Summary
I denne artikel viser vi, hvordan du bruger et syv-punkts scoringssystem til konsekvent at kvantificere ændringer i dopaminergisk neuron dendritmorfologi i C. elegans. Dette system er beregnet til analyser af dopaminergiske neurodegeneration assays udnytte genetiske, kemiske, og aldersbaserede modeller af neurodegenerative lidelser.
Abstract
Dopamin neuron tab er involveret i patologi af Parkinsons sygdom (PD), en meget udbredt neurodegenerativ lidelse, der påvirker over 10 millioner mennesker på verdensplan. Da mange detaljer om PD ætiologi forbliver ukendt, undersøgelser undersøger genetiske og miljømæssige bidragydere til PD er nødvendige for at opdage metoder til forebyggelse, forvaltning og behandling. Korrekt karakterisering af dopaminergic neuronal tab kan være relevant ikke kun for PD forskning, men til andre stadig mere udbredte neurodegenerative lidelser.
Der er etableret genetiske og kemiske modeller af dopaminergisk neurodegeneration i Caenorhabditis elegans model system, med nem visualisering af neurobiologi understøttet af nematoderne gennemsigtighed og invariant neuronal arkitektur. Især kan hermafroditiske C. elegans dopaminerge neuronmorfologiske ændringer visualiseres ved hjælp af stammer med fluorescerende journalister drevet af cellespecifikke promotorer som dat-1 dopamintransporter-genet, som udelukkende udtrykkes i deres otte dopaminerge neuroner.
Med mulighederne i dette modelsystem og den passende teknologi har mange laboratorier studeret dopaminerg neurodegeneration. Der er dog lidt konsistens i den måde, dataene analyseres på, og meget af den nuværende litteratur bruger binære scoringsanalyser, der fanger tilstedeværelsen af degeneration, men ikke de fulde detaljer om progressionen af neurontab. Her introducerer vi et universelt pointsystem til vurdering af morfologiske ændringer og degeneration i C. elegans' cephaliske neuron dendritter. Denne syv-punkts skala giver mulighed for analyse på tværs af et komplet udvalg af dendrit morfologi, lige fra sunde neuroner til komplet dendrit tab, og overvejer morfologiske detaljer, herunder kinks, forgrening, blebs, og pauser. Med dette scoringssystem kan forskere kvantificere subtile aldersrelaterede ændringer samt mere dramatiske kemisk inducerede ændringer. Endelig giver vi et øvelsessæt af billeder med kommentarer, der kan bruges til at træne, kalibrere og vurdere scoringskonsistensen hos forskere, der er nye til denne metode. Dette skulle forbedre konsistensen inden for og mellem laboratoriet, øge strengheden og reproducerbarheden.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er en stadig mere almindelig neurodegenerativ sygdom, der påvirker op til 10 millioner individer på verdensplan1. Mænd og ældre personer har en højere risiko for at udvikle PD; gennemsnitsalderen for sygdommens indtræden er 60 år, og PD-forekomsten stiger fra en forekomst på 0,3 % i den almindelige befolkning til 3 % hos personer over 80 år over1år ,2. Selv om detaljerne i PD patologi ikke er fuldt forstået, denne progressive lidelse indebærer tab af dopaminerge neuroner i substantia nigra regionen af midbrain. Hypotese mekanismer af denne neuronale tab involverer mitokondrie dysfunktion, oxidativ stress, og betændelse2. Årsagerne og risikofaktorerne for sygdommen undersøges stadig, men involverer en kombination af miljømæssige og genetiske faktorer1. For eksempel har undersøgelser fundet positive sammenhænge mellem livslang pesticidanvendelse og PD samt genetisk modtagelighed for familiær PD1,3.
C. elegans modelsystem, oprindeligt udviklet til dels til neurobiologisk forskning4, er velegnet til evaluering af dopaminergisk neurontab in vivo. Nass og kolleger var banebrydende for brugen af C. elegans til dopaminerg neurodegeneration5, og mange grupper har siden vedtaget ormen som en vellykket model for PD og dopaminerge dysfunktion6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans er gode neurodegenerative sygdomsmodeller af mange af de samme grunde til, at de er sådan en populær modelorganisme til andre områder af biologi; deres gennemsigtighed giver mulighed for in vivo undersøgelse af cellulære processer, genmanipulation i orme er relativt hurtig og nem, de har en kort generationstid på omkring tre dage, og de er nemme at opretholde21. De fleste PD orm modeller falder ind under en af tre kategorier: aldersbaserede modeller, kemiske modeller, og genetiske modeller. Evnen til at synkronisere en population af orme giver mulighed for undersøgelse af aldersrelateret neurodegeneration for en aldersbaseret model af neurodegenerative sygdomme forbundet med aldring, såsom PD22. Kemiske eksponeringer inducerende PD-lignende neuronale defekter er blevet etableret ved hjælp af en række kemikalier, herunder 6-hydroxydopamin (6-OHDA), rotenon, og 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroyridin (MPTP)22. Orme bruges også med succes som genetiske modeller af PD; stammer med udvalgte neurale gen knockouts kan modellere forskellige neurodegenerative sygdomme1,4. Kombinationer af genetiske og miljømæssige faktorer, eller "gen-miljø interaktioner", som sandsynligvis spiller en stor rolle i PD2,17,23,24,25,26,27,28, er blevet undersøgt af flere grupper ved hjælp af C. elegans. Endelig er aldersrelateret dopaminerg neurodegeneration også blevet observeret29,30. Hvis du bruger en passende neurale transgen stamme i fluorescerende billeddannelse, nogen af disse PD orm modeller kan bruges til at studere dopaminerg neurodegeneration.
Kvantificering af ændringer i neuronal morfologi er en kritisk komponent i neurodegenerativ forskning. I C. elegans, mange fluorescerende reporter stammer er blevet brugt til at visualisere morfologiske ændringer og tab af neuroner. Stammer egnet til neuronal billeddannelse har et fluorescerende protein forbundet med cellespecifikke initiativtagere. For dopaminergiske neurodegeneration assays, vores laboratorium har brugt BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] stamme, som har en grøn fluorescerende protein (GFP) tag i dat-1 genet, udtrykt i dopaminerge neuroner. Bemærk, at BY200's rulle fænotype har en meget lav penetrance og er sjældent observeret. Andre almindelige stammer, der anvendes til denne type billeddannelse omfatter BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], og flere andre tilgængelige fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) eller efter anmodning fra specifikke laboratorier1,21,22,29 . Disse stammer typisk giver mulighed for visualisering af alle tre klasser af dopaminerge neuroner: cephalic (CEP), forreste deirid (ADE), og postdeirid (PDE) neuroner. C. eleganer udtrykker ikke naturligt alfasynucleinproteinet, men stammer som BY273 er blevet konstrueret til at udtrykke det. Vi bemærker dog, at det scoringssystem, vi præsenterer, blev udviklet ved hjælp af BY200, som ikke udtrykker alfa synuclein, og skulle valideres med denne stamme (eller enhver anden ny stamme) før brug. Yderligere dopaminerge neuroner er til stede hos mænd, men er sjældent overvejes, fordi mænd normalt udgør <1% af en C. elegans befolkning. Her fokuserer vi på de fire CEP dopaminerge neuroner, der findes i hovedregionen C. elegans. Dette sæt af neuroner er let placeret under fluorescerende mikroskopi, er til stede i både hermafrodit og mandlige orme, ikke typisk overlapper med andre områder af auto-fluorescens, og er almindeligt rapporteret om i orm undersøgelser. Især, selv om disse neuroner ikke er myelinated, CEP dorsale (CEPD) neuroner er direkte udsat for pseudocoelomic kropsvæske, hvor som CEP ventrale neuroner er ikke. Et sundt sæt CEP dendritter viser typisk som relativt lige, uafbrudte linjer. Degenererede dendritter kan vise enhver kombination af uregelmæssigheder og tegn på skade, herunder udtalte prikker kaldet blebs langs dendritlinjen og pauser i dendrittens linje. Eksempler på CEP-neuroner på forskellige grader af degeneration kan ses i figur 1.
Selvom dopaminerg neurodegeneration er ved at blive undersøgt af et stigende antal C. elegans laboratorier, der har været en stor variation i analysemetoder til kvantificering dopaminerg neuron skader29,31,32,33,34. Mange offentliggjorte undersøgelser har rapporteret om tilstedeværelsen eller fraværet af CEP soma med en binær scoring system af degenerative versus typiske eller vilde type neuroner31,32. Disse scoringsmetoder kan identificere visse stressorer, der fremkalder neurodegeneration, men ikke kan kvantificere detaljerne i progressionen af mere subtile neuronale skader, eller let opdage forskelle mellem neurodegeneration som induceret af unikke kemikalier eller andre variabler. Derudover, scoring systemer fokuseret på celle organer kan ikke være følsomme over for mindre alvorlige niveauer af skader eller neuronal skade påvirker kun en del af cellen, såsom dendrit. Da dendritten ser ud til at have det største udvalg af konsekvent påviselige morfologiske ændringer som reaktion på kemiske stressorer, har vi valgt dem som grundlag for vores analyse. Det pointsystem, vi præsenterer her, er ændret fra dendrit morfologibaserede multipunktsskalaer, der tidligere er blevet brugt i vores lab29,33. Dette system udvider disse fem- og sekspunktsskalaer til en syvpunktsskala for at tage højde for aldersrelaterede morfologiske ændringer, såsom højere forventede antal kinks hos ældre voksne dendritter, og for at skelne mellem alvorlige skader og fuldstændigt dendrittab. Formålet med at indføre dette scoringssystem er at give mulighed for at fange et omfattende billede af neurodegeneration på alle niveauer af neuronal skade og give et universelt system til at støtte konsistens på tværs af C. elegan dopaminergic neurodegeneration forskning. Fordi scoring er i sagens natur subjektiv, er det afgørende at maksimere sammenhængen mellem enkeltpersoner scoring, og at blinde målscoreren til identiteten af billederne ved hjælp af manuel blændende eller en automatisk blændende program35. For at forbedre konsistensen præsenterer vi en række træningsbilleder og bruger JoVE's videofunktioner til at demonstrere vores scoringssystem i detaljer. Vi anbefaler at bruge et system, der både tillader automatiseret blindet scoring og gør det muligt for målscoreren at kvantificere hendes eller hans scoringskonsistens ved at score en delmængde af billeder igen. Dette er især vigtigt, når man kombinerer eller sammenligner data fra flere forskere eller uddanner forskere, der er nye til at score.
Protocol
1. Forbered orme til billeddannelse
BEMÆRK: Se relaterede JoVE video artikel31: https://www.jove.com/v/835/
- For hver eksperimentel gruppe skal pipette eller plukke 20 til 30 orme til en billedplatform, der er kompatibel med billedmikroskopet. De fleste almindelige platforme omfatter 2% agarose gel pads monteret på glas dias med en coverlip31 og 96-brønd plader, der indeholder godt volumener på eller mindre end 100 μL flydende medium.
- Paralyser ormene ved at tilsætte 30-90 mM natriumzid (NaN3), 2,5-8,5 mM levamisole HCl eller andet lammende middel til ormene. Hvis du lammer i væske, skal du bruge en højere koncentration af lammende middel, end hvis du lammer på agarosepuder. Tryk forsigtigt på billedplatformen for at blande.
- Lad orme lamme helt.
BEMÆRK: Dette kan tage flere minutter.
2. Billede dopaminerge neuroner
- Find ormenes hovedområder under en-farve GFP fluorescens ved hjælp af billeddannelse mikroskop i stand til at tage z-stakke.
- Vær opmærksom på eksponering og blændeindstillinger; undgå overeksponering af dendritter og holde indstillingerne konsistente på tværs af forsøg. Gør dendritterne så lyse som nødvendigt for klar visualisering; dette resulterer typisk i overeksponering af soma.
BEMÆRK: Billeder, der er inkluderet i denne protokol, blev taget ved hjælp af 400x forstørrelse.
- Vær opmærksom på eksponering og blændeindstillinger; undgå overeksponering af dendritter og holde indstillingerne konsistente på tværs af forsøg. Gør dendritterne så lyse som nødvendigt for klar visualisering; dette resulterer typisk i overeksponering af soma.
- Rul gennem fokus for at finde øvre og nedre grænser, hvor dendritterne er tydelige. Angiv disse som øvre og nedre grænser for et z-stack-billedbillede.
- Klik her for at hente z-stack-billeder for hver orm.
BEMÆRK: Alle følgende trin kan udføres når som helst.
3. Forbered dopaminerge neuronbilleder til scoring
- For hver z-stack skal du åbne billedfilen ved hjælp af enten mikroskopsoftwaren eller en ekstern billedanalysesoftware, indlæse stakken i softwaren og komprimere stakken til et enkelt fladt billede.
- Blinde billeder mellem og inden for behandlingsgrupper manuelt eller ved hjælp af automatisk blændende software.
4. Score dopaminergic Neuron Dendrites
- Arbejd med et neuronbillede ad gangen. Vælg en af de fire CEP dendritter til at vurdere for blebs, pauser og uregelmæssigheder, herunder bøjninger, kinks og kurver. Scoring fra venstre mod højre, når næsen er øverst på billedet anbefales for at sikre repeterbarhed i scoring.
- Ved hjælp af følgende retningslinjer skal du tildele dendritten én pointværdi. Se Figur 1 for repræsentative eksempler på scoringsbillede.
0 - ingen skade, "perfekte" neuroner
1 - uregelmæssig (knæk, kurver osv.)
2- <5 blebs
3- 5-10 blebs
4- >10 blebs og/eller brud fjerne <25% af den samlede dendrit
5- brud, 25-75% af dendrit fjernet
6 - brud, >75% dendrit fjernet- Hvis flere kriterier er opfyldt inden for en enkelt dendrit (dvs. kinks og blebs), tildele den højeste gældende score.
- Du må ikke score dendritter, der ikke er tydeligt synlige, på grund af problemer med billedoptagelse, overlappende med andre dendritter osv. Hvis du zoomer ind på et fladt z stack-billede, skal du være opmærksom på forstørrede pixels, der ligner falske blebs.
- Gentag for hver dendrit. Gentag for alle billeder.
- Optag alle scoringer. Scores kan være un-blinded på dette tidspunkt.
5. Udarbejde og præsentere data
- Beregn det samlede antal dendritter i hver behandlingsgruppe, der er tildelt hver neurodegenerationsscore. Beregn det samlede antal scorede dendritter i hver behandlingsgruppe.
- Divider neurodegeneration score tallies med det samlede antal dendritter scoret i behandlingsgruppen. Præsentere data som en andel af dendritter inden for en behandlingsgruppe ved hver neurodegeneration score.
6. Udfør statistisk analyse
- Brug en programmeringssoftware eller manuelt, køre en chi-kvadreret test for uafhængighed mellem alle behandling gruppe par, der skal sammenlignes. Når det er relevant, skal du anvende en Bonferroni-korrektion af p-værdien i henhold til antallet af sammenlignede eksperimentelle grupper for at tage højde for flere sammenligninger.
BEMÆRK: Denne test vil bestemme betydelige forskelle mellem to grupper, men detaljer om typen af forskel skal kvalificeres med øjet.- Vælg sammenligninger mellem eksperimentelle grupper. Dette vil variere baseret på eksperimentelt design.
BEMÆRK: I vores eksperimenter sammenlignes kontroller typisk med deres respektive behandlingsgrupper, alle kontroller sammenlignes, og alle behandlinger sammenlignes.
- Vælg sammenligninger mellem eksperimentelle grupper. Dette vil variere baseret på eksperimentelt design.
7. Praksis Scoring med Praksis Sæt dopaminerge neuron billeder
- Se supplerende fil 1 for et sæt neuronbilleder, der præsenterer hele spektret af vores scoringssystem med kommentarer og scorenøgle. Formålet med denne praksis er at uddanne forskere, der er nye inden for denne metode, og sikre pålidelighed mellem rater.
8. Overvej alternative protokolindstillinger
- I stedet for at optage z-stakke, komplet scoring på mikroskopet, uden at gemme eller stable billeder.
BEMÆRK: Denne indstilling reducerer kravene til teknologiske funktioner, men fjerner muligheden for at oprette et arkiv af neuronbilleder, der skal vende tilbage til på et senere tidspunkt, kræver manuel blændelse og tillader kun blændende mellem og ikke inden for behandlingsgrupper. - I stedet for at oprette et enkelt komprimeret billede pr. stak skal du fuldføre scoringen ved at rulle gennem billederne af hver z-stack.
BEMÆRK: Denne mulighed kan være lettere for nogle målscorere, og det reducerer risikoen for at se falske blebs på orme, der bevægede sig under billeddannelse og giver mulighed for at score overlappende dendritter, men kræver manuel blændelse og tillader kun blændende mellem og ikke inden for behandlingsgrupper.
Representative Results
Det scoringssystem, der er beskrevet her, blev brugt til at vurdere neurodegeneration i L4 larvestadiet BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans efter rotenoneksponering. Resultaterne af dette eksperiment er vist i figur 2 og repræsenterer vores scoringssystems evne til at opdage og kvantificere variable niveauer af dopaminergisk neuronskade. Rotenone er et naturligt forekommende elektrontransportkædekompleks, som jeg hæmmer, og som anvendes i nogle pesticider, piscicider og insekticider36,37. Bemærk, at arbejde med giftige kemikalier såsom rotenone er i sagens natur farligt, og alle laboratorier bør overholde alle brug og bortskaffelse regler, der er fastsat af deres institutioner. I dette forsøg blev flydende rotenoneksponeringer ved to doser, 0,03 μM og 0,5 μM sammen med en kontrolgruppe påbegyndt umiddelbart efter en 0,5 M natriumhydroxid/1% natriumhypochlorit lysis til at høste æg38. Æg udklækket i komplet K-medium33,39 med 0,25% dimethylsulfoxid (DMSO), og orme forblev i væske i ~ 48 timer indtil midten af L4 larvestadiet, hvorefter de blev fjernet fra kemisk eksponering og forberedt, afbildet og ved hjælp af figur 1 som reference scoret i henhold til protokollen trin ovenfor. For den højere dosis på 0,5 μM rotenone blev æg høstet 24 timer i forvejen for at tage højde for en rotenon-induceret udviklingsforsinkelse og sikre, at alle orme blev fase synkroniseret på tidspunktet for billeddannelse.
Figur 2 viser yderligere, hvordan vores laboratorium visualiserer data indsamlet ved hjælp af dette pointsystem. I dette tal kan et dosisafhængigt neurodegenerationsrespons værdsættes, og den specifikke opdeling af scorefordelingen vises tydeligt. Disse særlige resultater viser, hvordan neuronal skade kan præsentere på forskellige måder. For eksempel har den 0,03 μM rotenoneksponerede gruppe en nedsat andel af sunde neuroner med en score på 0 sammenlignet med kontrolgruppen, men har også en reduceret andel på 5 scoringer. Ved at registrere denne detalje om scorefordelingerne mellem eksperimentelle grupper fremhæves følsomheden af vores syvpunkts scoringssystem. Disse data blev analyseret for statistisk signifikans i henhold til protokollen, ved hjælp af en chi-kvadreret test for uafhængighed med en Bonferroni korrektion.
Figur 1. Dopamin neuron morfologisk ændring og degeneration scoring system repræsentative billeder. Dette konsoliderede diagram indeholder eksempler på neuroner ved hver score og er beregnet til at blive brugt som reference til scoring. Her svarer hver mærket score til den mest beskadigede dendrit i hver orm, som angivet af pilen i hvert panel. Disse billeder blev taget ved hjælp af protokollen beskrevet i dette papir med BY200 C. elegans. Se supplerende fil 1 for et sæt scorede billeder med kommentarer, der skal bruges til træning af dem, der er nye til denne scoringsmetode. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. BY200 L4 dopamin neuron morfologi og degeneration score efter rotenone eksponering. Denne figur viser repræsentative resultater analyseret ved hjælp af de scoringsmetoder, der er beskrevet her. De visualiserede større andele af beskadigede dopaminerge neuroner med højere rotenoneksponeringskoncentrationer blev statistisk analyseret ved hjælp af chi-kvadrerede tests for uafhængighed. Begge rotenonbehandlingsgrupper gav statistisk signifikante p-værdier sammenlignet med kontrolgruppen. Forskellige bogstaver angiver statistisk forskel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende sag 1. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sag 2. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne protokol viser, hvordan man bruger syv-punkts skala udviklet i vores laboratorium til at kvantificere niveauer af dopaminergisk neuron morfologisk ændring og degeneration i C. elegans. Vi skabte og delte denne skala som et værktøj til at standardisere analyse af dopaminergisk neurodegenerationsarbejde i orme. I erkendelse af vigtigheden af at studere veje involveret i meget udbredte neurodegenerative sygdomme, mange efterforskere drage fordel af C. elegans modellens egnethed til neurobiologi visualisering til at studere neurodegeneration29,31,32,33. Der er dog endnu ikke gjort en indsats for at reducere den store variation i, hvordan neuronskader kvantificeres på tværs af neurodegenerationsforskning i orme. Det pointsystem, der præsenteres her, har således til formål at fremme sammenhæng i analyser og gøre det muligt at sammenligne undersøgelser.
Vores scoringssystem kan bruges til at analysere data afledt af C. elegans eksperimenter, der bruger cellespecifikke fluorescerende journalister, der giver mulighed for visualisering af dopaminerge neuroner - specielt CEP dendritter. Specifikt, stammer mærket på dat-1 genet for GFP visualisering af dopaminerge neuroner er kompatible med denne scoring protokol, selv om mange andre relaterede transgene modeller af PD eksisterer. Det er muligt, at dette pointsystem også vil være nyttigt med disse modeller; Dette bør dog valideres, før de anvendes. Især er det muligt (men ikke testet til vores viden) stammer med mCherry kan ikke være velegnet til denne protokol som mCherry sammenlægning kan være skelnes fra blebs eller føre til celle stress. I stedet for at give en kommentar til alle specifikke modeller af PD og relaterede neurodegenerative lidelser, fokuserer vi på scoring af neurodegenerationsdata selv. Derudover fokuserer denne protokol kun på neuronal morfologi og overvejer ikke fluorescensniveauer i soma. Neurodegeneration assays kan udføres sammen med adfærdsmæssige assays relevante for neurodegenerative sygdomme, såsom bevægelse, levetid, og sundhed-span eksperimenter. Niveauer af degeneration i etablerede kemiske, aldersbaserede og genetiske modeller af PD kan også bekræftes og detaljeret ved hjælp af dette scoringssystem. Måling modeller, bidragydere, og veje forbundet med PD og andre neurodegenerative sygdomme kan føje til den videnskabelige viden om disse lidelser og peger i retning af, hvordan man håndterer den voksende befolkning af berørte personer. At have sammenlignelige neurodegenerationsresultater på tværs af litteratur er nøglen til at støtte dette mål.
For at fortolke resultaterne fra dette scoringssystem foreslår vi at overveje hver dendrit scoret som n = 1, fordi forskellige neuroner inden for samme orm ofte reagerer forskelligt på behandling. Dette kan være drevet af det faktum, at kun CEPD neuroner er direkte udsat for pseudocoelomic kropsvæske. Som sådan gør dette det muligt at se scorespredningen af eksperimentelle grupper som proportioner af det samlede antal dendritter, der er scoret i hver gruppe. Denne metode, der anvendes til de repræsentative resultater vist her, giver mulighed for nem sammenligning på tværs af behandlingsgrupper, tegner sig for differentierede svar inden for samme orm, og er let analyseret med en Chi-kvadreret test komplimenteret af en Bonferroni korrektion for flere sammenligninger. En eksempelskabelon til registrering af neuronscorer og beregningsprocenter findes i supplerende fil 2. Vi har overvejet to alternative metoder til dataanalyse og identificere fejl i hver. Den første mulighed er gennemsnit af scorer af de fire CEP neuroner for hver orm. Dette parametrizes data; Det forudsætter dog et lineært forhold til stigende score og mister oplysninger om eventuelle variationer som reaktion på behandling inden for samme orm. Den anden mulighed er at opsummere scorerne af alle fire CEP neuroner for hver orm, som også parametrierer dataene. Dette forudsætter stadig en lineær sammenhæng mellem scoringer, men det mere kapabelt tegner sig for forskelle inden for hver orm end gennemsnittet score ved at udvide parametrene for mulige scoringer. Men individuelle forskere beslutter at vise deres data, resultaterne bør overvejes sammen med eksperimentelle variabler såsom stamme og orm alder; ældre orme har f.eks. et højere forventet baselineniveau for degeneration.
Da disse neurodegeneration score resultater fortolkes, forskere bør også være opmærksomme på et par forbehold og begrænsninger af scoring metode. For det første er visse teknologiske krav nødvendige for at fange billeder, der er egnede til scoring. Billedmikroskopet skal understøtte fluorescenskanaler og forstørrelses- og eksponeringsindstillinger, der giver mulighed for klar visualisering af CEP-dendritter. Som nævnt i protokollen kan teknologiske krav reduceres ved protokoljusteringer som at score livebilleder gennem det mikroskopiske felt i stedet for at optage billeder, der skal arkiveres og scores på et senere tidspunkt. For det andet er mulige statistiske analysemetoder for disse data begrænsede, da dataene ikke er parametriske. Pointskalaen formodes at være progressiv, men kan ikke betragtes som numerisk, da der er diskrete scoremuligheder, og scorestigninger ikke nødvendigvis er proportionale med hinanden med hensyn til biologisk funktion. Af disse grunde er chi-kvadrerede test for uafhængighed bedst egnet til denne type data, hvilket betyder, at den statistiske analyse afhænger af observatøren for at bestemme retningen af enhver statistisk betydning. Især analyserer chi-kvadreret test også kun for forskelle i scorefordeling og er ude af stand til at dokumentere forskelle i specifikke scoringskategorier. Endelig er den funktionelle betydning af de morfologiske ændringer, der er kvantificeret ved dette pointsystem, endnu ikke undersøgt.
De fremtidige retninger foranlediget af udviklingen af dette scoringssystem indebærer bestemmelse af biologiske baser og korrelationer med individuelle neuron scores. Undersøgelse af den funktionelle betydning (f.eks neuronal signalering, orm adfærd) af alle punkter på scoring skala vil informere, hvordan man bedre oversætte resultater til konklusioner, der gælder for at forstå årsagerne og konsekvenserne af neurodegenerative sygdomme og udvikle forebyggelse og behandlingsmuligheder. Fremtidig forskning i neurodegeneration i orme bør sigte mod at opdage forbindelser til andre morfologi, såsom orm form og størrelse. Derudover kan neurodegenerationsforskning understøttes ved at studere andre reporter C. elegans stammer til måling af endepunkter som bioenergetik, reaktiv iltarterproduktion og mitokondriemorfologi.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Vi ønsker at anerkende Ian T. Ryde, for bidrag til udviklingen af pointskalaen og for hans støtte under oprettelsen af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (T32ES021432 støttede KSM og P42ES01010356 til JNM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3x1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
References
- Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson's Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
- Hayes, M. T. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
- Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson's disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1973).
- Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
- Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
- Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
- Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson's disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
- Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R. Manganese and C. elegans in Parkinson's disease. Parkinson's Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. Nass, R., Przedborski, S. , Elsevier Inc. (2008).
- Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson's Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
- Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson's Disease in C. elegans. Journal of Parkinson's Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
- Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson's disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
- Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
- Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
- Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
- Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
- Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
- Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
- Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
- Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
- Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
- Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson's disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
- Lesage, S., Brice, A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
- Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson's Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
- Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson's disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson's Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
- Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
- Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
- Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
- Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson's disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
- Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
- Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
- Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
- Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
- Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
- National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
- Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).
