Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analytisk bestemmelse af mitokondriefunktion af udskårne faste tumor homogenater

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62875
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2,4, 1,3
1Integrated Physiology and Molecular Medicine Laboratory, Pennington Biomedical Research Center, 2Clinical Oncology and Metabolism, Pennington Biomedical Research Center, 3Department of Nutrition, Case Western Reserve University, 4Department of Clinical Nutrition, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Vi udviklede en praktisk protokol og analytisk tilgang til evaluering af mitokondrieoxidativ fosforylering og elektronoverførselskapacitet i friske tumor homogenater. Denne protokol kan let tilpasses til at undersøge forskellige mitokondrie funktioner, der bidrager til kræft indledning, progression, og behandling respons.

Abstract

Mitokondrier er afgørende for udbrud og progression af kræft gennem energiproduktion, reaktiv ilt arter regulering, og makromolekyle syntese. Genetiske og funktionelle tilpasninger af mitokondrier til tumormiljøet drev proliferativt og metastatisk potentiale. Fremkomsten af DNA og RNA sekventering fjernet kritiske barrierer for evaluering af genetiske mæglere af tumorigenese. Men til dato, metodiske tilgange til evaluering tumor mitokondrie funktion forbliver undvigende og kræver tekniske færdigheder begrænse gennemførligheden, i sidste ende faldende diagnostiske og prognostiske værdi i både eksperimentelle og kliniske indstillinger. Her skitserer vi en enkel og hurtig metode til at kvantificere oxidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverførselskapacitet (ET) i friskudskårne faste tumor homogenater ved hjælp af høj opløsning respirometri. Protokollen kan reproducibly anvendes på tværs af arter og tumortyper samt tilpasset til at evaluere en mangfoldighed af mitokondrie ET veje. Ved hjælp af denne protokol viser vi, at mus med en lysende B brystkræft udviser defekt nicotinamid adenin dinucleotid-forbundet respiration og afhængighed af succinate at generere adenosin triphosphat via OXPHOS.

Introduction

Alle celler er tæt forbundet med deres behov for at producere og forbruge adenosin triphosphat (ATP), den molekylære energi valuta. Som cellulære mutationer giver anledning til dannelsen af tumorer, mitokondrier sikre overlevelse gennem diversificering af energiproduktion, der ofte er fænotypeligt skelnes fra ikke-kræft væv1,2,3. Som sådan, der er et kritisk behov for hurtig og dyb profilering af mitokondrie respiratorisk funktion for at lette klassificeringen af tumortype, kræft indledning, progression, og behandling respons.

Åndedrætsfunktioner i udskårne vævsprøver kan ikke vurderes intakt, da de primære substrater for OXPHOS ikke er celle-gennemtrængelige. For at overvinde denne begrænsning kan mitokondrier fremstilles enten ved isolation, kemisk permeabilisering eller mekanisk homogenisering. Mitokondrie isolation anses længe for at være en guldstandard for evaluering af åndedrætsfunktion. Det kræver dog store mængder væv, er tidskrævende og giver lav giver med mulig udvælgelse bias for visse fraktioner af mitokondrier4. Permeabilisering består af mekanisk adskillelse og eksponering af vævssektioner eller fiberbundter for et mildt vaskemiddel, der selektivt nedbryder plasmamembranen5. Permeabilisering er ofte ansat i striated væv såsom skelet og hjertemusklen som individuelle fiber bundter kan drilles fra hinanden. Sammenlignet med isolation giver permeabilisering mere mitokondrier i deres oprindelige cellulære miljø og fysiske form5. Permeabilisering er blevet anvendt med succes i andre væv såsom tumor6,7 og moderkage8; Reproducerbarheden af permeabiliserede fiberpræparater kan dog være vanskelig på grund af konsistensen af dissektion og iltbehov for at overvinde diffusionsbegrænsninger9. Derudover kan permeabiliserede fibre være uegnede i visse tumortyper, der er tæt cellulære og meget fibrotiske. Vævsar homogenater genereres gennem mekanisk forstyrrelse af plasmamembranen og ligner permeabiliserede fibre med hensyn til mitokondrieudbytte og integritet10. Vævs homogenater minimerer også begrænsningerne ved iltdiffusion og kan let anvendes på tværs af vævstyper gennem optimering af mekanisk kraft11,12.

Her skitserer vi en enkel og hurtig metode til at kvantificere oxidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverførselskapacitet (ET) i friskudskårne faste tumor homogenater. Protokollen er optimalt designet til at evaluere frisk væv ved hjælp af Oxygraph-2k (O2k) høj opløsning respirometer, som kræver forudgående kendskab til instrumental opsætning og kalibrering, men kan ligeledes tilpasses ved hjælp af enhver Clark-type elektrode, Seahorse analysator, eller pladelæser. Protokollen kan reproducibly anvendes på tværs af arter og tumortyper samt tilpasset til at evaluere en mangfoldighed af mitokondrie ET veje.

Protocol

Alle forsøg og procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Reagens forberedelse.

  1. Forbered EO771 cellevækstmedier med 10 mM HEPES, 10% fosterkvægsserum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (100 U/mL) og 0,2% amphotericin B.
  2. Forbered 1 L biopsibevarelsesopløsning (BIOPS) i et 1000 mL glasbæger.
    1. Tilsæt 3,180 g Na2ATP (5,77 mM endelig koncentration).
    2. Der tilsættes 1,334 g MgCL2·6H2O (6,56 mM endelig koncentration).
    3. Tilsæt 2,502 g taurin (20 mM endelig koncentration).
    4. Tilsæt 3,827 g Na2Fosfocreatin (15 mM endelig koncentration).
    5. Tilsæt 1,362 g Imidazole (20 mM endelig koncentration).
    6. Tilsæt 0,077 g Dithiothreitol (.5 mM endelig koncentration).
    7. Tilsæt 9,76 g MES hydrat (50 mM endelig koncentration).
    8. Der tilsættes 800 mL H2O, og konstituer bestanddelene ved hjælp af en magnetisk omrører ved 30 °C.
    9. Tilsæt 72,3 mL af 100 mM K2EGTA (7,23 mM endelig koncentration).
      1. 7,608 g EGTA opløses og 2,3 g KOH i 100 mL H2O.
      2. Juster pH til 7,0 med 5 M KOH, og før lydstyrken op på 200 mL med H2O.
    10. Tilsæt 27,7 mL 100 mM CaK2EGTA (2,77 mM endelig koncentration).
      1. 7,608 g EGTA opløses i 200 mL H2O og varme til 80 °C (100 mM endelig koncentration).
      2. 2,002 g CaCO3 opløses i 200 mL varm 100 mM EGTA-opløsning.
      3. Under konstant omrøring tilsættes 2,3 g KOH, og pH'en justeres til 7,0.
    11. pH-tallet justeres til 6,75 ved 23 °C (pH 7,1 ved 0 °C) med 5 M KOH. Bring lydstyrken op på 980 mL med H2O, og bland opløsningen. Kontroller pH-pH-skærmen igen, juster om nødvendigt, og bring det endelige volumen op til 1000 mL med vand.
    12. Aliquot BIOPS i koniske rør (15 mL eller 50 mL) og opbevares ved -20 °C, indtil de anvendes. Tø op én gang, lige før brug.
  3. Forbered 1 L mitokondrie respiration medium (MiR05) i en 1000 mL glasbæger.
    1. Tilsæt 0,190 g EGTA (0,5 mM endelig koncentration).
    2. Der tilsættes 0,610 g MgCL2·6H2O (3 mM endelig koncentration).
    3. Tilsæt 2,502 g taurin (20 mM endelig koncentration).
    4. Tilsæt 1,361 g KH2PO4 (10 mM endelig koncentration).
    5. Tilsættes 4,77 g HEPES (20 mM endelig koncentration).
    6. Tilsættes 37,65 g D-Saccharose (110 mM endelig koncentration).
    7. Der tilsættes 800 mL H2O, og konstituer bestanddelene ved hjælp af en magnetisk omrører ved 30 °C.
    8. Tilsæt 120 mL 0,5 M Lactobionic syre (60 mM endelig koncentration).
      1. 35,83 g lactobionsyre opløses i 100 mL H2O.
      2. Juster pH til 7,0 med 5 M KOH, og giv volumen op til 200 mL med H2O.
    9. Bland opløsningen og juster pH til 7,1 med 5 M KOH.
    10. Vejer 1 g BSA, i det væsentlige fedtsyrefri (1 g/L endelig koncentration), i et 50 mL konisk rør. Tilsæt 40 mL af pH 7.1-opløsningen fra trin 9 til rør, vend forsigtigt for at blande og undgå skumdannelse. Den opløste BSA overføres til den resterende pH 7.1-opløsning fra trin 9, og rørs forsigtigt og kontinuerligt. Kontroller pH igen, juster om nødvendigt, og bring den endelige volumen op til 1000 mL med H2O.
    11. Aliquot MiR05 medium i 50 mL koniske rør og opbevares ved -20 °C indtil brug. Tø op én gang, lige før brug.
  4. Forbered substrater, uncouplers og hæmmere.
    1. 0,8 M malat: Opløs 536,4 mg L-æblesyre i 4 mL H2O. Neutralisere med 5 M KOH til pH 7 og bring volumen op til 5 mL med H2O. Del i aliquots og derefter opbevares ved -20 °C.
    2. Forbered 1 M Pyruvat: Opløs 550 mg pyruvsyre natriumsalt i 4 mL H2O. Neutralisere med 5 M KOH til pH 7 og bring volumen op til 5 mL med H2O. Del i aliquots og derefter opbevares ved -20 °C.
    3. Forbered 0,5 M ADP (adenosin 5′-diphosphat): Opløs 1,068 g ADP natriumsalt i 4 mL H2O. Neutralisere med 5 M KOH til pH 7 og bringe volumen op til 5 mL med H2O. Opdele i aliquots og derefter opbevares på -20 °C.
    4. Forbered 2 M Glutamat: Opløs 3,7426 g L-Glutamic syremonohydrat i 8 mL H2O. Neutralisere med 5 M KOH til pH 7 og bringe volumen op til 10 mL med H2O. Opdele i aliquots og derefter opbevares på -20 °C.
    5. 4 mM Cytochrom c: Opløs 50 mg cytochrom c i 1 mL H2O. Del op i aliquots og opbevares derefter ved -20 °C.
    6. Forbered 1 M Succinate: Opløs 2.701 g Succinate disodium salthexahydrat i 8 mL H2O. Neutralisere med 1 N HCl til pH 7 og bring volumen op til 10 mL med H2O. Divider i aliquots og derefter opbevares ved -20 °C.
    7. Forbered 1 mM FCCP (carbonyl cyanid-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone): Opløs 2,54 mg FCCP i 10 mL ren ethanol. Del i aliquots og derefter opbevares ved -20 °C.
    8. Tilbered 150 μM Rotenone: Opløs 3,94 mg Rotenone i 10 mL ren ethanol for at forberede 1 mM lager, vortex indtil fuldt opløst. Fortynd 225 μL på 1 mM Rotenone lagerkoncentration med 1.275 mL ren ethanol til fremstilling af 1,5 mL af 150 μM Rotenone. Beskyt mod lys, del i aliquots, og opbevar derefter ved -20 °C.
    9. 125 μM Antimycin A: Opløs 11 mg Antimycin A i 4 mL ren ethanol til fremstilling af 5 mM lagerkoncentration af Antimycin A. Fortynd 25 μL på 5 mM Antimycin En bestandskoncentration med 975 μL ren ethanol til fremstilling af 1 mL på 0,125 mM Antimycin A. Del op i aliquots og opbevares derefter ved -20 °C.
    10. 0,8 M Ascorbat: Opløs 1,584 g Ascorbat natriumsalt i 8 mL H2O. Juster pH med ascorbinsyre til pH 6 og bring volumenet op til 10 mL med H2O. Beskyt mod lys, del i aliquots, og opbevar derefter ved -20 °C.
    11. 0,2 M TMPD (tetramethyl-p-phenylenediamin): Opløs 32,85 mg TMPD i 987,5 μL af DMSO. Der tilsættes 12,5 μL på 0,8 M ascorbat (10 mM endelig koncentration af ascorbat). Beskyt mod lys, del i aliquots, og opbevar derefter ved -20 °C.
    12. 4 M Natriumhyrde: Opløs 2,6 g natrium-azid i 10 mL H2O. Del op i aliquots og opbevares ved -20 °C.

2. Tumorvækst

  1. Dyrk EO771-celler i RPMI 1640 vækstmedier og vedligehold cellerne i en 37 °C befugtet inkubator med 5 % CO2.
  2. Fire uger gamle C57BL/6J-mus fra en enkelthus, der holder dem ved 21-22 °C på en 12 timers lys: mørk cyklus. Giv musene ad libitum adgang til mad og vand.
  3. Når musene når 10 uger, forberede cellerne og musene til kræft celle implantation.
    1. Trypsinize cellerne, deaktivere trypsin med vækstmedier, og centrifuge celler på 500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Aspirere supernatant og resuspend og kombinere celle pellets (efter behov) i medierne. Tæl levedygtige celler ved hjælp af trypanblå og forbered en cellefortynding på 1 x 106 celler i et samlet volumen på 60 μL med en 1:1:1 Media/ Basement Membrane Matrix/PBS-opløsning. Når kælderen membran matrix er tilføjet, blandes godt og holde celle suspension på is. Fyld sprøjter med 60 μL celleaffjedring og læg dem på is. Arbejd effektivt og indsprøjt celler i mus inden for 1,5 timer efter præparatet.
    2. Bedøve mus ved isoflurane indånding (3%-5% for induktion og 1%-3% til vedligeholdelse). Barbering mellem højre 4th og 5th inguinal brystkirtler. Orthotopically injicere bedøvet mus med EO771 celle suspension.
  4. Brug elektroniske calipers til at overvåge og måle tumorvæksten to gange om ugen i 4 uger. Ved obduktion, punktafgifter, veje, og derefter placere tumor (eller mindst 60 mg tumor sektion) straks i 10 mL af iskold BIOPS. Hold røret på våd is.

3. Opsætning og kalibrering af instrumenter

  1. Varm MiR05-mediet i et 37 °C vandbad.
  2. Slå Oroboros O2k-systemet til, åbn DATLAB-softwaren, indtast eller vælg Bruger. Klik på Opret forbindelse til O2k. Kontroller O2k-konfigurationen, og sørg for, at det korrekte instrument er mærket til Power-O2k, og at hvert kammer svarer til den korrekte iltsensor. Klik på OK. Når O2k-kontrolvinduet åbnes under fanen Systemer, skal du indstille bloktemperaturen til 37 °C, omrørerhastigheden til 750 o/min for begge kamre, ND dataregistreringsintervallet til 2,0 s. Kontroller både Omrører power og belysning i afdelingsbokse. Under fanen Ilt, O2 skal du indstille Gain for Sensor til 1 V/μA (gevinsten skal muligvis justeres for ældre instrumentmodeller), polariseringsspændingen til 800 mV, og klik derefter på Opret forbindelse til O2k. Når en ny eksperimentfil åbnes, skal du navngive filen og klikke på Gem. Når eksperimentet er aktivt, åbnes et protokolvalgsvindue. Klik på Annuller for at køre en brugerdefineret SUIT (Substrat uncoupler hæmmer titrering).
  3. Efter protokolvalg åbnes et eksempelvindue for at udfylde forsøgskoden, eksempeltypen, kohorten, eksempelkoden, eksempelnummeret og undersalmplenummeret efter behov. Tildel enheden til mg og indtaste tumor homogenat koncentration pr ML (beløb pr kammer vil auto-befolke). Sørg for, at det angivne medium er MiR05, og at kammervolumenet er 2,00 mL. Tilføj kommentarer efter behov i den nederste boks, og klik på OK.
  4. Fjern propperne og aspirere 70% ethanol fra kamrene. Du må aldrig aspirere tæt på membranen, der er eksponeret på indersiden af kammeret. Skyl fire gange med rent vand og fyld kammeret med 2,25 mL MiR05.
  5. Sensortest: Klik på F9 for at slukke for omrørerne i 30 s. Når omrørerstangen tændes igen, skal du sørge for, at O2-hældningen hurtigt øges monoexponentielt i hvert kammer. Hvis kammeret ikke består sensortesten, skal du kontrollere de elektriske forbindelser og rengøre, hvis der er ophobet salte. gentage testen. Hvis sensoren fortsætter med at dumpe testen, skal du fjerne det polarografiske iltsensorstik (POS) for at inspicere membranen. Hvis der observeres synlige skader på membranen, kraftig oxidation eller betydelig bobleakkumulering, skal du standse forsøgsprocedurerne og fortsætte til instrumentservicering.
  6. Iltkalibrering: Udfør iltkalibrering for at opnå nøjagtige respirationsmålinger.
    1. Med en snoet bevægelse sættes propperne langsomt i deres volumenkalibrerede position. Siphon off overskydende medium skubbet gennem injektion kapillær, der samler sig i brønden af proppen. Med en vridning bevægelse, løfte propperne lige nok til at tæt montere prop-spacer værktøj forlader en gas volumen over væskefasen for den endelige luft ekvilibrering (30-45 min.).
    2. Brug den steady-state opnået i denne periode til at kalibrere iltsensoren for at opnå nøjagtige målinger af respiration. O2 hældning neg. (negativ hældning af ilt) er 0 ± 2 pmol/s·mL. Hvis værdien er højere end 2 pmol/s·mL, skal kammeret rengøres og fyldes op med frisk optøet MiR05. Hvis hældningen er ustabil, skal du fortsætte til instrumentservice.
    3. Når du har opnået en stabil tilstand, skal du vælge O 2-koncentrationskurven og fremhæve den stabile del af kurven ved at holde skifttasten nede og venstreklikmusknap. Når området er valgt, skal du klikke på F5, markere mærket til luftkalibrering med rullepilen og klikke på Kalibrer og kopier til udklipsholderen.
  7. Instrumental baggrundskalibrering (valgfrit)
    1. Efter luftkalibrering skal du sikre dig, at der ikke er gasvolumen over væskefasen for ækvilibrering af fluxbaggrund (~15 min), og lukke kamrene helt.
      BEMÆRK: Den steady-state rate opnået i denne periode repræsenterer instrumental baggrund og kan trækkes fra de resulterende data for øget analytisk præcision. O2 hældning neg. vil i første omgang stige lidt og plateau mellem ± 2 til 4 pmol/s·mL.
    2. Hvis værdien er høj (>6 pmol/s·mL), er der potentiel biologisk forurening. I dette tilfælde skal du rengøre kammeret og genopfylde det med frisk optøet MiR05. Når en steady-state er opnået, skal du vælge O2 hældning neg. kurve og fremhæve den stabile region af kurven ved at holde Shift-tasten nede og venstre-klik museknap.
    3. Når du har valgt området , skal du klikke på F5, vælge feltet Oprindelig korrektion og mærket for Oprindelig plan med rullepilen og klikke på OK.

4. Tumor homogenatpræparat

  1. Placer en glas homogenisator indeholdende 1 mL MiR05 og en tætsiddende glas støder på våd is.
  2. På tidspunktet for undersøgelsen skal vævet placeres i 1 mL BIOPS i en iskold petriskål.
  3. Rengør og disseker vævet for at maksimere opløseligt materiale, undgå nekrotiske regioner, og fjerne marginal tumorvæv. Ved hjælp af en dissektion mikroskop, skalpel, og kirurgisk pincet, fjerne ethvert hår, nekrotisk væv, perifer bindevæv og vaskulært væv, og tilstødende fedt, alt efter hvad der er relevant. Sørg for at holde tumoren i iskold BIOPS under dissektionen.
  4. Skær tumoren i små stykker (~ 5-10 mg hver) og læg de resterende tumorstykker tilbage i 10 mL BIOPS, der holdes på is. Brug dette væv senere til yderligere præparater, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Udfør følgende trin hurtigt for at minimere den tid, prøven ikke er nedsænket helt i BIOPS. Når prøven er placeret i MiR05, er tiden af afgørende betydning. Flyt forsigtigt det forberedte homogenat ind i det kalibrerede kammer så hurtigt som muligt.
  5. Blot vævssektionerne omhyggeligt på et filterpapir, læg dem på en lille plasttjæret vejebåd, og registrer den oprindelige våde vægt. Placer de ubrugte stykker tilbage i BIOPS's 10 mL-koniske rør til fortsat konservering.
  6. Dyk vævssektionerne ned i en iskold homogenisator, der indeholder MiR05, og registrer den resterende vægt på vejebåden, hvis det er relevant.
  7. Ved hjælp af et glas støder (clearance rækkevidde 0,09-0,16 mm), forsigtigt forstyrre tumorvæv ved at udfylde 5-7 ned-og-op slagtilfælde. For hvert slag skal du rotere støderen i en uret-klog-mod uret bevægelse 3 gange, mens du skubber støderen ned og 3 ekstra gange, mens du trækker støderen op igen. Sørg for at lade vævet slå sig ned til bunden af homogenisatoren mellem strøg, men undgå at bringe støderen helt over væskevolumenet for at forhindre skumdannelse.
    BEMÆRK: Det resulterende homogenat skal virke overskyet med minimale rester af fast væv.
  8. Hæld homogenatet i et 15 mL konisk rør og læg det på is.
  9. Pipette 1-3 mL frisk MiR05 over støderen og ind i homogenisatoren for at vaske eventuelle resterende vævs homogenater. Hæld MiR05-vasken i det koniske rør, der indeholder homogenatet. Gentag støderen og homogenisatoren vask 2-3 gange for at sikre fuldstændig overførsel af homogenatet. Husk målkoncentrationen og den krævede volumen for ikke at fortynde prøven over under vasketrinnene.
  10. For nøjagtigt at beregne vævs homogenatkoncentrationen skal homogenisatoren og homogenatet omhyggeligt inspiceres for resterende ikke-homogeniseret materiale (dvs. bindevæv).
    1. For at fjerne det ikke-homogeniserede materiale fra homogenisatoren, der ikke kan nås med pincet, skal du tilsætte MiR05 til homogenisatoren, aspirere volumen (herunder vævet) med en pipette og flytte indholdet til en Petriskål.
    2. For at fjerne det ikke-homogeniserede materiale fra homogenatet (afgjort i store stykker i bunden af det koniske rør), aspirere de store stykker med en pipette og placere dem på vævshætten på det koniske rør.
    3. Fjern vævet fra petriskålen eller konisk rørhætte med pincet og blot det på filterpapir. Tilsæt den resterende homogenat fra den koniske rørhætte tilbage i det koniske rør, hætte det, og vend derefter for at blande.
    4. Homogenisatorerne genforeres og homogeniseres for yderligere ikke-homogeniseret materiale og gentages trin 4.10.1-4.10.3 for at fjerne materialet efter behov.
  11. Vægt og registrer massen af det ikke-homogeniserede materiale, der genvindes fra homogenisatoren. Undersøg homogenatpræparatet for groft intakt væv, der overføres. Fjern de ikke-homogeniserede stykker og veje efter behov.
  12. Træk vævsvægten, der genvindes fra vejebåden, homogenisatoren og homogenaten (om nødvendigt) fra den oprindelige våde vægt for at beregne den endelige prøvevægt.
  13. Ved hjælp af den endelige prøvevægt skal du tilføje yderligere MiR05 for at bringe homogenat til den ønskede koncentration (se trin 5 for detaljer om optimeringseksperimenter).
  14. Når homogenatet er vejet og forberedt, fortsæt til analysen så hurtigt som muligt. Hold prøven opbevaret på våd is, indtil den overføres til instrumentet.

5. Substrat, uncoupler, hæmmer titrering protokol (SUIT)

  1. Når instrumentet er kalibreret, og prøven er forberedt, skal propperne fjernes med en vridningsbevægelse og aspirere MiR05 fra kamrene (undgå membranen eksponeret inde i kammeret). Homogenaten blandes godt, og der tilsættes 2,25 mL af homogenatet til kammeret. Hvis der tilsættes en homogenat til flere kamre, pipette 1 mL ad gangen i hvert kammer, mens du blander homogenatet for at sikre lige vævsfordeling. Klik på F4 for at navngive og tidsstempel begivenheden og derefter klikke på OK.
  2. Fyld en 50 mL sprøjte med ilt fra en ilttank med en regulator og gasrør ved hjælp af en stump 18 G nål. Hyperoxygenat kamrene til ~ 500 μM ilt. Til dette injiceres ilt direkte ind i kamrene. Sæt propperne løst og vent med at lukke, indtil ilten når ~480 μM. Med en snoet bevægelse skal du langsomt lukke kammeret og lade åndedrættet ekvilibrere (~ 15-20 min). Fyld proppen central kapillær med MiR05 hvis det er nødvendigt.
  3. Analytisk bestemmelse af OXPHOS- og ET-kapaciteten (elektronoverførselstilstand) af N-forbundet og NS-forbundet og CIV-aktivitet (kompleks IV): Brug dedikerede mikrosyringer til at injicere substrater, uncouplers og hæmmere i fuldt lukkede kamre. Klik på F4 med hver injektion for at navngive og tidsstempel begivenhederne for hvert kammer i realtid. I løbet af undersøgelsen skal du vælge F6 for at justere O2-koncentrationen og O2 hældningssnår efter behov. Efter hver injektion vaskes sprøjterne 3 gange i vand (for vandopløselige forbindelser) eller 70% ethanol (for forbindelser opløst i ethanol eller DMSO).
    BEMÆRK: N-forbundet: O2 flux understøttet af definerede NADH-genererende substratkombinationer, NS-forbundet: O2 flux understøttet af konvergensen af definerede NADH-generere substratkombinationer og succinate.
    1. Der tilsættes 5 μL 0,8 M malat (2 mM endelig koncentration) og fortsæt straks til næste injektion. Vask injektionssprøjten 3 gange i vand.
    2. Tilsæt straks 5 μL af 1 M Pyruvat (2,5 mM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Vask injektionssprøjten 3 gange i vand.
    3. Der tilsættes 10 μL på 0,5 M ADP (2,5 mM endelig koncentration) og vent på, at ADP-responsen stabiliseres. Vask injektionssprøjten 3 gange i vand.
      BEMÆRK: Yderligere ADP (2,5-10 mM) kan være påkrævet for at sikre, at adenylatkoncentrationerne ikke begrænser sig til luftvejsstrøm.
    4. Tilsæt 5 μL af 2 M Glutamat (5 mM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Vask injektionssprøjten 3 gange i vand.
    5. Der tilsættes 5 μL 4 mM Cytochrom c (10 μM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Vask injektionssprøjten 3 gange i vand.
    6. Tilsæt 20 μL af 1 M Succinate (10 mM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Vask injektionssprøjten 3 gange i vand.
    7. Titrere 0,5-1 μL stigninger på 1 mM FCCP (2-20 μM endelig koncentration) og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i respiration. Vask injektionssprøjten 3 gange i 70% ethanol.
    8. Der tilsættes 2 μL på 150 μM Rotenone (150 nM-2 μM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Tilsæt yderligere 1 μL Rotenone for at sikre, at der ikke er yderligere hæmning. Hvis der er et fald i respiration, fortsætte med yderligere injektioner, indtil der ikke er noget fald i respiration. Vask injektionssprøjten 3 gange i 70% ethanol.
    9. Der tilsættes 2 μL på 125 μM Antimycin A (125 nM-5 μM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Tilsættes yderligere 1 μL Antimycin A for at sikre, at der ikke er yderligere hæmning. Hvis der er et fald i respiration, fortsætte med yderligere injektioner, indtil der ikke er noget fald i respiration. Vask injektionssprøjten 3 gange i 70% ethanol.
    10. Kontroller kammerets iltkoncentration; hvis koncentrationen er under 125 μM, reoxygenere til rumluft eller mildt hyperoxygenat for at sikre, at ilt ikke begrænser luftvejsstrøm. Der tilsættes 5 μL på 0,8 M Ascorbat (2 mM endelig koncentration). Vask injektionssprøjten 3 gange i 70% ethanol.
    11. Tilsæt straks 10 μL på 0,2 M TMPD (1 mM endelig koncentration) vent på en stigning i respiration langsom. Vask injektionssprøjten 3 gange i 70% ethanol.
    12. Der tilsættes 25 μL 4 M natrium-azid (50 mM endelig koncentration) umiddelbart, når luftvejsfluen af Ascorbate/TMPD plateauer. Vask injektionssprøjten 3 gange i 70% ethanol.
    13. Afslut undersøgelsen - klik på Filer, Gem og afbryd forbindelsen. Fortsæt med at vaske kammeret og sprøjten efter trin 9.2-9.3.

6. ADP følsomhed protokol

  1. Når instrumentet er kalibreret, og prøven er forberedt, skal propperne fjernes med en vridningsbevægelse og aspirere MiR05 fra kamrene (undgå membranen eksponeret på indersiden af kammeret). Homogenaten blandes godt, og der tilsættes 2,25 mL af homogenatet til kammeret. Antag, at der tilføjes en homogenat til flere kamre, pipette 1 mL ad gangen i hvert kammer, mens du blander homogenatet for at sikre lige vævsfordeling. Klik på F4 for at navngive og tidsstempel begivenheden og klik på OK.
  2. Sæt propperne i, og luk langsomt kammeret med en snoet bevægelse, og lad åndedrættet ekvilibrere (~15-20 min). Fyld proppen central kapillær med MiR05 hvis det er nødvendigt.
  3. Analytisk bestemmelse af succinate-forbundet mitokondrie ADP følsomhed: Klik på F4 med hver injektion for at navngive og tidsstempel begivenhederne for hvert kammer i realtid. I løbet af undersøgelsen skal du vælge F6 for at justere O2-koncentrationen og O2 hældningssnår efter behov.
    1. Der tilsættes 2 μL på 150 μM Rotenone (150 nM endelig koncentration).
    2. Tilsæt straks 20 μL af 1 M Succinate (10 mM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres.
    3. Titrere ADP ved trinvis tilsætning af submættede koncentrationer, indtil den når den maksimale responsrate (VMAX; 2,5-10 mM endelig koncentration).
      BEMÆRK: Satsen kan plateau efter injektion på grund af en lille ændring i ADP koncentration, således øge injektion koncentration efter hvert plateau og fortsætte med titrering, indtil der ikke er yderligere stigning i respiration selv med en fold stigning i ADP injektion koncentration.

7. Anbefalede optimeringseksperimenter

  1. Bestem optimal homogenat- og iltkoncentration for protokollen.
    1. Suit-protokollen (trin 5.1-5.3) udføres ved flere vævskoncentrationer (f.eks. 30 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1 mg/mL og/eller 0,5 mg/mL).
    2. Vælg en koncentration, der maksimerer luftvejsstrømningen, samtidig med at hyppigheden af reoxygenationer begrænses (højst 1-2). Hvis der er behov for hyppigere reoxygenationer, skal du reducere koncentrationen af homogenatet.
  2. Bestem det optimale antal slag med homogenisatoren.
    1. Udfør SUIT-protokollen (trin 5.1-5.3) ved flere homogeniseringsniveauer (f.eks. 5 slag, 10 slag, 15 slag, 20 slag).
    2. Da der ikke er tilstrækkelige data i litteraturen til at bestemme en tærskel for den procentvise stigning i cytochrom c med tumor homogenatpræparat, skal du vælge præparatet med begrænset cytochrom c respons, men tilstrækkelig respiration aktiveret af substratet (r) af interesse.
  3. Bestem den optimale substrat, ADP, uncoupler, og hæmmer koncentrationer, der kræves for kvantitative og reproducerbare respiratoriske fluxes.
    1. SUIT-protokollen (trin 5.1-5.3.9) udføres ved den valgte vævskoncentration (trin 7.1). Titrere hvert substrat, uncoupler, inhibitor, og ADP, indtil der ikke er observeret yderligere respons. Titrere hæmningen med natriumazid i separate eksperimenter.
      1. Der tilsættes 5 μL 0,8 M malat (2 mM endelig koncentration) og fortsæt straks til næste injektion.
      2. Titrere 1 μL trin på 1 M Pyruvat og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i respiration.
      3. Titrere 2 μL trin på 0,5 M ADP og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i respiration.
      4. Titrere 1 μL trin på 2 M Glutamat og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i respiration.
      5. Der tilsættes 5 μL 4 mM Cytochrom c (10 μM endelig koncentration) og vent på, at åndedrættet stabiliseres.
      6. Titrere 5 μL intervaller på 1 M Succinate og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i respiration.
      7. Titrere 5 μL stigninger på 0,5 M ADP og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i respiration.
      8. Titrere 0,5 μL stigninger på 1 mM FCCP og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i respiration.
      9. Titrere 1 μL stigninger på 150 μM Rotenone og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er nogen fald stigning i respiration.
      10. Titrere 1 μL stigninger på 125 μM Antimycin A og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion, fortsætte, indtil der ikke er yderligere fald i respiration.
      11. Der tilsættes 5 μL på 0,8 M Ascorbat (2 mM endelig koncentration).
      12. Tilsæt straks 5 μL på 0,2 M TMPD (.5 mM endelig koncentration) vent på at øge respiration langsom. I et separat forsøg tilsættes 10 μL på 0,2 M TMPD (1 mM endelig koncentration).
      13. I separate forsøg tilsættes henholdsvis 10 μL, 25 μL, 50 μL og 100 μL på 4 M natrium azide (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM endelig koncentration) umiddelbart, når luftvejsstrømpen af Ascorbate/TMPD plateauer.
    2. Vælg de substrat- og hæmmerkoncentrationer, der mættes inden for den første injektion for at forbedre timingen af eksperimentet. Brug ADP ved mættende eller submættede koncentrationer til at kombinere ADP-følsomhedsevalueringer med traditionelle SUIT-protokoller.
    3. Brug sub-maksimal uncoupler koncentrationer til at påvise dosis-lydhørhed uden hæmning af respiration flux.

8. Dataanalyse

  1. SUIT-analyse
    1. Vælg steady-state eller peak satser fra hver titrering og eksport til analytisk reduktion.
    2. Udtrykke dataene som pmol O2 pr. sekund pr. mg væv (pmol/s/mg).
    3. Opnå den analytiske reduktion af PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P og PMGS-E ved at trække antimycin En ufølsom sats fra den respektive sats (dvs. steady-state rate opnået efter tilsætning af ADP).
      BEMÆRK: PM: Pyruvat + Malate; PMG: Pyruvat + Malate + Glutamat; PMGS: Pyruvat + Malate + Glutamat + Succinate; -L:Lækagetilstand; -P: Oxidativ fosforylering tilstand, -E: Elektron overførsel tilstand.
    4. Opnå den analytiske reduktion af CIV-E ved at trække natriumacidets ufølsomme hastighed fra spidsbelastnings-/TMPD-hastigheden.
    5. Opnå den analytiske reduktion af PMG-E ved at trække rotenon ufølsom sats fra PMGS-E sats.
    6. Opnå den analytiske reduktion af S-E ved at trække antimycin A ufølsom sats fra rotenone ufølsom sats.
    7. Opnå den analytiske reduktion af cytochrom c kontrol effektivitet, en markør for ydre membran intakthed, ved følgende ligning:
      jc = ((JCHNOc - JCHNO)/JCHNO) x 100
      I ligningen er jc % stigning ved tilsætning af cytochrom c, JCHNOc er ilt flux efter tilsætning af cytochrom c, og JCHNO er ilt flux forud for tilsætning af cytochrom c.
  2. ADP følsomhed analyse
    1. Analytisk bestemme kinetik for ADP følsomhed i forhold til lækagehastigheden af succinate + rotenone (ikke hastigheden af vævet homogenat).
    2. Kompøt O2-fluxen (Y-aksen) mod den relative ADP-koncentration (X-akse). Bestem den maksimale luftvejshastighed (Vmax)som den højeste hastighed, der opnås over ADP-titreringen.
    3. Bestem Michaelis-Menten kinetiker ved hjælp af en kurve montering software (PRISM, version 10.1) til at afsløre ADP koncentration, hvor 1 /2 VMAX er opnået (Tilsyneladende KM).

9. Instrumentel kvalitetskontrol

  1. Udfør instrumental O2-baggrund over det ønskede iltkoncentrationsområde (0-600 μM) og nul kalibrering.
    1. Udfør trin 3.1 og 3.2
    2. Fjern propperne og aspirer 70% ethanol fra kamrene (undgå membranen udsat på indersiden af kammeret). Skyl 4 gange med dobbeltdestilleret H2O, og fyld kammeret med 2,25 mL MiR05
    3. Hyperoxygent kamrene til ~ 600 μM ilt.
    4. Sæt propperne langsomt i deres helt lukkede position. Sifon fra det overskydende medium skubbet gennem injektion kapillær og indsamlet i brønden af proppen og lad iltsignalet stabilisere (30-45 min).
    5. Hvis du vil udføre iltkalibrering, skal du vælge det område, hvor både iltkoncentrationen og hældningen er stabil, åbne kalibreringsvinduet for det respektive kammer og vælge R1-mærket.
    6. Grøfteopløsningen forberedes ved at opløse 20 mg natriumhydrulfat i 0,5 ml vand. Begræns udsættelsen for luft, da dithionit oxideres over tid med udsættelse for ilt.
    7. Når iltsignalet er stabiliseret, injiceres 1 μL, og iltkoncentrationen falder. Juster styrken af dithionitopløsningen efter behov.
    8. Indsprøjtning af tilstrækkelig dithionitopløsning til at sænke iltkoncentrationen til henholdsvis 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM og 0 μM. Ved hver injektion skal ilten stabiliseres og vælge et mærke til steady-state hældningen. Når iltkoncentrationen er ~0 μM, markere iltkoncentrationen.
    9. Hvis du vil udføre instrumental O 2-baggrundskorrektion, skal du vælge flux/hældningsvinduet for det respektive kammer, vælge O2 Baggrundskalibreringog klikke på Kalibrer for at få tegn på interesse.
    10. Hvis du vil udføre nulkalibrering, skal du åbne kalibreringsvinduet for det respektive kammer og vælge det R0-mærke, der er opnået efter dithionittration.
  2. Rengøring af instrumenter
    1. Skyl hurtigt hvert kammer med rent vand tre gange. Til den første vask, aspirere homogenatet, fylde kammeret fuldt ud med vand, og derefter aspirere vandet. For den anden vask skal kammeret fyldes 3/4 fuld af vand, indsætte propperne for at tvinge vand gennem injektionskapillæren, aspirere noget af vandet gennem injektionskapillæren og derefter fjerne propperne for at aspirere vask fuldt ud.
    2. Vask kamrene med 70% ethanol i 5 min.
    3. Over en vask eller bægerglas, rengør propperne med rent vand, 70% ethanol og 100% ethanol, tvinger væske gennem injektion kapillærer ved hjælp af en vaskeflaske.
    4. Skyl hurtigt hvert kammer med rent vand to gange.
    5. Inkubere kamre med 2 mL PBS indeholder ~ 2 mg frosne mitokondrier, celle lysat, eller levende fibroblaster i 15 min.
    6. Vask kamrene med rent vand i 5 min to gange.
    7. Vask kamrene med 70% ethanol i 5 min to gange.
    8. Vask kamrene med 100% ethanol i 10 min.
    9. Fyld kamrene med 70% ethanol.
      1. Hvis du kører et på hinanden følgende eksperiment, skal kamrene efterlades i 70% ethanol i 5 min og derefter fortsætte med at trin 3.3.
      2. Hvis forsøgene er færdige, skal du lægge låg på propperne og slukke instrumentet.
  3. Efter hver brug skal injektionssprøjterne rengøres korrekt, og sprøjterne holdes klar til specifik stofbrug for at forhindre fremførsel.
    1. Sæt sprøjten i vaskevæsken, og indsprøjtningsnålen nedsænkes helt.
    2. Optræk vaskevæsken i sprøjten til den maksimale volumen.
    3. Fjern sprøjten fra vaskebeholderen, skub vaskevæsken ud i et bægerglas, og duk derefter sprøjten på et køkkenrulle.
    4. Gentag trin 9.3.1-9.3.3 tre gange så hurtigt som muligt efter hver brug.

Representative Results

Indledende undersøgelser viste, at EO771 tumorer var ringe oxidative og dermed krævede høje homogenatkoncentrationer for tilstrækkelig O2 flux vurdering. Optimeringsforsøg blev udført for at bestemme det optimale vævs homogenatkoncentrationsområde for undersøgelsen. Tumor homogenater blev oprindeligt udarbejdet ved 40 mg / mL og derefter lineært fortyndet. O2-flux normaliseret til vævsmasse var konsistent på tværs af koncentrationer (Figur 1A-D). Det blev observeret, at 40 mg/mL resulterede i hurtig iltsvind og ikke var egnet til forsøg (figur 1A). Iltforbruget faldt betydeligt med 30 mg/mL og 20 mg/mL, men faldt stadig hurtigt på kort tid uden substrater eller ADP (figur 1B, C). 10 mg/mL-koncentrationen resulterede i den optimale iltforbrugshastighed (Figur 1D), som ville understøtte en længere SUIT-protokol på 90 min.

En SUIT-protokol blev brugt til at evaluere NADH- og succinate-linked OXPHOS og ET samt CIV-aktivitet (Figur 2A). Pyruvat og malat blev tilsat vævs homogenatet i mangel af ADP for at drive lækage (L) gennem NADH. Mættende ADP blev derefter tilføjet til drev maksimal NADH-forbundet OXPHOS (P), efterfulgt af tilsætning af glutamat. Cytochrom c blev derefter tilsat for at sikre ydre membranintegritet; stigningen i respirationsraten var mindre end 20 % i alle prøver (figur 2B). I betragtning af den meget lave respons på NADH-forbundne substrater blev cytochrom c-frigivelsen også vurderet i nærværelse af succinate og rotenon og observeret minimal cytochrom c stimulation ( Figur2B). Interessant, NADH-forbundet OXPHOS var ubetydelig i EO771 tumorer (Figur 2C). Succinate blev derefter tilføjet i nærværelse af pyruvat, malat og glutamat for at stimulere elektronstrømmen gennem succinate dehydrogenase. FCCP blev derefter titreret for at drive maksimal elektronstrøm (E), som afslørede, at i EO771 tumorer, fosforylering snarere end oxidation var begrænsende til respiration (Figur 2C). Rotenone og antimycin A blev efterfølgende titreret for at hæmme henholdsvis kompleks I og kompleks III. Ascorbat og TMPD blev derefter tilsat for at drive maksimal elektronstrøm gennem CIV, som derefter hæmmes af natrium-azid. Tabel 1 illustrerer analytiske reduktionsligninger af de rådata (tabel 2) for at kvantificere de luftvejsparametre , der er afbildet i figur 2C. Samlet set tumor homogenere respiratoriske profiler (Figur 2C) svarer til dem af ikke-implanterede digitonin-permeabilized EO771 celler (Figur 2D) med undtagelse af formindsket maksimal elektron overførsel understøttes af N- og S-forbundet substrater i tumoren.

Da NADH-forbundet respiration var ubetydelig, blev succinates respiratoriske kinetika yderligere evalueret ved trinvise titreringer af submættede ADP, indtil den maksimale hastighed (VMAX)blev opnået (figur 3A,3B). Den halvmaksimume koncentration (KM)af ADP i nærværelse af succinate + rotenone var 37,5 μM, mens VMAX var ~ 10,5 pmol / s / mg (Figur 3C). På trods af relativt dårlige oxidationshastigheder var EO771 tumorer således meget følsomme over for ADP og vedvarende ATP-syntese ved relativt lave ADP-koncentrationer.

Valg af egnede områder af de rå data til udvinding er afgørende for reproducerbarheden af eksperimenter og nøjagtig kvantificering. For cytochrom cskal der vælges et mærke i steady-state umiddelbart før injektion (Figur 4A, mærke 1). Der er ofte en indledende injektion artefakt, der kan efterfølges af en periode (ca. 5-10 min), hvor O2 flux er ikke stabil. Evaluering af cytokrom c-effektivitet foretages ved at foretage en yderligere udvælgelse, når O2-fluxen har stabiliseret sig ( Figur4A, mærke 2). Valg efter tilsætning af substrater, ADP eller de fleste hæmmere foretages også efter injektionsartefaktet, og når O 2-fluxen er stabiliseret (Figur 4B). Det valg, der anvendes til at bestemme maksimal ukoblet respiration, foretages ved den højeste stigning, der opnås under titreringen af FCCP, hvilket ofte ikke er den sidste injektion (Figur 4C). Udvælgelsen af TMPD foretages, efter at både ascorbate og TMPD er blevet tilføjet, og ved den maksimale stigning i respiration (Figur 4D, mark 1). Lige efter denne top tilsættes hæmmeren, natriumazid, hvilket hurtigt reducerer åndedrættet, men har også ofte en injektionsartefakt lavere end den hæmmede respirationshastighed (Figur 4D). Inhibitormærket foretages umiddelbart efter injektionsartefaktet (Figur 4D, mark 2). O2-fluxen vil typisk ikke stabilisere sig og fortsætte med at falde.

Tabel 1: Respirationsbesetation og analytisk afledning. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Prøve og respiratoriske egenskaber ved lysende B brystsvulst homogenater. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 1
Figur 1: Optimering af tumor homogenatkoncentration. O2 Flux (rød) og O2 Koncentration (blå) hos brystsvulst homogenater fremstillet ved (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL og (D) 10 mg/mL. Thom: Væv homogenere respiration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Evaluering af OXPHOS- og ET-kapacitet ved høj opløsnings respirometri i friskopskårne tumor homogenater. (A) Repræsentativt grundstykke af iltforbrug (rød) og koncentrationer (blå) i løbet af en substrat, hæmmer, uncoupler protokol. PM: Pyruvat + Malate, D: ADP, G: Glutamat, c: Cytochrom c, S: Succinate, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimycin A, Asc/TMPD: Ascorbate/Tetramethyl-p-phenylenediamin. (B) Procentvis stigning i O2 flux ved tilsætning af cytochrom c. (C-D) Respiration understøttet af malat, pyruvat, glutamat og succinate i nærværelse af ADP, FCCP, og ascorbat/TMPD i (C) EO771-afledte tumor homogenater og (D) ikke-implanterede EO771 digitonin-permeabilized celler. Thom: Væv homogenat respiration; PM: Pyruvat + Malate; PMG: Pyruvat + Malate + Glutamat; PMGS: Pyruvat + Malate + Glutamat + Succinate; CIV: Kompleks IV; -L: Lækage tilstand; -P: Oxidativ fosforyleringstilstand, -E: Elektronoverførselstilstand; N-forbundet: O2 flux understøttet af definerede NADH-genererende substratkombinationer; NS-forbundet: O2 flux understøttet af konvergensen af definerede NADH-generere substrat kombinationer og succinate. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: EO771 brysttumorer vises høj ADP (adenosin 5′-diphosphat) følsomhed. (A) Repræsentativt grundstykke for iltforbrug (rød) og koncentrationer (blå) i hele en S-forbundet ADP-titreringsprotokol. Thom: Væv homogenat respiration; S/Rot: Succinate/Rotenone; D: ADP. (B) Respiration understøttet af succinate i nærværelse af rotenon og stigende koncentrationer af ADP (0 μM ADP = S /Rot-L). (C) Maksimal hastighed (VMAX) og halvmaksimumkoncentration (KM)af ADP i nærværelse af succinate + rotenon. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ sporing, der illustrerer markering af rå O2-fluxer til dataudtræk. (A) Valg af cytokrom c: udvælgelsesnummer 1 før cytochrom c-injektionen og udvælgelse nummer 2 efter injektionen, når O2-fluxet har stabiliseret sig. c Cytochrom c. (B) Substrat, ADP og hæmning valg: udvælgelse nummer 1 efter injektionen (succinate i denne repræsentative plot), hvor O2 flux har stabiliseret. S: Succinate. (C) Udkodningsvalg: udvælgelsesnummer 1 ved den højeste stigning i respirationen under uncoupler titrationen. I dette repræsentative FCCP-titreringsplot reducerer den tredje injektion lidt åndedrættet og bruges derfor ikke til udvælgelse. F: ACCP. (D) TMPD-udvælgelse: udvælgelse nummer 1 ved den højeste stigning i respirationen efter ascorbat- og TMPD-injektionerne. Natrium azid udvælgelse: udvælgelse nummer 2 efter den akutte injektion artefakt, når respirationen i første omgang falder. As/Tm: Ascorbate/TMPD; Azd: Azide. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Tilgange til evaluering af mitokondrie respiration i kræft har i vid udstrækning været begrænset til in vitro modeller13,14,15,16. En vis succes er opnået i måling mitokondrie respiration i tumorer ved hjælp af kemisk permeabilization6,7,17, men der er ingen ensartet, guld-standard tilgang, der kan anvendes universelt og sammenlignes på tværs af tumortyper. Derudover har mangel på konsekvent dataanalyse og -rapportering begrænset datageneralisering og reproducerbarhed. Metoden skitseret heri giver en enkel, relativt hurtig tilgang til måling mitokondrie respiration18 i mitokondrie præparater fra frisk excised solid tumor prøver. Tumorer blev dyrket fra ortotopisk implanteret murin Luminal B, ERα-negativ EO771 brystkræftceller19.

Omhu og pleje med vævshåndtering vil i høj grad forbedre nøjagtigheden og normaliseringen af iltforbruget. Vævet og mitokondrier kan let beskadiges, hvis prøven ikke holdes kold, ikke konsekvent nedsænkes i konserveringsmedier eller håndteres for meget, hvilket resulterer i suboptimal rutine og OXPHOS-satser. Derudover er nøjagtig vådvægt af det homogeniserede væv af afgørende betydning, da dette er den primære normaliseringsmetode. Andre normaliseringsmetoder kan overvejes, såsom totale protein- eller mitokondriespecifikke markører, såsom citratsyntaseaktivitet20. Derudover, væv heterogenitet skal behandles, med beslutninger om tumor regioner til at omfatte i eksperimenter foretaget på forhånd. Nekrotisk, fibrotisk, og bindevæv kan ikke homogenisere og / eller respire godt og bør undgås, medmindre forsætligt assaying disse tumor regioner. Især, tumoren kan være meget klæbrig afhængigt af typen og excision region, hvilket gør præcis vejning og overførsel mere udfordrende. Antallet af strøg, der anvendes til homogeniseringer, bør optimeres for at sikre fuldstændig forberedelse af mitokondrier, samtidig med at der formildes skader på de ydre mitokondriemembraner.

For forbedret nøjagtighed og reproducerbarhed anbefaler vi optimeringsforsøg for antallet af slagtilfælde til homogenatpræparat, vævskoncentration og substrat, uncoupler, inhibitorkoncentrationer. Undersøgelser kan sammenligne det forskellige antal slagtilfælde, og hvordan de svarer til respons på tilsætning af cytochrom c i undersøgelsen samt den maksimale mitokondrie respiratoriske kapacitet 21. Selv om der er en generel accept af, at mindre cytochrom c respons er bedre, da en stigning i iltforbruget efter tilsætning af cytochrom c kan indikere skader på den ydre mitokondriemembran, er der ingen guldstandard for, hvad denne tærskel er for hvert væv og bør eksperimentelt undersøges for at sikre, at vævet ikke bliver overbebyrdet eller underforberedt. I dette tumorvæv blev det konstateret, at en cytochrom c respons under ~ 30% ikke forringe respiratorisk funktion. Cytochrom c-brug bliver afgørende for nøjagtig kvantificering af åndedrætskapaciteten, hvis testen er positiv. I dette tilfælde genopfylder tilsætning endogene cytochrom c, som, hvis de er udtømt, vil forårsage en undervurdering af åndedrætsfrekvenserne.

Vævskoncentration titrering eksperimenter kan udføres over en række mulige koncentrationer og ideelt set ville ske med SUITs, der vil blive undersøgt i løbet af undersøgelsen. Respiratorisk kapacitet vil variere efter tumortype og sammensætning. Således tumorer tæt med mitokondrier eller høj respiratorisk kapacitet vil kræve lavere koncentrationer (0,5-5 mg/mL). Tumorer med få mitokondrier eller lav respiratorisk kapacitet vil kræve højere koncentrationer (7-12 mg/mL). Derudover kan SUITs, der er lange eller har meget forbrugte substrater, have brug for mindre væv for at forhindre reoxygenation af kammeret eller ADP-begrænsning. Nogle væv vil have en lineær sammenhæng i iltforbruget, mens andre vil vise forbedret følsomhed og maksimal oxidation på visse koncentrationsområder. Den valgte vævskoncentration skal optimeres for at maksimere iltstrøm og samtidig begrænse antallet af reoxygenationshændelser. Derudover er det ofte bedre at overvurdere behovet for eller sigte mod den højere ende af koncentrationsområdet. Hæmmerne, som er afgørende for kvantificeringen af respiratoriske fluxer, er mere præcise, når de anvendes i større puljer af mitokondrier.

En anden væsentlig overvejelse er koncentrationen af de lægemidler, der anvendes under protokollerne. Ændringer i homogenatkoncentrationen kan ændre koncentrationerne af substrater, uncouplers og hæmmere, der kræves for maksimal respons. Når det optimale koncentrationsområde er valgt, skal der således udføres et forsøg, der tester de doser, der kræves til SUIT-protokollen. Yderligere ADP kan tilføjes for at sikre, at adenylatkoncentrationer ikke begrænser sig til luftvejsstrøm. Kemiske afkoblere som FCK eller CCCP vil hæmme åndedrættet ved højere koncentrationer22. Som sådan er det vigtigt at titrere i små mængder for at afsløre den maksimale opnåede sats. Hæmmere, såsom rotenon og antimycin A, anvendes bedst, når de er mættet i den første injektion. Mens optimale koncentrationer blev bestemt i indledende forsøg, har vi også observeret behandlingsrelaterede forskelle som reaktion på hæmmere og tilføjer derfor ofte en ekstra injektion af hæmmere for at demonstrere maksimal hæmning, da de resulterende satser tjener som grundlag for kvantificering. Kemisk hæmning af Ascorbat/TPMD er afgørende for nøjagtig analytisk reduktion, da TMPD gennemgår autooxidation23. Vi kontrollerede for autooxidation af ascorbat/TMPD/cytochrom c gennem tilsætning af natriumazid, en etableret CIV-hæmmer. For Km-undersøgelserne forhindrer tilsætning af rotenon i nærværelse af succinate alene oxaloacetatakkumulering, som kan hæmme succinate dehydrogenaseaktivitet ved lave koncentrationer24. Volumen og koncentration af ADP er meget afhængig af mitokondriers følsomhed over for den fremherskende substratkombination. Mitokondriepræparater, der er meget følsomme over for ADP, vil kræve lavere startkoncentrationer. Derudover validerede kemikalier og korrekt lægemiddelpræparat med opmærksomhed på pH, følsomhed over for lys, hvis det er relevant, og opbevaringstemperatur er afgørende for vellykkede eksperimenter.

Instrument setup og rutinemæssig pleje er af afgørende betydning for succesen af disse eksperimenter. Tilstrækkelig og korrekt rengøring af kamrene er afgørende for reproducerbarhed og forebyggelse af biologisk, protein, hæmmer eller afkoblet forurening. Clark-type elektroder og O2k systemer udnytte glas reaktion kamre, som er en betydelig omkostningsfordel for plade-baserede systemer, der er afhængige af forbrugsstoffer. Glaskamrene skal dog rengøres kraftigt og kan være en kilde til kontaminering af hæmmere i efterfølgende undersøgelser. Inkubation med mitokondrier-rige prøver under vaskeprocessen (f.eks. isolerede hjerte- eller lever mitokondrier) kan reducere risikoen for eksperimentel forurening og anbefales ud over fortyndings- og alkoholbaserede vaskeprocedurer. Hvis der gennemføres på hinanden følgende undersøgelser, minimerer rengøring med ethanol og mitokondrier muligheden for inhibitorforurening. Kalibrering af iltsensoren anbefales forud for hvert forsøg for at opnå nøjagtige målinger af respiration i forhold til det fremherskende delvise ilttryk. Hvis det ikke er muligt at kalibrere flere kalibreringer, kan en kalibrering om dagen være tilstrækkelig, hvis iltkoncentrationen forbliver stabil og ensartet efter vaskeproceduren.

De procedurer, der er skitseret ovenfor udnytte Oroboros O2k instrument til måling af iltforbrug i tumorvæv inden for 4 timer efter tumor excision ved hjælp af tidligere designet og optimeret konservering løsning og respiration medier25,26,27. Flere parametre i denne protokol kan ændres til efterfølgende programmer. Instrumentopsætningen og kalibreringen, de homogenisatorer, der anvendes til vævspræparat, og den optimale homogenat- og kammer oxygenkoncentration kan alle tilpasses til brug på andre instrumenter med iltovervågningspotentiale. For eksempel blev kamrene lidt overfyldte, når de tilsættes homogenat, og når kammeret er helt lukket, forbliver kammerkapillæren fuld. Dette vil forbruge noget ilt i kammeret, men med optimering af prøvekoncentrationen kan vi redegøre for dette forbrug ved at bestemme, hvilket iltniveau der skal starte med. Alternativt kan prøven få lov til at ekvilibrere ved omgivende ilt, før kammeret lukkes, men dette vil ofte øge tiden, før eksperimentet starter og forsinke tilsætning af substrater. Mens de homogenisatorer, der anvendes i denne protokol, er bredt tilgængelige, kan der anvendes andre kommercielle homogeniseringsteknikker, såsom en vævs shredder eller automatiseret homogenisator28.

Derudover kan vævspræparatet og instrumentprocedurerne anvendes sammen med en række forskellige SUIT'er til at studere åndedrætskontrol ved en mangfoldighed af koblings- og vejkontroltilstande29. Disse SUIT-protokoller er udviklet til at måle funktionel kapacitet, og dermed har bidraget fra potentielle endogene substrater ingen indvirkning på kapacitetsmålingen. Vi analytisk tegner os for ikke-mitokondrie iltforbrug og / eller resterende forbrug af homogenatet gennem subtraktion af antimycin A-rotenone, eller natrium azid ufølsomme satser, alt efter hvad der er relevant. Mitokondrier kan forblive levedygtige i BIOPS eller lignende konstruerede konserveringsløsninger i længere tid (>24 timer) afhængigt af vævstype og intakthed30,31. Undersøgelser kan udføres på forhånd for at bestemme de tidsmæssige opbevaringsgrænser, da OXPHOS af visse substrater kan have forskellige begrænsninger. Dette er afgørende, hvis eksperimentet ikke kan udføres inden for få timer efter vævs excision/biopsi. 37 °C er en optimal og fysiologisk temperatur til evaluering af åndedrætsfunktion i de fleste pattedyrsystemer. Hvis analysetemperaturen imidlertid ser ud til at forstyrre evaluering32, kan der gennemføres sammenlignende undersøgelser på tværs af et bredt temperaturområde (25-40 °C) for at sikre tilstrækkelig reaktionsevne. Instrumentale begrænsninger kan begrænse evnen til at gennemføre sådanne undersøgelser.

Større begrænsninger af ovennævnte metode er 1) potentialet for skader på mitokondrier gennem mekanisk homogenisering, 2) tilstedeværelse af ATPaser eller andre subcellulære biokemikalier i homogenatpræparater, der kan forstyrre samtidig bestemmelse af ATP eller andre variabler af interesse og kan kræve yderligere korrektionsmetoder eller hæmmerbrug33 og 3) evaluering af mange prøver og/eller flere SUIT'er pr. prøve er tidskrævende, da ét instrument kan rumme to eksperimenter ad gangen og kræver rengøring og opsætning mellem efterfølgende forsøg. Optimering eksperimenter og konsekvent forberedelse af prøver kan minimere betydelige mitokondrie skader, der ville bidrage til inkonsekvente data.

Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder er forbedret gennemførlighed i forhold til mængden af udgangsmateriale, udfordring med at isolere mitokondrier eller teknisk udfordring i permeabilizing væv. Forberedelse af homogenater er hurtigere, ilt er ikke nær så begrænsende, og er mindre modtagelige for variation mellem personale sammenlignet med permeabiliseret væv. Det er vigtigt, at næsten alle prøvetyper er egnede til homogenatpræparat, som giver mulighed for sammenlignende analyse på tværs af væv. Respirometri i høj opløsning er guldstandardmålingen af mitokondrie OXPHOS og ET. Anvendelsen af denne metode i præklinisk og klinisk kræftforskning har kapacitet til at udvide de nuværende in vitro-undersøgelser til ex vivo-undersøgelser. Desuden tilbyder det potentielle anvendelser i kliniske og diagnostiske indstillinger.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter relateret til dette arbejde.

Acknowledgments

Vi takker Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core personale for dyrepleje. Denne forskning blev delvist støttet af National Institute of Health Grants U54GM104940 (JPK) og KL2TR003097 (LAG). Alle forsøg og procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383
Amphotericin B Gibco 15290018
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Ascorbate Sigma-Aldrich A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free Sigma-Aldrich 3117057001 Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe Fisher Scientific 13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C2506
Datlab 7.4 software Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide Amresco N182
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
D-Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Dumont # 5 Forceps Fine Science Tools 11251-30 Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps Fine Science Tools 11271-30 Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in World Precision Instruments 501601
EO771 cells CH3 BioSystems SKU: 94APV1-vial-prem Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Female C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock #000664
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Imidazole Sigma-Aldrich 56750
Kimwipes Fisher Scientific 34120
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich G1626
Lactobionic acid Sigma-Aldrich L2398
Malate Sigma-Aldrich M6413
Matrigel Matrix Corning 354248
MgCl·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Microsyringes Hamilton 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394
Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer Oroboros Instruments 10003-01
PBS Gibco 10010023
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich P1767
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
RPMI 1640 Gibco 21875034
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Succinate (disodium) Sigma-Aldrich W327700
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Whatman Filter Paper, grade 5 Sigma-Aldrich 1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL Duran Wheaton Kimble 357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11 McKesson 1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 Becton, Dickinson and Company 305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 Becton, Dickinson and Company 305195
BD 1mL Slip Tip Syringe Becton, Dickinson and Company 309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate Research Diet D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm Thermo Fisher Scientific S34819

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. Fundamentals of cancer metabolism. Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).
  2. Bajzikova, M., et al. Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells. Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).
  3. Martínez-Reyes, I., et al. Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth. Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6 (3), 18317 (2011).
  5. Saks, V. A., et al. Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. Saks, V. A., et al. , Springer US. 81-100 (1998).
  6. Kaambre, T., et al. Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).
  7. Koit, A., et al. Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).
  8. Holland, O. J., et al. Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation. Placenta. 57, 102-112 (2017).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  10. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  11. Kondrashova, M. N., et al. Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate. Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).
  12. Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).
  14. Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).
  15. Zhang, J., Zhang, Q. Cancer Metabolism: Methods and Protocols. Haznadar, M. , Springer. New York. 353-363 (2019).
  16. Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells. Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).
  17. Schöpf, B., et al. Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells. The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).
  18. Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  19. Le Naour, A., et al. EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice. Cancer Cell International. 20, 328 (2020).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial physiology. Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).
  21. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
  22. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  23. Munday, R. Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine. Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).
  24. Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).
  25. Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).
  26. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  27. Doerrier, C., et al. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
  28. Rohlenova, K., et al. Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer. Antioxidants & Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).
  29. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).
  30. Barksdale, K. A., et al. Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain. FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).
  31. Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).
  32. Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila. Journal of Experimental Biology. 224, Pt 6 (2021).
  33. Salin, K., et al. Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios. Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).

Tags

Kræftforskning Udgave 174
Analytisk bestemmelse af mitokondriefunktion af udskårne faste tumor homogenater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L.,… More

Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L., Gilmore, L. A., Kirwan, J. P. Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates. J. Vis. Exp. (174), e62875, doi:10.3791/62875 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter