのサンプルにおけるFADD、c-FLIP、またはプロカスパス-8の検出は、通常、免疫沈降プロトコルまたは洗浄ステップにおけるいくつかの欠点の存在を示す。これは、完全に正しくない可能性があり、代わりに免疫沈降の欠陥を示すCD95とのFADDまたはc-FLIPの刺激非依存的な関連に関する仮定を引き起こし得る。第4に、各免疫沈降について、入力またはライセートを並行して慎重に分析し、免疫沈降によって分析されたコアタンパク質の発現および翻訳後修飾を測定しなければならない。
第五に、時間依存分析は、複合体の変化を時間の経過とともに追跡することを可能にし、複合体に採用されたタンパク質の特異性に関するさらに別の重要な確認を提供する。この点で重要な問題は、各細胞株がCD95発現のレベルと、この複合体の細胞内成分のレベルが異なっている点です。したがって、CD95 DISC形成の正確なタイミングは、特定の細胞タイプごとに慎重に確立されなければならない。最後に、DISCダイナミクスの解析に重要な問題は、各免疫沈降におけるタンパク質量の比較です。抗APO-1抗体を用いて行われるCD95 DISC-免疫沈降量の場合、CD95の量は、比較される複合体の同量の重要な尺度である。免疫沈降におけるCD95シグナルの強度が比較的高いため、これは難しい場合があります。ただし、対応するウェスタンブロット信号を測定するための最適な時間間隔を見つける必要があります。もう一つの障害は、CD95が高グリコシル化タンパク質であり、また、いくつかの「ぼかし」バンド28の特定のパターンの存在による免疫沈降法における検出の困難に寄与する。
DISC-免疫沈降解析は、カスパーゼの活性化と処理を検出するための最適な基礎となります。実際、ウェスタンブロッティングと組み合わせた免疫沈降は、この研究に示すように、プロカスパス-8a/bの切断産物の定量的検出を可能にする:p43/p41、p30、およびp18(図4、図5、および図6)。これにより、実験者は、時間の経過とともにprocaspase-8a/b処理の変化に従い、procaspase-8の異なる切断ステップを区別することができます。このアプローチは、数理モデルにおけるカスパーゼ-8活性化を記述し、DISC7,20,29における分子間プロスパーゼ-8処理を区別するためにうまく使用されている。さらに、ウェスタンブロッティングによるカスパーゼ-8切断製品の測定は、IETD基質に基づく従来のカスパーゼ-8活性アッセイと比較して明らかな利点を有する。後者の場合、IETDが他のカスパーゼの基質としても機能することは十分に確立されている。したがって、IETD活性の検出が細胞内のカスパーゼ活性の一般的な増加を示しているという証拠が増えている。対照的に、ウェスタンブロット分析を使用すると、ウェスタンブロットの対応するバンドをカスパーゼ-8に特異的に割り当てることができ、研究者はこの複合体でカスパーゼ-8が活性化されると確信することができます。さらに、上記のように、DISCでのカスパーゼ-8処理を測定すると、数理モデリングおよびシステム生物学研究のための優れたツールが提供されます。一緒に、古典的なワークフローは、細胞死の分子メカニズムを解明するために不可欠であるprocaspase-8の活性化と処理の異なるステップの監視を可能にするために提示されます。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
我々は、ウィルヘルム・サンダー財団(2017.008.02)、EUプログラムERDF(欧州地域開発基金)、DFG(LA 2386)が資金を提供するダイナミックシステムセンター(CDS)が当社の活動を支援することを認めます。私たちの実験を支援してくれたカリーナ・グテクに感謝します。私たちは、私たちに原発性T細胞を提供したダーク・クラインホルド教授(OvGU、マクデブルク)を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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