Neuroscience

卡诺哈布迪炎电子甘的多巴胺神经元形态变化和退化的量化水平

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62894

Shefali R. Bijwadia¹, Katherine Morton¹, Joel N. Meyer¹

¹Nicholas School of the Environment, Duke University

Summary

在这篇文章中，我们展示了如何使用七分评分系统来持续量化 C.elegans中多巴胺神经元树突形态的变化。该系统旨在利用神经退行性疾病的遗传、化学和年龄模型分析多巴胺神经退化检测。

Abstract

多巴胺神经元损失与帕金森病（PD）的病理学有关，帕金森病是一种非常普遍的神经退行性疾病，影响全球超过1000万人。由于许多有关PD病原体的细节仍然未知，需要研究PD的遗传和环境贡献者，以发现预防、管理和治疗的方法。多巴胺神经元损失的正确描述可能不仅与PD研究有关，而且与其他日益流行的神经退行性疾病有关。

在卡诺哈布迪炎脑膜炎模型系统中，有建立的多巴胺神经退化的遗传和化学模型，在线虫的透明度和不变的神经元结构的支持下，神经生物学的可视化很容易。特别是，使用由细胞特异性推进剂（如dat-1多巴胺转运基因）驱动的荧光记者菌株，可以可视化多巴胺神经元形态变化，该基因仅在其 8 个多巴胺神经元中表达。

凭借这种模型系统的能力和适当的技术，许多实验室都研究了多巴胺神经退化。然而，在分析数据的方式上几乎没有一致性，而且目前的许多文献都使用二进制评分分析来捕捉退化的存在，而不是神经元损失进展的全部细节。在这里，我们引入一个通用的评分系统，以评估 C.elegans头孢神经元树突的形态变化和退化。这个七点尺度允许分析全方位的树突形态，从健康的神经元到完成树突损失，并考虑形态细节，包括扭结、分支、斑点和断裂。有了这个评分系统，研究人员可以量化与年龄相关的微妙变化以及更剧烈的化学诱导变化。最后，我们提供了一套带有注释的练习图像，可用于训练、校准和评估新方法的研究人员的评分一致性。这应提高实验室内部和实验室之间的一致性，提高严谨性和可重复性。

Introduction

帕金森病（PD）是一种越来越常见的神经退行性疾病，^{影响全球多达}1000万人。男性和老年人患PD的风险较高：该病的平均发病年龄为60岁，PD发病率从一般人群的0.3%攀升至80岁以上^人群的3%。虽然PD病理学的细节尚未完全了解，但这种渐进性紊乱涉及中脑的亚斯坦蒂亚尼格拉区域多巴胺神经元的丧失。这种神经元损失的假设机制涉及线粒体功能障碍，氧化应激和炎症^2。疾病的原因和危险因素仍在探索中，但涉及环境因素和遗传因素的综合^作用。例如，研究发现终身使用农药和PD之间有正关联，以及家族性^PD1，3的遗传易感性。

C.elegans模型系统，最初开发的部分神经生物学研究^4，非常适合评估多巴胺神经元损失在体内。Nass和他的同事率先使用C.elegans进行多巴胺神经退化^5，此后许多团体已经采用蠕虫作为PD和多巴胺神经功能障碍^{6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17}的成功模型 ^，¹⁸^，¹⁹^，²⁰。C. elegans是很好的神经退行性疾病模型，原因有很多，因为它们是其他生物学领域的流行模型有机体：它们的透明度允许在细胞过程的体内研究，蠕虫的基因操作是相对快速和容易的，他们有一个短的生成时间约三天，他们很容易保持^21。大多数PD蠕虫模型分为三类：基于年龄的模型、化学模型和基因模型。同步蠕虫种群的能力使得研究与年龄相关的神经退化，用于与衰老相关的神经退行性疾病的年龄模型，如^PD22。诱导PD类神经元缺陷的化学暴露是使用多种化学品建立的，包括6-羟基多巴胺（6-OHDA）、罗酮和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢二烯^{（MPTP）22。}蠕虫也被成功地用作PD的基因模型：具有选择神经基因敲除的菌株可以模拟各种神经退行性疾病^1，4。基因和环境因素的组合，或"基因-环境相互作用"，可能发挥主要作用的PD 2，17，23，24，25，26，27，28，已经检查了几个组使用C.elegans。最后，年龄相关的多巴胺神经退化也观察到^29，30。如果在荧光成像中使用适当的神经转基因菌株，这些PD蠕虫模型中的任何一个都可以用于研究多巴胺神经退化。

量化神经元形态的变化是神经退行性研究的重要组成部分。在C.elegans，许多荧光记者菌株被用来可视化形态变化和神经元损失。适合神经元成像的菌株具有与细胞特异性促进剂相关的荧光蛋白。对于多巴胺神经退化检测，我们的实验室使用了 BY200 [vtIs1（dat-1p：：GFP， rol-6）] 菌株，该菌株在dat-1基因中具有绿色荧光蛋白（GFP）标签，在多巴胺神经元中表达。请注意，BY200 的滚筒表型具有非常低的穿透性，很少被观察到。用于此类成像的其他常见菌株包括 BY250[dat-1p：：GFP]， BY273 [baEx18 [dat-1p：：GFP]dat-1p：：WT α-syn]，BZ555 [egis1]dt-1p：：GFP]，以及其他几个可从卡诺哈布迪炎遗传学中心（CGC）或特定实验室^{1， 21，}²²，²⁹的要求.这些菌株通常允许可视化所有三类多巴胺神经元：头孢神经元（CEP）、前二元神经元（ADE）和后二胺神经元（PDE）。C. elegans不自然地表达α核素蛋白，但像BY273这样的菌株已被设计来表达它。但是，我们注意到，我们目前的评分系统是使用 BY200 开发的，它不表示α核素，并且需要在使用之前用该菌株（或任何其他新菌株）进行验证。男性中存在额外的多巴胺神经元，但很少被考虑，因为男性通常占C.elegans种群的<1%。在这里，我们专注于在C.elegans的头部区域发现的四个CEP多巴胺神经元。这组神经元很容易位于荧光显微镜下，存在于草本虫和雄性蠕虫中，通常不会与其他自荧光区域重叠，并且通常在蠕虫研究中报道。值得注意的是，虽然这些神经元没有骨髓化，但CEP正点（CEPD）神经元直接暴露在伪腹腔体液中，而CEP腹腔神经元则不暴露于伪脑体液中。一组健康的 CEP 树突通常显示为相对直的、不间断的线条。退化的树突可能表现出任何不规则和损伤迹象的组合，包括沿着树突线的明显点称为斑点，并在树突线中断裂。CEP神经元在不同程度的退化的例子可以从图1中看到。

虽然多巴胺神经退化正在由越来越多的C.elegans实验室研究，但计算多巴胺神经元损伤的分析方法却存在很大差异^{，29、31、32、33、34。}许多发表的研究已经报告了CEP soma的存在或缺乏与典型或野生类型的神经元^31，32的退行性二元评分系统。这些评分方法可以识别某些诱导神经退化的压力源，但无法量化更微妙的神经元损伤进展的细节，或很容易检测由独特化学物质或其他变量诱导的神经退化之间的差异。此外，以细胞体为重点的评分系统可能对较不严重的损伤水平或仅影响部分细胞（如树突）的神经元损伤不敏感。由于树突似乎具有针对化学应激因素的一致可检测的莫克变变化的最大范围，因此我们选择了它们作为分析的基础。我们在这里的评分系统是修改从树突形态为基础的多点尺度，以前已经在我们的实验室^29，33使用。该系统将这些五点和六点尺度扩展为七点尺度，以考虑与年龄相关的形态变化，例如老年人树突中预期扭结数较高，并区分严重损伤和完全树突损失。引入这个评分系统的目的是提供在神经元损伤的各个层面捕捉神经退化的全面图像的能力，并提供一个通用系统来支持C.elegan多巴胺神经退化研究的一致性。因为评分本质上是主观的，因此必须最大限度地提高个人评分的一致性，并且使用手动致盲或自动致盲程序³⁵使评分者对图像的身份视而不见。为了提高一致性，我们展示了一系列培训图像，并利用 JoVE 的视频功能详细演示我们的评分系统。我们建议使用一个系统，既允许自动盲目得分，并允许得分手量化他或她的得分一致性，通过重新评分的图像子集。在组合或比较来自多个科学家的数据或培训新评分的科学家时，这一点尤其重要。

Protocol

1. 为成像准备蠕虫

注：请参阅相关 JoVE 视频文章³¹： https://www.jove.com/v/835/

对于每个实验组，移液器或选择20至30蠕虫到与成像显微镜兼容的成像平台。最常见的平台包括安装在玻璃滑梯上的 2% 玫瑰凝胶垫，盖片³¹ 和 96 井板，其油井体积为或小于 100 μL 的液态介质。
通过在蠕虫中加入30-90mM钠azide（NaN 3）、2.5-8.5m莱瓦米索勒HCl或其他麻痹剂来麻痹蠕虫。如果液体瘫痪，使用比在玫瑰垫上瘫痪浓度更高的麻痹剂。轻轻点击成像平台进行混合。
让蠕虫完全瘫痪。
注意：这可能需要几分钟。

2. 图像多巴胺神经元

使用能够拍摄 z 堆栈的成像显微镜，在单色 GFP 荧光下定位蠕虫的头部区域。
1. 注意暴露和光圈设置;避免过度暴露树突，并保持整个试验的设置一致。使树突明亮，以实现清晰的可视化：这通常会导致索马的过度暴露。
  注：使用 400 倍放大倍数捕获此协议中包含的图像。
滚动查看焦点，查找树突清晰的上下边界。将这些设置为 z 堆栈图像捕获的上下边。
单击以捕获每个蠕虫的 z 堆栈图像。
注意：所有以下步骤可随时执行。

3. 准备多巴胺神经元图像进行评分

对于每个 z 堆栈，使用显微镜软件或外部图像分析软件打开图像文件，在软件中加载堆栈，并将堆栈压缩为单个平面图像。
手动或使用自动致盲软件在治疗组之间和内部的盲图像。

4. 得分多巴明吉奇神经元登德里特

一次处理一个神经元图像。选择四个 CEP 树突之一，以评估斑点、断裂和不规则，包括弯曲、扭结和曲线。建议在鼻子位于图像顶部时从左到右进行评分，以确保评分的可重复性。
使用以下准则，为树突分配一个分数值。有关具有代表性的评分图像示例，请参阅图 1。
0- 无损伤，"完美"神经元
1- 不规则（扭结、曲线等）
2 - < 5 bbs
3 - 5 - 10 出血
4- >10 出血和/或破损去除总树突的 <25%
5- 破损，25-75% 的树突去除
6- 破损，去除>75%的树突
1. 如果在单个树突（即扭结和斑点）内满足多个标准，则分配最高适用分数。
2. 不要得分树突，不清晰可见，由于图像捕获的问题，与其他树突重叠，等等。如果放大扁平 Z 堆栈图像，请注意放大的像素，类似于假斑点。
每个树突重复。重复所有图像。
记录所有分数。此时分数可能未失明。

5. 准备和呈现数据

计算分配给每个神经退化评分的每个治疗组的树突总数。计算每个治疗组的评分树突总数。
将神经退化分数除以治疗组中评分的树突总数。在每个神经退化评分中，将数据作为治疗组内树突的比例。

6. 执行统计分析

使用编程软件或手动操作，运行所有治疗组对之间的独立性进行奇方测试以进行比较。在适当情况下，根据比较实验组的数量对 p 值进行 Bonferroni 校正，以进行多次比较。
注：此测试将确定两组之间的显著差异，但差异类型的细节必须通过眼睛进行鉴定。
1. 选择实验组之间的比较。这将根据实验设计而有所不同。
  注意：在我们的实验中，通常将对照组与各自的治疗组进行比较，对所有对照组进行比较，对所有治疗进行比较。

7. 练习评分与多巴胺神经元图像练习集

有关一组神经元图像，请参阅 补充文件 1， 这些图像通过评论和评分键呈现在我们的评分系统的全系列中。此练习集旨在培训研究人员对该方法的新方法，并确保互速器的可靠性。

8. 考虑替代协议选项

无需保存或堆叠图像，无需在显微镜上完成评分，而不是捕获 z 堆栈。
注：此选项降低了对技术能力的要求，但删除了创建神经元图像存档以在以后返回的选项，需要手动致盲，并且仅允许在治疗组之间而不是治疗组内致盲。
而不是创建每个堆栈的单个压缩图像，通过滚动浏览每个 z 堆栈的图像完成评分。
注：此选项对于某些得分手来说可能更容易，它降低了在成像过程中移动的蠕虫上看到假斑点的风险，并允许对重叠的树突进行评分，但需要手动致盲，并且仅允许在治疗组之间而不是治疗组内致盲。

Representative Results

这里描述的评分系统用于评估L4幼虫阶段的神经退化 BY200 [vtIs1（dat-1p：：GFP， rol-6）] C. elegans后，罗酮暴露.此实验结果见图 2，代表我们的评分系统检测和量化多巴胺神经元损伤的可变水平的能力。罗特诺是一种天然存在的电子传输链复合物I抑制剂，用于一些杀虫剂，杀虫剂^36，37。请注意，使用罗酮等有毒化学品本质上是危险的，所有实验室都应遵守其机构制定的所有使用和处置法规。在这项实验中，液体罗酮暴露在两个剂量，0.03 μM和0.5μM，以及一个对照组，开始立即后，0.5M氢氧化钠/1%的低氯酸钠裂解收获鸡蛋^38。卵子在完整的K-mid33，39与0.25%的二甲基硫氧化物（DMSO），蠕虫留在液体中约48小时，直到中L4幼虫阶段，在这一点上，他们从化学暴露，并准备，成像，并使用图1作为参考，根据上述协议步骤评分。对于高剂量的 0.5 μM 罗酮，鸡蛋提前 24 小时收获，以解释罗酮引起的发育延迟，并确保所有蠕虫在成像时阶段同步。

图2进一步演示了我们的实验室如何可视化使用此评分系统收集的数据。在这个数字中，可以欣赏剂量依赖神经退化反应，并清楚地显示分数分布的具体细目。这些特殊的结果展示了神经元损伤如何以不同的方式呈现。例如，与对照组相比，0.03 μM rotenone 暴露组的健康神经元比例下降，得分为 0，但得分也降低了 5 分。检测实验组之间分数分布的这个细节突出了我们七分评分系统的灵敏度。根据协议，使用对独立性的奇方测试与邦费罗尼校正对，对这些数据进行了统计意义分析。

图1。多巴胺神经元形态变化和退化评分系统代表性图像。此合并图表包含每个分数的神经元示例，并打算用作评分参考。在这里，每个标记的分数对应于每个蠕虫中受损最严重的树突，如每个面板中的箭头所示。这些图像是使用本文中描述的与 BY200 C. elegans的协议拍摄的。请参阅 补充文件 1 的一组评分图像与评论用于训练这些新的评分方法。请单击此处查看此图的较大版本。

图2。到 200 L4 多巴胺神经元形态和变性分数后，罗酮暴露。此图显示了使用此处描述的评分方法分析的具有代表性的结果。使用奇方独立测试对具有较高罗酮暴露浓度的受损多巴胺神经元进行可视化的更大比例进行统计分析。与对照组相比，两个罗酮治疗组都产生了具有统计学意义的p值。不同的字母表示统计差异。请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件1。请点击这里下载此文件。

补充文件2。请点击这里下载此文件。

Discussion

该协议演示了如何使用我们实验室开发的七点尺度来量化C.elegans的多巴胺神经元变形和退化水平。我们创建并共享此量表，作为标准化对蠕虫多巴胺神经退化工作的分析的工具。认识到研究高流行性神经退行性疾病所涉及的途径的重要性，许多研究者利用C.elegans模型的神经生物学可视化性来研究神经退化29、31、32、33。然而，在蠕虫的神经退化研究中，尚未努力减少神经元损伤的量化方式的巨大变化。因此，这里介绍的评分系统旨在促进分析的一致性，并允许比较研究。

我们的评分系统可用于分析来自 C. elegans 实验的数据，这些实验使用细胞特异性荧光记者，允许多巴胺神经元（特别是 CEP 树突）的可视化。具体来说，在 dat-1 基因上标记的用于多巴胺神经元 GFP 可视化的菌株与此评分协议相容，尽管 PD 的许多其他相关转基因模型确实存在。这种评分系统也可能对这些模型有用：但是，在使用它们之前，应对此进行验证。特别是，它是可能的（但不是根据我们的知识测试）菌株与mCherry可能不太适合这个协议，因为mCherry聚合可能无法区分的斑点或导致细胞压力。我们关注的不是对PD和相关神经退行性疾病的所有特定模型的评论，而是关注神经退行数据本身的评分。此外，此协议只关注神经元形态学，不考虑索马的荧光水平。神经退化检测可以与与神经退行性疾病相关的行为检测一起进行，如运动、寿命和健康跨度实验。使用此评分系统还可以确认和详细说明既定的 PD 化学、年龄和遗传模型中的退化水平。测量与PD和其他神经退行性疾病相关的模型、贡献者和途径可以增加有关这些疾病的科学知识，并指出如何管理受影响人群不断增长的人口。在文献中具有类似的神经退化结果是支持这一目标的关键。

为了解释从这个评分系统中得出的结果，我们建议考虑每个树突得分为n=1，因为同一蠕虫中的不同神经元通常对治疗的反应不同。这可能是由只有CEPD神经元直接暴露在伪骨髓体液中这一事实造成的。因此，这允许实验组的分数分布显示为每个组得分的树突总数的比例。此方法用于此处显示的代表性结果，便于跨治疗组进行比较，可说明同一蠕虫内部的微分反应，并且通过 Bonferroni 校正对的 Chi 方测试轻松分析，以便进行多次比较。记录神经元分数和计算百分比的示例模板可以在 补充文件 2中找到。我们考虑了两种替代数据分析方法，并找出了每个方法的缺陷。第一个选项是平均每个蠕虫的四个 CEP 神经元的分数。这参数数据;然而，它假定与增加分数的线性关系，并丢失有关任何变化的信息，以响应同一蠕虫内的治疗。第二种选择是汇总每个蠕虫的所有四个 CEP 神经元的分数，这也对数据进行了参数分析。这仍然假定分数之间的线性关系，但它通过扩展可能分数的参数，更能够说明每个蠕虫内部的差异，而不是平均分数。无论研究人员决定如何显示他们的数据，结果应该与实验变量（如菌株和蠕虫年龄）一起考虑：例如，较老的蠕虫的退化基线水平较高。

当这些神经退化评分结果被解释时，研究人员也应该意识到评分方法的一些注意事项和局限性。首先，捕获适合评分的图像需要某些技术要求。成像显微镜必须支持荧光通道、放大和曝光设置，以便清晰可视化 CEP 树突。如协议中所述，技术要求可以通过协议调整来降低，例如通过显微领域对实时图像进行评分，而不是捕获稍后要存档和评分的图像。其次，由于数据是非参数化的，因此此数据的可能统计分析方法有限。评分量表被认为是渐进的，但不能被视为数字，因为有离散的分数选项，分数增加不一定在生物功能方面彼此成正比。出于这些原因，独立性奇方测试最适合此类数据，这意味着统计分析取决于观察者确定任何统计意义的方向。值得注意的是，奇方测试也只分析分数分布的差异，无法提供特定分数类别差异的证据。最后，这个评分系统量化的形态变化的功能意义还有待研究。

这个评分系统的发展所推动的未来方向包括确定生物碱基和与单个神经元分数的相关性。研究评分尺度上所有点的功能意义（如神经元信号、蠕虫行为），将指导如何更好地将结果转化为适用于理解神经退行性疾病的病因和后果以及开发预防和治疗选项的结论。今后对蠕虫神经退化的研究应旨在发现与其他形态（如蠕虫形状和大小）的联系。此外，神经退化研究可以通过研究其他记者 C.elegans 菌株来测量终点，如生物能源学、活性氧物种生成和线粒体形态。

Disclosures

作者没有披露。

Acknowledgments

我们要感谢伊恩·莱德，感谢他为制定评分表所作出的贡献，以及他在创作这份手稿期间给予的支持。这项工作得到了国家卫生研究院的支持（T32ES021432支持KSM，P42ES010356支持JNM）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	VWR	29442-056	For imaging in wells
Blinder	Solibyte Solutions LLC		Free software that blinds between and within uploaded sets of image files
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)]	Aschner Lab		C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab
complete K-medium			51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol
Coverslips 22x22mm, No.1 glass	VWR VistaVision	48366-067	For imaging on slides
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301	Solvent for rotenone exposures
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.	Sotware for image manipulation
Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope	Keyence		Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging
Microscope Slides 3x1"	VWR VistaVision	16004-420	For imaging on slides
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Electron transport chain complex I inhibitor
Sodium Azide (NaN_3)	Sigma-Aldrich	S2002	Paralytic
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	For bleach lysis
Sodium Hypochlorite	VWR	RC7495.5-32	For bleach lysis
Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl)	Sigma-Aldrich	L9756	Paralytic