Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन रूपात्मक परिवर्तन और पतन के स्तर की मात्रा

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Nicholas School of the Environment, Duke University

Summary

इस लेख में, हम यह प्रदर्शित करते हैं कि सी एलिगेंसमें डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन डेंड्राइट आकृति विज्ञान में परिवर्तनों को लगातार निर्धारित करने के लिए सात-सूत्री स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग कैसे करें। यह प्रणाली न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के आनुवंशिक, रासायनिक और आयु-आधारित मॉडलों का उपयोग करने वाले डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजनरेशन के विश्लेषण के लिए है।

Abstract

डोपामाइन न्यूरॉन हानि पार्किंसंस रोग (पीडी) की विकृति में शामिल है, जो दुनिया भर में 10 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करने वाला एक अत्यधिक प्रचलित न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है। चूंकि पीडी एटियोलॉजी के बारे में कई विवरण अज्ञात रहते हैं, इसलिए रोकथाम, प्रबंधन और उपचार के तरीकों की खोज करने के लिए पीडी में आनुवंशिक और पर्यावरणीय योगदानकर्ताओं की जांच करने वाले अध्ययनों की आवश्यकता होती है। डोपामिनेर्गिक न्यूरोनल हानि का उचित लक्षण वर्णन न केवल पीडी अनुसंधान के लिए प्रासंगिक हो सकता है, बल्कि अन्य तेजी से प्रचलित न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए प्रासंगिक हो सकता है।

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस मॉडल सिस्टम में डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन के आनुवंशिक और रासायनिक मॉडल स्थापित हैं, जिसमें नेमाटोड की पारदर्शिता और अपरिवर्तनीय न्यूरोनल आर्किटेक्चर द्वारा समर्थित न्यूरोबायोलॉजी का आसान दृश्य है। विशेष रूप से, हर्मेफ्रोडिटिक सी एलिगेंस के डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन रूपात्मक परिवर्तनों को कोशिका-विशिष्ट प्रमोटरों जैसे डैट-1 डोपामाइन ट्रांसपोर्टर जीन द्वारा संचालित फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ उपभेदों का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है, जो विशेष रूप से उनके आठ डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में व्यक्त की जाती है।

इस मॉडल प्रणाली और उपयुक्त प्रौद्योगिकी की क्षमताओं के साथ, कई प्रयोगशालाओं ने डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन किया है। हालांकि, जिस तरह से डेटा का विश्लेषण किया जाता है उसमें थोड़ी निरंतरता है और वर्तमान साहित्य बाइनरी स्कोरिंग विश्लेषणों का उपयोग करता है जो पतन की उपस्थिति को कैप्चर करते हैं लेकिन न्यूरॉन हानि की प्रगति का पूरा विवरण नहीं है। यहां, हम सी एलिगेंसके सेफेलिक न्यूरॉन डेंजरमें रूपात्मक परिवर्तनों और पतन का आकलन करने के लिए एक सार्वभौमिक स्कोरिंग प्रणाली शुरू करते हैं। यह सात सूत्री पैमाने पर डेंड्राइट आकृति विज्ञान की एक पूरी श्रृंखला में विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, स्वस्थ न्यूरॉन्स से लेकर डेंड्रिट हानि को पूरा करने के लिए, और गुत्थी, शाखाओं में बंटी, blebs, और टूट सहित रूपात्मक विवरण पर विचार । इस स्कोरिंग प्रणाली के साथ, शोधकर्ता सूक्ष्म आयु से संबंधित परिवर्तनों के साथ-साथ अधिक नाटकीय रासायनिक-प्रेरित परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं । अंत में, हम कमेंट्री के साथ छवियों का एक अभ्यास सेट प्रदान करते हैं जिसका उपयोग इस विधि के लिए नए शोधकर्ताओं की स्कोरिंग स्थिरता का आकलन करने, कैलिब्रेट करने और मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह भीतर और बीच में सुधार करना चाहिए प्रयोगशाला निरंतरता, बढ़ती कठोरता और प्रजनन क्षमता ।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) एक तेजी से आम न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग है जोदुनियाभर में 10 मिलियन व्यक्तियों को प्रभावित करता है। पुरुषों और पुराने व्यक्तियों पीडी के विकास के लिए एक उच्च जोखिम में हैं; रोग के लिए शुरुआत की औसत उम्र 60 वर्ष है, और पीडी घटना सामान्य आबादी में 0.3% घटना से80वर्ष से अधिक उम्र के व्यक्तियों में 3% तक चढ़ती है1 ,2. यद्यपि पीडी पैथोलॉजी के विवरण पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं, इस प्रगतिशील विकार में मिडब्रेन के सब्सटेंटिया निग्रा क्षेत्र में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स का नुकसान शामिल है। इस न्यूरोनल हानि के परिकल्पना तंत्र में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन2शामिल हैं। रोग के कारणों और जोखिम कारकों का अभी भी पता लगाया जा रहा है, लेकिन पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों का एक संयोजन शामिल1। उदाहरण के लिए, अध्ययनों में आजीवन कीटनाशक उपयोग और पीडी के बीच सकारात्मक संबंध पाए गए हैं, साथ ही पारिवारिक पीडी1,3के लिए आनुवंशिक संवेदनशीलता भी मिली है।

सी एलिगेंस मॉडल सिस्टम, मूल रूप से न्यूरोबायोलॉजी अनुसंधान 4 के लिए भाग में विकसित किया गया है, वीवो मेंडोपामिनेर्गिक न्यूरॉन हानि के मूल्यांकन के लिए अच्छीतरहसे अनुकूल है। नास और उनके सहयोगियों ने डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन 5 के लिए सी एलिगेंस के उपयोग का बीड़ाउठायाहै, और कई समूहों ने पीडी औरडोपामिनेर्गिक डिसफंक्शन6,7,8,9,10, 11, 12, 13,14,16,17के लिए एक सफल मॉडल के रूप में कीड़ा को अपनायाहै। ,18,19,20. सी एलिगेंस एक ही कारण है कि वे जीव विज्ञान के अन्य क्षेत्रों के लिए इस तरह के एक लोकप्रिय मॉडल जीव हैं के कई के लिए अच्छा न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल हैं; उनकी पारदर्शिता सेलुलर प्रक्रियाओं के वीवो अध्ययन में अनुमति देती है, कीड़े में आनुवंशिक हेरफेर अपेक्षाकृत त्वरित और आसान है, उनके पास लगभग तीन दिनों का एक छोटा पीढ़ी का समय होता है, और वे21को बनाए रखने में आसान होते हैं । अधिकांश पीडी कृमि मॉडल तीन श्रेणियों में से एक में आते हैं: आयु आधारित मॉडल, रासायनिक मॉडल और आनुवंशिक मॉडल। कीड़े की आबादी को सिंक्रोनाइज करने की क्षमता उम्र से संबंधित न्यूरोडिजनरेशन के अध्ययन के लिए उम्र से संबंधित न्यूरोडीजनरेशन के अध्ययन के लिए उम्र से संबंधित न्यूरोडीजनरेशन के अध्ययन के लिए उम्र आधारित-उम्र से जुड़े न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के मॉडल के लिए अनुमति देती है, जैसे पीडी22। 6-हाइड्रोक्सीडोपामाइन (6-ओएचडीए), रोटेनोन, और 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1, 2,3,6-टेट्राहाइड्रोहाइड्रिडीन (एमपीटीपी)22सहित विभिन्न प्रकार के रसायनों का उपयोग करके पीडी-जैसे न्यूरोनल दोषों को उत्प्रेरण करने वाले रासायनिक एक्सपोजर स्थापित किए गए हैं । कीड़े भी सफलतापूर्वक पीडी के आनुवंशिक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है; चुनिंदा तंत्रिका जीन नॉकआउट के साथ उपभेदों विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिवरोगों मॉडलकर सकते हैं 1,4. आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों, या "जीन-पर्यावरण बातचीत" के संयोजन, जोपीडी2, 17, 23, 24,25,26,27,28में प्रमुख भूमिका निभातेहैं, सी एलिगेंसका उपयोग करके कई समूहों द्वारा जांच की गई है। अंत में, उम्र से संबंधित डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन भी29,30देखी गई है। यदि फ्लोरोसेंट इमेजिंग में एक उपयुक्त तंत्रिका ट्रांसजेनिक तनाव का उपयोग कर रहे हैं, तो इनमें से किसी भी पीडी वर्म मॉडल का उपयोग डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

न्यूरोनल आकृति विज्ञान में परिवर्तनों की मात्रा बताना न्यूरोडीजेनेरेटिव अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण घटक है। सी एलिगेंसमें, कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उपभेदों का उपयोग रूपात्मक परिवर्तनों और न्यूरॉन्स के नुकसान की कल्पना करने के लिए किया गया है। न्यूरोनल इमेजिंग के लिए उपयुक्त उपभेदों में सेल-विशिष्ट प्रमोटरों से जुड़े फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सुविधा है। डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन परख के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP,rol-6)] तनाव का उपयोग किया है, जिसमें डैट-1 जीन में हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग है, जो डोपामिनेर्गिक्स में व्यक्त किया गया है। ध्यान दें कि BY200 के रोलर फेनोटाइप में बहुत कम पेनेट्रेंस है और शायद ही कभी देखा जाता है। इमेजिंग के इस प्रकार के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य सामान्य उपभेदों में BY250[डैट-1p::GFP], शामिल हैं BY273 [baEx18 [dat-1p:: GFP + dat-1p::WT α-syn], BZ555 [egIs1[dat-1p:GFP]],और कई अन्य लोगों को Caenorhabditis आनुवंशिकी केंद्र (CGC) सेउपलब्ध है1,21,22,29 . ये उपभेद आमतौर पर डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के सभी तीन वर्गों के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं: सेफेलिक (सीईपी), पूर्वकाल डेमिरिड (एडीई), और पोस्टडिरिड (पीडीई) न्यूरॉन्स। सी एलिगेंस स्वाभाविक रूप से अल्फा सिन्यूक्लिन प्रोटीन को व्यक्त नहीं करता है, लेकिन BY273 जैसे उपभेदों को इसे व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है। हालांकि, हम ध्यान दें कि हमारे द्वारा मौजूद स्कोरिंग सिस्टम BY200 का उपयोग करके विकसित किया गया था, जो अल्फा सिन्यूक्लिन को व्यक्त नहीं करता है, और उपयोग करने से पहले उस तनाव (या किसी अन्य नए तनाव) के साथ मान्य होने की आवश्यकता होगी। अतिरिक्त डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स पुरुषों में मौजूद हैं, लेकिन शायद ही कभी माना जाता है क्योंकि पुरुषों में आम तौर पर सी एलिगेंस आबादी का <1% शामिल होता है। यहां, हम सी एलिगेंस के प्रमुख क्षेत्र में पाए जाने वाले चार सीईपी डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित करते हैं। न्यूरॉन्स का यह सेट आसानी से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत स्थित है, दोनों हर्मेफ्रोडिट और पुरुष कीड़े में मौजूद है, आमतौर पर ऑटो-फ्लोरेसेंस के अन्य क्षेत्रों के साथ ओवरलैप नहीं होता है, और आमतौर पर कृमि अध्ययन में सूचित किया जाता है। विशेष रूप से, हालांकि इन न्यूरॉन्स myelinated नहीं हैं, सीईपी पृष्ठीय (सीईपीडी) न्यूरॉन्स सीधे छद्म शरीर तरल पदार्थ के संपर्क में हैं, जहां सीईपी वेंट्रल न्यूरॉन्स के रूप में नहीं कर रहे हैं । सीईपी dendrites का एक स्वस्थ सेट आम तौर पर अपेक्षाकृत सीधे, निर्बाध लाइनों के रूप में प्रदर्शित करता है । डिजिट डेंड्राइट्स अनियमितताओं और क्षति के संकेतों का कोई संयोजन दिखा सकता है, जिसमें डेनड्राइट की रेखा के साथ ब्लेड नामक स्पष्ट डॉट्स और डेनड्राइट की रेखा में टूट जाता है। पतन के अलग - अलग स्तर पर सीईपी न्यूरॉन्स के उदाहरण चित्र 1 में देखे जा सकते हैं।

यद्यपि डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन सी एलिगेंस प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या द्वारा किया जा रहा है, लेकिन डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन क्षति29, 31, 32,33,34की मात्रा निर्धारित करने के विश्लेषणात्मक तरीकों में एक बड़ा अंतर रहा है। कई प्रकाशित अध्ययनों में सीईपी सोमा की उपस्थिति या अनुपस्थिति के बारे में बताया गया है जिसमें अपक्षयी बनाम विशिष्ट या जंगली प्रकार के न्यूरॉन्स31,32की बाइनरी स्कोरिंग प्रणाली है । ये स्कोरिंग विधियां कुछ तनावों की पहचान कर सकती हैं जो न्यूरोडिजेनरेशन को प्रेरित करते हैं लेकिन अधिक सूक्ष्म न्यूरोनल क्षति की प्रगति के विवरण की मात्रा नहीं बता सकते हैं, या अद्वितीय रसायनों या अन्य चरों द्वारा प्रेरित न्यूरोडिजेनरेशन के बीच मतभेदों का आसानी से पता नहीं लगा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सेल निकायों पर केंद्रित स्कोरिंग सिस्टम क्षति के कम गंभीर स्तर या कोशिका के केवल हिस्से को प्रभावित करने वाले न्यूरोनल क्षति के प्रति संवेदनशील नहीं हो सकते हैं, जैसे कि डेंड्राइट। चूंकि डेन्ड्राइट में रासायनिक तनावों के जवाब में लगातार पता लगाने योग्य मॉर्फोलॉजिक परिवर्तनों की सबसे बड़ी श्रृंखला प्रतीत होती है, इसलिए हमने उन्हें अपने विश्लेषण के लिए आधार के रूप में चुना है। हम यहां जो स्कोरिंग सिस्टम प्रस्तुत करतेहैं,उसे डेंड्राइट आकृति विज्ञान आधारित बहु-बिंदु तराजू से संशोधित किया जाता है जिसका उपयोग पहले हमारी प्रयोगशाला29,33में किया जाता था। यह प्रणाली इन पांच और छह सूत्री तराजू को सात सूत्री पैमाने पर विस्तारित करती है ताकि आयु से संबंधित रूपात्मक परिवर्तनों का लेखा-जोखा हो, जैसे कि पुराने वयस्क dendrites में गुत्थियों की अधिक अपेक्षित संख्या, और गंभीर क्षति और पूर्ण डेंड्राइट हानि के बीच अंतर करने के लिए । इस स्कोरिंग प्रणाली को शुरू करने का उद्देश्य न्यूरोनल क्षति के सभी स्तरों पर न्यूरोडिजेनरेशन की एक व्यापक तस्वीर पर कब्जा करने की क्षमता प्रदान करना और सी एलिगन डोपामिनर्जिक न्यूरोडिजेनरेशन अनुसंधान में स्थिरता का समर्थन करने के लिए एक सार्वभौमिक प्रणाली प्रदान करना है। क्योंकि स्कोरिंग स्वाभाविक रूप से व्यक्तिपरक है, यह स्कोरिंग व्यक्तियों के बीच स्थिरता को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है, और मैनुअल चकाचौंध या एक स्वचालित चकाचौंध कार्यक्रम३५का उपयोग कर छवियों की पहचान के लिए गणक अंधा करने के लिए । निरंतरता में सुधार करने के लिए, हम प्रशिक्षण छवियों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं और हमारे स्कोरिंग सिस्टम को विस्तार से प्रदर्शित करने के लिए JoVE की वीडियो क्षमताओं का उपयोग करते हैं। हम एक ऐसी प्रणाली का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो दोनों स्वचालित अंधा स्कोरिंग की अनुमति देता है और स्कोरर को छवियों के सबसेट को फिर से स्कोर करके उसकी स्कोरिंग निरंतरता की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब कई वैज्ञानिकों से डेटा के संयोजन या तुलना, या स्कोरिंग के लिए नए वैज्ञानिकों को प्रशिक्षित ।

Protocol

1. इमेजिंग के लिए कीड़े तैयार करें

नोट: संबंधित JoVE वीडियो अनुच्छेद31देखें: https://www.jove.com/v/835/

  1. प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए, पिपेट या इमेजिंग माइक्रोस्कोप के साथ संगत एक इमेजिंग मंच के लिए 20 से 30 कीड़े उठाओ। अधिकांश आम प्लेटफार्मों में 2% एग्राज्ड जेल पैड शामिल हैं जो ग्लास स्लाइड पर एक कवरस्लिप31 और 96-अच्छी प्लेटों के साथ घुड़सवार हैं, जिनमें तरल माध्यम के 100 माइक्रोन से कम या उससे कम मात्रा होती है।
  2. कीड़े में 30-90 एमएम सोडियम एजाइड (एनएएन3),2.5-8.5 एमएम लेवामिसोल एचसीएल या अन्य लकवा एजेंट जोड़कर कीड़े को लकवा मार ें। यदि तरल में लकवा, तो एग्वैर उठे पैड पर लकवा ग्रस्त एजेंट की उच्च एकाग्रता का उपयोग करें। मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर टैप करें।
  3. कीड़े को पूरी तरह से लकवा मारने दें।
    नोट: इसमें कई मिनट लग सकते हैं।

2. इमेज डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स

  1. जेड-स्टैक लेने में सक्षम इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकल रंग जीएफपी फ्लोरेसेंस के तहत कीड़े के सिर क्षेत्रों का पता लगाएं।
    1. एक्सपोजर और अपर्चर सेटिंग्स के प्रति सचेत रहें; डेंड्राइट्स के अति-धैर्य से बचें और परीक्षणों में सेटिंग्स को लगातार रखें। स्पष्ट दृश्य के लिए आवश्यकतानुसार डेंड्राइट्स को उज्ज्वल बनाएं; यह आम तौर पर सोमा के अति-धैर्य में परिणाम देता है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में शामिल छवियों को 400x आवर्धन का उपयोग करके कैप्चर किया गया था।
  2. ऊपरी और निचली सीमा को खोजने के लिए ध्यान के माध्यम से स्क्रॉल करें जहां dendrites स्पष्ट हैं। एक जेड-स्टैक छवि कैप्चर के लिए इन्हें ऊपरी और निचली सीमा के रूप में सेट करें।
  3. प्रत्येक कीड़ा के लिए जेड-स्टैक छवियों को कैप्चर करने के लिए क्लिक करें।
    नोट: सभी निम्नलिखित चरण किसी भी समय किए जा सकते हैं.

3. स्कोरिंग के लिए डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन छवियां तैयार करें

  1. प्रत्येक जेड-स्टैक के लिए, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर या बाहरी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि फ़ाइल खोलें, सॉफ्टवेयर में स्टैक लोड करें, और स्टैक को एक चपटी छवि में सेक करें।
  2. उपचार समूहों के बीच और भीतर मैन्युअल रूप से या स्वचालित चकाचौंध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अंधा छवियां।

4. स्कोर डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन डेंड्राइट्स

  1. एक समय में एक न्यूरॉन छवि के साथ काम करते हैं। ब्लेड, ब्रेक और झुकता, किंक और घटता सहित अनियमितताओं का आकलन करने के लिए चार सीईपी डेंड्राइट्स में से एक चुनें। जब नाक छवि के शीर्ष पर होती है तो बाईं ओर से स्कोरिंग स्कोरिंग में दोहराने की क्षमता सुनिश्चित करने की सिफारिश की जाती है।
  2. निम्नलिखित दिशानिर्देशों का उपयोग करके, डेंड्राइट को एक स्कोर मूल्य असाइन करें। प्रतिनिधि स्कोरिंग छवि उदाहरण के लिए चित्रा 1 देखें।
    0- कोई नुकसान नहीं, "सही" न्यूरॉन्स
    1- अनियमित (किंक, वक्र्स आदि)
    2- <5 ब्लेब्स
    3- 5-10 ब्लेब्स
    4- >10 ब्लेब्स और/या टूटना कुल डेंड्राइट का <25% निकाल रहा है
    5- टूटना, 25-75% डेंड्राइट हटाया
    6- टूटना, >75% डेंड्राइट हटाया
    1. यदि एक ही डेंड्राइट (यानी, किंक और ब्लेब्स) के भीतर कई मानदंडों को पूरा किया जाता है, तो उच्चतम लागू स्कोर आवंटित करें।
    2. छवि कैप्चर, अन्य डेंड्राइट्स के साथ ओवरलैपिंग आदि के साथ मुद्दों के कारण, स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं दे रहे हैं कि dendrites स्कोर न करें। यदि एक चपटे जेड स्टैक छवि पर ज़ूम इन कर रहे हैं, तो झूठे ब्लेड जैसा बढ़े हुए पिक्सेल के प्रति सचेत रहें।
  3. प्रत्येक डेंड्राइट के लिए दोहराएं। सभी छवियों के लिए दोहराएं।
  4. सभी स्कोर रिकॉर्ड करें। स्कोर इस समय संयुक्त राष्ट्र अंधा हो सकता है ।

5. तैयार करें और वर्तमान डेटा

  1. प्रत्येक न्यूरोडिजेनरेशन स्कोर को सौंपे गए प्रत्येक उपचार समूह में डेंड्राइट्स की कुल संख्या की गणना करें। प्रत्येक उपचार समूह में कुल रन बनाए dendrites की संख्या की गणना करें।
  2. उपचार समूह में बनाए गए डेंड्राइट्स की कुल संख्या द्वारा न्यूरोडिजेनरेशन स्कोर टैलियों को विभाजित करें। प्रत्येक न्यूरोडिजेनरेशन स्कोर पर एक उपचार समूह के भीतर dendrites के अनुपात के रूप में डेटा वर्तमान।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण करें

  1. प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर या मैन्युअल रूप से उपयोग करके, सभी उपचार समूह जोड़े के बीच स्वतंत्रता के लिए एक ची-चुकता परीक्षण चलाएं तुलना की जाए। जब उचित हो, तो कई तुलनाओं के लिए खाते में तुलना की गई प्रयोगात्मक समूहों की संख्या के अनुसार पी-वैल्यू का बोनफेरोनी सुधार लागू करें।
    नोट: यह परीक्षण दो समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करेगा, लेकिन अंतर के प्रकार का विवरण आंख से योग्य होना चाहिए ।
    1. प्रयोगात्मक समूहों के बीच तुलना का चयन करें। यह प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अलग-अलग होगा।
      नोट: हमारे प्रयोगों में, आमतौर पर, नियंत्रण उनके संबंधित उपचार समूहों की तुलना में कर रहे हैं, सभी नियंत्रणों की तुलना की जाती है, और सभी उपचारों की तुलना की जाती है ।

7. डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन इमेजेज के अभ्यास सेट के साथ स्कोरिंग का अभ्यास करें

  1. कमेंट्री और स्कोर कुंजी के साथ हमारे स्कोरिंग सिस्टम की पूरी श्रृंखला में पेश न्यूरॉन छवियों के एक सेट के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें। इस अभ्यास सेट का उद्देश्य शोधकर्ताओं को इस विधि के लिए नया प्रशिक्षित करना और अंतर-रेटर विश्वसनीयता सुनिश्चित करना है।

8. वैकल्पिक प्रोटोकॉल विकल्पों पर विचार करें

  1. जेड-स्टैक कैप्चर करने के बजाय, माइक्रोस्कोप पर पूर्ण स्कोरिंग, बिना बचत या स्टैकिंग छवियों के।
    नोट: यह विकल्प प्रौद्योगिकी क्षमताओं के लिए आवश्यकताओं को कम कर देता है, लेकिन बाद के समय में लौटने के लिए न्यूरॉन छवियों का संग्रह बनाने के विकल्प को हटा देता है, मैनुअल चकाचौंध की आवश्यकता होती है, और केवल उपचार समूहों के बीच और नहीं चकाचौंध की अनुमति देता है।
  2. स्टैक प्रति एक संकुचित छवि बनाने के बजाय, प्रत्येक जेड-स्टैक की छवियों के माध्यम से स्क्रॉल करके पूरा स्कोरिंग।
    नोट: यह विकल्प कुछ स्कोरर के लिए आसान हो सकता है और यह इमेजिंग के दौरान चले गए कीड़े पर झूठे ब्लेड देखने के लिए जोखिम को कम करता है और ओवरलैपिंग डेंड्राइट्स स्कोरिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन मैनुअल चकाचौंध की आवश्यकता होती है और केवल उपचार समूहों के भीतर नहीं चकाचौंध की अनुमति देता है।

Representative Results

यहां वर्णित स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग एल 4 लार्वा चरण BY200 [vtIs1 (dat-1p):: GFP, rol-6)] सी एलिगेंस में न्यूरोडिजेनरेशन का आकलन करने के लिए किया गया था। इस प्रयोग के परिणाम चित्र 2 में दिखाए गए हैं और हमारे स्कोरिंग सिस्टम की डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन क्षति के चर स्तरों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने की क्षमता का प्रतिनिधित्व करते हैं। रोटेनोन एक स्वाभाविक रूप से होने वाली इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसर है जिसका उपयोग मैं कुछ कीटनाशकों, पिसिसाइड्स और कीटनाशकों36, 37में उपयोग करता हूं। ध्यान दें कि रोटेनोन जैसे जहरीले रसायनों के साथ काम करना स्वाभाविक रूप से खतरनाक है, और सभी प्रयोगशालाओं को अपने संस्थानों द्वारा निर्धारित सभी उपयोग और निपटान नियमों का पालन करना चाहिए। इस प्रयोग में, दो खुराकों पर तरल रोटेनोन एक्सपोजर, 0.03 माइक्रोन और 0.5 माइक्रोन, एक नियंत्रण समूह के साथ, अंडे38फसल के लिए 0.5 मीटर सोडियम हाइड्रोक्साइड/ अंडे 0.25% डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ पूर्ण K-मध्यम33, 39 में रची गई, और कीड़े मध्य-एल 4 लार्वा चरण तक ~ 48 घंटे तक तरल में रहे, जिस बिंदु पर उन्हें रासायनिक जोखिम से हटा दिया गया, और तैयार, इमेजकिया गया, और, एक संदर्भ के रूप में चित्र 1 का उपयोग करके, ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल चरणों के अनुसार रन बनाए। 0.5 माइक्रोनवन की उच्च खुराक के लिए, अंडे को रोटेनोन-प्रेरित विकासात्मक देरी के लिए खाते में 24 घंटे पहले काटा गया था और यह सुनिश्चित करते हैं कि इमेजिंग के समय सभी कीड़े चरण सिंक्रोनाइज्ड थे।

चित्रा 2 आगे दर्शाता है कि हमारी प्रयोगशाला इस स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा की कल्पना कैसे करती है। इस आंकड़े में, एक खुराक पर निर्भर न्यूरोडिजेनरेशन प्रतिक्रिया की सराहना की जा सकती है, और स्कोर वितरण का विशिष्ट टूटना स्पष्ट रूप से प्रदर्शित होता है। ये विशेष परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि न्यूरोनल क्षति विभिन्न तरीकों से कैसे पेश कर सकती है। उदाहरण के लिए, 0.03 माइक्रोनोन-उजागर समूह में नियंत्रण समूह की तुलना में 0 के स्कोर के साथ स्वस्थ न्यूरॉन्स का अनुपात कम हो गया है, फिर भी 5 स्कोर का अनुपात कम हो गया है। प्रयोगात्मक समूहों के बीच स्कोर वितरण के बारे में इस विस्तार का पता लगाना हमारे सात सूत्री स्कोरिंग प्रणाली की संवेदनशीलता पर प्रकाश डाला गया । इस डेटा प्रोटोकॉल के अनुसार सांख्यिकीय महत्व के लिए विश्लेषण किया गया था, एक Bonferroni सुधार के साथ स्वतंत्रता के लिए एक ची चुकता परीक्षण का उपयोग कर ।

Figure 1
चित्रा 1। डोपामाइन न्यूरॉन रूपात्मक परिवर्तन और पतन स्कोरिंग सिस्टम प्रतिनिधि छवियां। इस समेकित चार्ट में प्रत्येक स्कोर पर न्यूरॉन्स के उदाहरण होते हैं और स्कोरिंग के लिए संदर्भ के रूप में उपयोग किए जाने का इरादा है। यहां, प्रत्येक लेबल स्कोर प्रत्येक कीड़े में सबसे क्षतिग्रस्त डेंड्राइट से मेल खाता है, जैसा कि प्रत्येक पैनल में तीर द्वारा इंगित किया गया है। इन छवियों को BY200 C. elegansके साथ इस कागज में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर लिया गया । कृपया इस स्कोरिंग विधि के लिए उन नए प्रशिक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कमेंट्री के साथ रन बनाए छवियों के एक सेट के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। ROTenone जोखिम के बाद BY200 L4 डोपामाइन न्यूरॉन आकृति विज्ञान और अध: पतन स्कोर। यह आंकड़ा यहां वर्णित स्कोरिंग विधियों का उपयोग करके विश्लेषण किए गए प्रतिनिधि परिणामों को दिखाता है। उच्च रोटेनोन एक्सपोजर सांद्रता के साथ क्षतिग्रस्त डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के अधिक से अधिक अनुपात को सांख्यिकीय रूप से स्वतंत्रता के लिए ची-चुकता परीक्षणों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। नियंत्रण समूह की तुलना में दोनों रोटेनोन उपचार समूहों ने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण पी-मान प्राप्त किए। विभिन्न अक्षर सांख्यिकीय अंतर को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 1. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फाइल 2। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि सी एलिगेंसमें डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन मॉर्फोलॉजिक परिवर्तन और पतन के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में विकसित सात सूत्री पैमाने का उपयोग कैसे किया जाए। हमने कीड़े में डोपामिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन कार्य के विश्लेषण को मानकीकृत करने के लिए इस पैमाने को एक उपकरण के रूप में बनाया और साझा किया। अत्यधिक प्रचलित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शामिल रास्तों का अध्ययन करने के महत्व को समझते हुए, कई जांचकर्ता न्यूरोबायोलॉजी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सी एलिगेंस मॉडल की उपयुक्तता का लाभ उठाते हैं ताकि न्यूरोडिजनिंग29,31,32,33का अध्ययन किया जा सके। हालांकि, अभी तक कीड़े में न्यूरोडिजेनरेशन अनुसंधान में न्यूरॉन क्षति की मात्रा निर्धारित करने में बड़ी भिन्नता को कम करने का प्रयास किया जाना बाकी है। इस प्रकार यहां प्रस्तुत स्कोरिंग प्रणाली का उद्देश्य विश्लेषण में निरंतरता को बढ़ावा देना और अध्ययनों के बीच तुलना के लिए अनुमति देना है ।

हमारे स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग सी एलिगेंस प्रयोगों से प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है जो सेल-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करते हैं जो डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं - विशेष रूप से सीईपी डेन्ड्रिट्स। विशेष रूप से, डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के जीएफपी दृश्य के लिए डैट-1 जीन पर टैग किए गए उपभेद इस स्कोरिंग प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं, हालांकि पीडी के कई अन्य संबंधित ट्रांसजेनिक मॉडल मौजूद हैं। यह संभव है कि यह स्कोरिंग प्रणाली उन मॉडलों के साथ भी उपयोगी होगी; हालांकि, इसे उनका उपयोग करने से पहले मान्य किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, यह संभव है (लेकिन हमारे ज्ञान के लिए परीक्षण नहीं) एमसीएचरी के साथ उपभेदों को इस प्रोटोकॉल के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं किया जा सकता है क्योंकि रीचेरी एकत्रीकरण ब्लेब्स से अविवेच्य हो सकता है या सेल तनाव का कारण बन सकता है। पीडी और संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के सभी विशिष्ट मॉडलों पर कमेंट्री प्रदान करने के बजाय, हम न्यूरोडिजनरेशन डेटा के स्कोरिंग पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल केवल न्यूरोनल आकृति विज्ञान पर केंद्रित है और सोमा के फ्लोरेसेंस स्तर पर विचार नहीं करता है। न्यूरोडिजनरेशन परखों को न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों, जैसे लोकोमोशन, उम्र और स्वास्थ्य-अवधि के प्रयोगों के लिए प्रासंगिक व्यवहार परख के साथ किया जा सकता है। स्थापित रासायनिक, आयु आधारित, और पीडी के आनुवंशिक मॉडल में पतन के स्तर की भी पुष्टि की जा सकती है और इस स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर विस्तृत । पीडी और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े मॉडल, योगदानकर्ताओं और रास्तों को मापने से इन विकारों के बारे में वैज्ञानिक ज्ञान बढ़ सकता है और प्रभावित व्यक्तियों की बढ़ती आबादी का प्रबंधन करने की दिशा में इंगित हो सकता है। साहित्य में तुलनीय न्यूरोडिजेनरेशन परिणाम होने से इस लक्ष्य का समर्थन करने में महत्वपूर्ण है।

इस स्कोरिंग सिस्टम से प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने के लिए, हम एन = 1 के रूप में बनाए गए प्रत्येक डेंड्राइट पर विचार करने का प्रस्ताव करते हैं, क्योंकि एक ही कीड़े के भीतर विभिन्न न्यूरॉन्स अक्सर उपचार के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया देते हैं। यह इस तथ्य से प्रेरित हो सकता है कि केवल सीईपीडी न्यूरॉन्स सीधे छद्म शरीर के तरल पदार्थ के संपर्क में हैं। इस प्रकार, यह प्रयोगात्मक समूहों के स्कोर प्रसार को प्रत्येक समूह में बनाए गए dendrites की कुल संख्या के अनुपात के रूप में प्रदर्शित करने की अनुमति देता है। यह विधि, यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणामों के लिए उपयोग की जाती है, उपचार समूहों में आसान तुलना की अनुमति देती है, एक ही कीड़े के भीतर अंतर प्रतिक्रियाओं के लिए खाते हैं, और आसानी से कई तुलनाओं के लिए बोनफेरोनी सुधार द्वारा बधाई दी गई ची-चुकता परीक्षण के साथ विश्लेषण किया जाता है। न्यूरॉन स्कोर रिकॉर्ड करने और प्रतिशत की गणना के लिए एक उदाहरण टेम्पलेट अनुपूरक फ़ाइल 2में पाया जा सकता है। हमने डेटा विश्लेषण के लिए दो वैकल्पिक तरीकों पर विचार किया है और प्रत्येक में खामियों की पहचान की है। पहला विकल्प प्रत्येक कीड़े के लिए चार सीईपी न्यूरॉन्स के स्कोर का औसत है। यह डेटा को पैरालेट्रिज़ करता है; हालांकि, यह बढ़ते स्कोर के साथ एक रैखिक संबंध मानता है और एक ही कीड़े के भीतर उपचार के जवाब में किसी भी विविधताओं के बारे में जानकारी खो देता है। दूसरा विकल्प प्रत्येक कीड़े के लिए सभी चार सीईपी न्यूरॉन्स के स्कोर का योग करना है, जो डेटा को भी पैरालेट्रिज़ करता है। यह अभी भी स्कोर के बीच एक रैखिक संबंध मानता है, हालांकि यह संभव स्कोर के मापदंडों का विस्तार करके औसत स्कोर की तुलना में प्रत्येक कीड़ा के भीतर मतभेदों के लिए अधिक सक्षम खाते हैं। हालांकि व्यक्तिगत शोधकर्ता अपने डेटा को प्रदर्शित करने का फैसला करते हैं, परिणामों को तनाव और कृमि युग जैसे प्रयोगात्मक चर के साथ विचार किया जाना चाहिए; उदाहरण के लिए, पुराने कीड़े में पतन का उच्च अपेक्षित आधारभूत स्तर होता है।

चूंकि इन न्यूरोडिजेनरेशन स्कोर परिणामों की व्याख्या की जाती है, शोधकर्ताओं को स्कोरिंग विधि की कुछ चेतावनी और सीमाओं के बारे में भी पता होना चाहिए। सबसे पहले, स्कोरिंग के लिए उपयुक्त छवियों को कैप्चर करने के लिए कुछ तकनीकी आवश्यकताएं आवश्यक हैं। इमेजिंग माइक्रोस्कोप फ्लोरेसेंस चैनलों और आवर्धन और एक्सपोजर सेटिंग्स का समर्थन करना चाहिए जो सीईपी डेन्ड्रेट्स के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, तकनीकी आवश्यकताओं को प्रोटोकॉल समायोजन द्वारा कम किया जा सकता है जैसे कि सूक्ष्म क्षेत्र के माध्यम से लाइव छवियों को स्कोर करना, बजाय छवियों को संग्रहीत करने और बाद में बनाए जाने के लिए। दूसरा, इस डेटा के लिए संभावित सांख्यिकीय विश्लेषण विधियां सीमित हैं क्योंकि डेटा गैर-पैरामेट्रिक है। स्कोरिंग स्केल को प्रगतिशील माना जाता है, लेकिन संख्यात्मक नहीं माना जा सकता क्योंकि असतत स्कोर विकल्प हैं और स्कोर वृद्धि जैविक कार्य के संबंध में एक दूसरे के लिए आवश्यक रूप से आनुपातिक नहीं है। इन कारणों से, स्वतंत्रता के लिए ची-चुकता परीक्षण इस प्रकार के डेटा के लिए सबसे उपयुक्त हैं, जिसका अर्थ है कि सांख्यिकीय विश्लेषण किसी भी सांख्यिकीय महत्व की दिशा निर्धारित करने के लिए पर्यवेक्षक पर निर्भर करता है । विशेष रूप से, ची-चुकता परीक्षण भी केवल स्कोर वितरण में अंतर के लिए विश्लेषण करता है और विशिष्ट स्कोरिंग श्रेणियों में मतभेदों के सबूत प्रदान करने में असमर्थ है। अंत में, इस स्कोरिंग प्रणाली द्वारा निर्धारित रूपात्मक परिवर्तनों के कार्यात्मक महत्व का अभी तक अध्ययन किया जाना है ।

इस स्कोरिंग प्रणाली के विकास से प्रेरित भविष्य के निर्देशों में जैविक ठिकानों और व्यक्तिगत न्यूरॉन स्कोर के साथ सहसंबंधों का निर्धारण शामिल है। स्कोरिंग पैमाने पर सभी बिंदुओं के कार्यात्मक महत्व (जैसे न्यूरोनल सिग्नलिंग, कृमि व्यवहार) का अध्ययन करने से सूचित किया जाएगा कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के कारणों और परिणामों को समझने और रोकथाम और उपचार विकल्प विकसित करने के लिए लागू निष्कर्षों के परिणामों का बेहतर अनुवाद कैसे किया जाए। कीड़े में न्यूरोडिजेनरेशन पर भविष्य के शोध का उद्देश्य कृमि के आकार और आकार जैसे अन्य आकृति विज्ञान के कनेक्शन की खोज करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, न्यूरोडिजनरेशन अनुसंधान को अन्य रिपोर्टर सी एलिगेंस उपभेदों का अध्ययन करके समर्थित किया जा सकता है ताकि बायोनेरेमेटिक्स, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान जैसे अंत बिंदुओं को मापने के लिए तनाव हो सके।

Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

हम इयान टी Ryde स्वीकार करना चाहते हैं, स्कोरिंग पैमाने के विकास के लिए योगदान के लिए और इस पांडुलिपि के निर्माण के दौरान उनके समर्थन के लिए । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (T32ES021432 समर्थित KSM, और P42ES010356 से जेएनएम) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate VWR 29442-056 For imaging in wells
Blinder Solibyte Solutions LLC Free software that blinds between and within uploaded sets of image files
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] Aschner Lab C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors
Available upon request from the Meyer lab
complete K-medium 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol
Coverslips 22x22mm, No.1 glass VWR VistaVision 48366-067 For imaging on slides
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301 Solvent for rotenone exposures
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. Sotware for image manipulation
Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope Keyence Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging
Microscope Slides 3x1" VWR VistaVision 16004-420 For imaging on slides
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Electron transport chain complex I inhibitor
Sodium Azide (NaN_3) Sigma-Aldrich S2002 Paralytic
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S2770 For bleach lysis
Sodium Hypochlorite VWR RC7495.5-32 For bleach lysis
Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) Sigma-Aldrich L9756 Paralytic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson's Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
  2. Hayes, M. T. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
  3. Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson's disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
  4. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1973).
  5. Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
  6. Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
  7. Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
  8. Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson's disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
  9. Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R. Manganese and C. elegans in Parkinson's disease. Parkinson's Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. Nass, R., Przedborski, S. , Elsevier Inc. (2008).
  10. Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson's Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
  11. Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson's Disease in C. elegans. Journal of Parkinson's Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
  12. Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson's disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
  13. Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
  14. Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
  15. Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
  16. Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
  17. Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
  18. Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
  19. Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
  20. Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
  21. Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
  22. Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson's disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
  23. Lesage, S., Brice, A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
  24. Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson's Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
  25. Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson's disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson's Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
  26. Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
  27. Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
  28. Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
  29. Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
  30. Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson's disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
  31. Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
  32. Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
  33. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
  34. Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
  35. Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
  36. Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
  37. National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
  38. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
  39. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
  40. Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 177
<em>कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस</em> में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन रूपात्मक परिवर्तन और पतन के स्तर की मात्रा
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bijwadia, S. R., Morton, K., Meyer,… More

Bijwadia, S. R., Morton, K., Meyer, J. N. Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (177), e62894, doi:10.3791/62894 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter