Summary
I den här artikeln visar vi hur man använder ett sjupoängssystem för att konsekvent kvantifiera förändringar i dopaminerg neuron dendrite morfologi i C. elegans. Detta system är avsett för analyser av dopaminerga neurodegeneration analyser med hjälp av genetiska, kemiska och åldersbaserade modeller av neurodegenerativa störningar.
Abstract
Dopamin neuron förlust är involverad i patologin av Parkinsons sjukdom (PD), en mycket utbredd neurodegenerativ störning som påverkar över 10 miljoner människor över hela världen. Eftersom många detaljer om PD etiologi fortfarande är okända, studier undersöka genetiska och miljömässiga bidragsgivare till PD behövs för att upptäcka metoder för förebyggande, förvaltning och behandling. Korrekt karakterisering av dopaminerg neuronal förlust kan vara relevant inte bara för PD forskning, men för andra alltmer utbredda neurodegenerativa störningar.
Det finns etablerade genetiska och kemiska modeller av dopaminerg neurodegeneration i Caenorhabditis elegans modellsystem, med enkel visualisering av neurobiologi stöds av nematodernas transparens och invariant neuronal arkitektur. I synnerhet kan hermafroditiska C. elegans dopaminergiska neuron morfologiska förändringar visualiseras med hjälp av stammar med fluorescerande reportrar drivna av cellspecifika promotorer såsom dat-1 dopamin transportör genen, som uttrycks uteslutande i sina åtta dopaminerga nervceller.
Med kapaciteten i detta modellsystem och lämplig teknik har många laboratorier studerat dopaminerg neurodegeneration. Det finns dock liten konsekvens i hur data analyseras och mycket av den nuvarande litteraturen använder binära poänganalyser som fångar närvaron av degeneration men inte de fullständiga detaljerna i progressionen av neuronförlust. Här introducerar vi ett universellt poängsystem för att bedöma morfologiska förändringar och degeneration i C. elegans' cephalic neuron dendrites. Denna sju-punktsskala möjliggör analys över ett komplett utbud av dendritmorfologi, allt från friska nervceller till fullständig dendritförlust och med tanke på morfologiska detaljer inklusive kinks, förgrening, blebs och pauser. Med detta poängsystem kan forskare kvantifiera subtila åldersrelaterade förändringar samt mer dramatiska kemiskt inducerade förändringar. Slutligen tillhandahåller vi en övningsuppsättning bilder med kommentarer som kan användas för att träna, kalibrera och bedöma forskarnas poängkonsistens som är ny för denna metod. Detta bör förbättras inom och mellan laboratoriekonsistens, öka noggrannheten och reproducerbarheten.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är en allt vanligare neurodegenerativ sjukdom som drabbar upp till 10 miljoner individer över hela världen1. Män och äldre individer har en högre risk att utveckla PD; den genomsnittliga åldern för sjukdomsuppkomst är 60 år, och PD-incidensen stiger från en 0,3% incidens i den allmänna befolkningen till 3% hos individer över 80 år1,2. Även om detaljerna i PD patologi inte är helt förstådda, innebär denna progressiva störning förlusten av dopaminerga nervceller i regionen substantia nigra i midbrain. Hypotetiska mekanismer för denna neuronala förlust innebär mitokondriell dysfunktion, oxidativ stress och inflammation2. Orsakerna och riskfaktorerna för sjukdomen undersöks fortfarande, men involverar en kombination av miljömässiga och genetiska faktorer1. Till exempel har studier funnit positiva samband mellan livslång användning av bekämpningsmedel och PD, liksom genetisk mottaglighet för familjär PD1,3.
C. elegans modellsystem, ursprungligen utvecklat delvis för neurobiologi forskning4, är väl lämpad för utvärdering av dopaminerg neuron förlust in vivo. Nass och kollegor banade väg för användningen av C. elegans för dopaminerg neurodegeneration5, och många grupper har sedan dess antagit masken som en framgångsrik modell för PD och dopaminerg dysfunktion6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans är bra neurodegenerativa sjukdomsmodeller av många av samma skäl att de är en så populär modellorganism för andra områden av biologi; deras transparens möjliggör in vivo-studier av cellulära processer, genetisk manipulering i maskar är relativt snabb och enkel, de har en kort generationstid på cirka tre dagar och de är lätta attupprätthålla 21. De flesta PD-maskmodeller faller i en av tre kategorier: åldersbaserade modeller, kemiska modeller och genetiska modeller. Förmågan att synkronisera en population av maskar möjliggör studier av åldersrelaterad neurodegeneration för en åldersbaserad modell av neurodegenerativa sjukdomar i samband med åldrande, såsom PD22. Kemiska exponeringar som inducerar PD-liknande neuronala defekter har fastställts med hjälp av en mängd olika kemikalier inklusive 6-hydroxydopamine (6-OHDA), rotenon och 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)22. Maskar används också framgångsrikt som genetiska modeller av PD; stammar med utvalda neurala gen knockouts kan modellera olika neurodegenerativasjukdomar 1,4. Kombinationer av genetiska och miljömässiga faktorer, eller "genmiljöinteraktioner", som sannolikt spelar en viktig roll i PD2,17,23,24,25,26,27,28, har undersökts av flera grupper som använder C. elegans. Slutligen, åldersrelaterad dopaminerg neurodegeneration har också observerats29,30. Om du använder en lämplig neural transgen stam i fluorescerande avbildning, någon av dessa PD mask modeller kan användas för att studera dopaminerg neurodegeneration.
Kvantifiera förändringar i neuronal morfologi är en kritisk komponent i neurodegenerativ forskning. I C. eleganshar många fluorescerande reporterstammar använts för att visualisera morfologiska förändringar och förlust av nervceller. Stammar som är lämpliga för neuronal avbildning har ett fluorescerande protein som är associerat med cellspecifika promotors. För dopaminerga neurodegeneration analyser, vårt laboratorium har använt BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] stam, som har en grön fluorescerande protein (GFP) tagg i dat-1 genen, uttryckt i dopaminerga nervceller. Observera att BY200:s rull fenotyp har en mycket låg genomträngande och sällan observeras. Andra vanliga stammar som används för denna typ av avbildning är BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], och flera andra tillgängliga från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) eller på begäran från specifika laboratorier1,21,22,29 . Dessa stammar tillåter vanligtvis visualisering av alla tre klasser av dopaminerga nervceller: cephalic (CEP), främre deirid (ADE) och postdeirid (PDE) nervceller. C. elegans uttrycker inte naturligt alfasynukleinproteinet, men stammar som BY273 har konstruerats för att uttrycka det. Vi noterar dock att poängsystemet vi presenterar utvecklades med BY200, som inte uttrycker alfasynuklein, och skulle behöva valideras med den stammen (eller någon annan ny stam) före användning. Ytterligare dopaminerga nervceller finns hos män men anses sällan eftersom män normalt består <1% av en C. elegans population. Här fokuserar vi på de fyra CEP dopaminerga nervceller som finns i huvudregionen C. elegans. Denna uppsättning neuroner är lätt beläget under fluorescerande mikroskopi, finns i både hermafrodit och manliga maskar, överlappar vanligtvis inte andra områden av auto-fluorescens och rapporteras ofta i maskstudier. Särskilt, även om dessa nervceller inte är myelinated, CEP dorsala (CEPD) nervceller är direkt utsatta för pseudocoelomic kroppsvätska där som CEP ventrala nervceller inte är. En hälsosam uppsättning CEP-dendriter visas vanligtvis som relativt raka, oavbrutna linjer. Degenererade dendriter kan visa någon kombination av oegentligheter och tecken på skada, inklusive uttalade prickar som kallas blebs längs dendritens linje och bryter i dendritens linje. Exempel på CEP-nervceller på olika nivåer av degeneration kan ses i figur 1.
Även om dopaminerg neurodegeneration studeras av ett växande antal C. elegans laboratorier, Det har varit en stor variation i analytiska metoder för kvantifiering av dopaminerga neuron skador29,31,32,33,34. Många publicerade studier har rapporterat om förekomsten eller frånvaron av CEP soma med ett binärt poängsystem av degenerativa kontra typiska eller vilda typ neuroner31,32. Dessa poängmetoder kan identifiera vissa stressfaktorer som inducerar neurodegeneration men inte kan kvantifiera detaljerna i utvecklingen av mer subtila neuronala skador, eller enkelt upptäcka skillnader mellan neurodegeneration som induceras av unika kemikalier eller andra variabler. Dessutom kan poängsystem som är fokuserade på cellkropparna inte vara känsliga för mindre allvarliga skador eller neuronala skador som endast påverkar en del av cellen, såsom dendriten. Eftersom dendriten verkar ha det största utbudet av konsekvent påvisbara morfologiska förändringar som svar på kemiska stressfaktorer, har vi valt dem som grund för vår analys. Poängsystemet vi presenterar här är modifierat från dendrit morfologibaserade flerpunktsvågar som tidigare har använts i vårt labb29,33. Detta system utvidgar dessa fem- och sexpunktsskalor till en sjupunktsskala för att ta hänsyn till åldersrelaterade morfologiska förändringar, såsom högre förväntat antal kinks i äldre vuxna dendriter, och för att skilja mellan allvarliga skador och fullständig dendritförlust. Syftet med att införa detta poängsystem är att ge förmågan att fånga en omfattande bild av neurodegeneration på alla nivåer av neuronal skada och ge ett universellt system för att stödja konsistens över C. elegan dopaminerg neurodegeneration forskning. Eftersom poängsättning i sig är subjektivt är det viktigt att maximera konsekvensen mellan individer som gör poäng och att förblinda målskytten för bildernas identitet med manuell blindning eller ett automatiskt bländande program35. För att förbättra konsekvensen presenterar vi en serie träningsbilder och använder JoVE:s videofunktioner för att visa vårt poängsystem i detalj. Vi rekommenderar att du använder ett system som både tillåter automatiserad blind poängsättning och gör det möjligt för målskytten att kvantifiera henne eller hans poängkonsistens genom att göra om en delmängd av bilderna. Detta är särskilt viktigt när man kombinerar eller jämför data från flera forskare, eller utbildar forskare som är nya på att göra poäng.
Protocol
1. Förbered maskar för avbildning
OBS: Se relaterad JoVE-videoartikel31:https://www.jove.com/v/835/
- För varje experimentell grupp, pipett eller plocka 20 till 30 maskar till en bildplattform som är kompatibel med bildmikroskopet. De vanligaste plattformarna inkluderar 2% agarose gel pads monterade på glasrutschbanor med entäckplatta 31 och 96-brunnsplattor som innehåller brunnsvolymer vid eller mindre än 100 μL flytande medium.
- Förlama maskarna genom att tillsätta 30-90 mM natriumazid (NaN3),2,5-8,5 mM levamisole HCl eller annat förlamande medel till maskarna. Om du förlamar i vätska, använd en högre koncentration av förlamande medel än om du förlamar på agarosekuddar. Tryck försiktigt på bildplattformen för att blanda.
- Låt maskar förlama helt.
OBS: Detta kan ta flera minuter.
2. Bild dopaminerga nervceller
- Hitta maskarnas huvudregioner under GFP-fluorescens med enfärgs gfp-fluorescens med hjälp av bildmikroskop som kan ta z-stackar.
- Var uppmärksam på exponering och bländarinställningar; undvika överexponering av dendriter och hålla inställningarna konsekventa under försöken. Gör dendriterna så ljusa som behövs för tydlig visualisering; Detta resulterar vanligtvis i överexponering av soma.
Bilder som ingår i det här protokollet togs med 400x förstoring.
- Var uppmärksam på exponering och bländarinställningar; undvika överexponering av dendriter och hålla inställningarna konsekventa under försöken. Gör dendriterna så ljusa som behövs för tydlig visualisering; Detta resulterar vanligtvis i överexponering av soma.
- Bläddra igenom fokus för att hitta övre och nedre gränser där dendriterna är tydliga. Ange dessa som övre och nedre gränser för en z-stack-bildinspelning.
- Klicka här om du vill ta z-stackbilder för varje mask.
OBS: Alla följande steg kan utföras när som helst.
3. Förbered dopaminerga neuronbilder för poängsättning
- För varje z-stack öppnar du bildfilen med antingen mikroskopprogramvaran eller en extern bildanalysprogramvara, laddar stacken i programvaran och komprimerar stacken till en enda förenklad bild.
- Blinda bilder mellan och inom behandlingsgrupper manuellt eller med hjälp av automatisk bländande programvara.
4. Poäng dopaminerga neuron dendriter
- Arbeta med en neuronbild i taget. Välj en av de fyra CEP-dendriterna för att bedöma för fläckar, raster och oegentligheter inklusive kurvor, kinks och kurvor. Poängsättning från vänster till höger när näsan är överst på bilden rekommenderas för att säkerställa repeterbarhet i poängsättning.
- Använd följande riktlinjer och tilldela detdriten ett poängvärde. Se bild 1 för representativa exempel på poängsättningsbilder.
0- ingen skada, "perfekta" nervceller
1- oregelbunden (kinks, kurvor, etc.)
2- <5 blebs
3- 5-10 blebs
4- >10 blebs och/eller brott som tar bort <25% av den totala dendriten
5- brott, 25-75% av dendriten borttagen
6- brott, >75% dendrit borttagen- Om flera kriterier uppfylls inom en enda dendrit (dvs. kinks och blebs), tilldela den högsta tillämpliga poängen.
- Poängförnek inte dendriter som inte är tydligt synliga på grund av problem med bildinspelning, överlappning med andra dendriter etc. Om du zoomar in på en förenklad z stack-bild bör du tänka på förstorade pixlar som liknar falska fläckar.
- Upprepa för varje dendrit. Upprepa för alla bilder.
- Spela in alla poäng. Poängen kan vara oblindade just nu.
5. Förbereda och presentera data
- Beräkna det totala antalet dendriter i varje behandlingsgrupp som tilldelas varje neurodegenerationspoäng. Beräkna det totala antalet poängspridare i varje behandlingsgrupp.
- Dividera neurodegeneration poäng tallies med det totala antalet dendriter poäng i behandlingsgruppen. Presentera data som andel dendriter inom en behandlingsgrupp vid varje neurodegenerationspoäng.
6. Utföra statistisk analys
- Använd en programmeringsprogramvara eller kör manuellt ett chi-squared test för oberoende mellan alla behandlingsgrupppar som ska jämföras. Vid behov tillämpa en Bonferroni-korrigering av p-värdet enligt antalet jämförda försöksgrupper för att ta hänsyn till flera jämförelser.
OBS: Detta test kommer att avgöra betydande skillnader mellan två grupper, men detaljer om typen av skillnad måste kvalificeras med ögat.- Välj jämförelser mellan experimentella grupper. Detta kommer att variera beroende på experimentell design.
OBS: I våra experiment jämförs vanligtvis kontroller med deras respektive behandlingsgrupper, alla kontroller jämförs och alla behandlingar jämförs.
- Välj jämförelser mellan experimentella grupper. Detta kommer att variera beroende på experimentell design.
7. Öva poängsättning med övningsuppsättning av dopaminerga neuronbilder
- Se kompletterande arkiv 1 för en uppsättning neuronbilder som presenterar över hela sortimentet av vårt poängsystem med kommentarer och poängnyckel. Denna uppsättning är avsedd att utbilda forskare som är nya för denna metod och säkerställa tillförlitlighet mellan hastigheter.
8. Överväg alternativa protokollalternativ
- I stället för att fånga z-staplar, slutför poängsättning vid mikroskopet, utan att spara eller stapla bilder.
OBS: Det här alternativet minskar kraven på teknikkapacitet, men tar bort möjligheten att skapa ett arkiv med neuronbilder att återgå till vid ett senare tillfälle, kräver manuell blindning och tillåter blindning endast mellan och inte inom behandlingsgrupper. - I stället för att skapa en enda komprimerad bild per stapel, slutför poängsättningen genom att bläddra igenom bilderna på varje z-stack.
OBS: Det här alternativet kan vara enklare för vissa målskyttar och det minskar risken för att se falska fläckar på maskar som rörde sig under avbildning och gör det möjligt att göra överlappande dendriter, men kräver manuell blindning och tillåter blindning endast mellan och inte inom behandlingsgrupper.
Representative Results
Poängsystemet som beskrivs här användes för att bedöma neurodegeneration i L4 larv steg BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans efter rotenon exponering. Resultaten av detta experiment visas i figur 2 och representerar vårt poängsystems förmåga att upptäcka och kvantifiera variabla nivåer av dopaminerga neuronskador. Rotenon är ett naturligt förekommande elektrontransportkedjekomplex som jag hämmar som används i vissa bekämpningsmedel, piscicider och insekticider36,37. Observera att arbete med giftiga kemikalier som rotenon i sig är farligt, och alla laboratorier bör följa alla användnings- och bortskaffanderegler som fastställts av deras institutioner. I detta experiment påbörjades flytande rotenonexponeringar vid två doser, 0, 03 μM och 0, 5 μM, tillsammans med en kontrollgrupp, omedelbart efter en natriumhydroxid på 0,5 M/1% natriumhypokloritlys för attskörda ägg 38. Ägg kläckta i komplett K-medium33,39 med 0,25% dimetylsulfoxid (DMSO), och maskar förblev flytande i ~ 48 timmar fram till mitten av L4 larvstadiet, då de togs bort från kemisk exponering och förbereddes, avbildades och, med hjälp av figur 1 som referens, poängs enligt protokollstegen ovan. För den högre dosen på 0, 5 μM rotenon skördades ägg 24 timmar i förväg för att ta hänsyn till en rotenoninducerad utvecklingsfördröjning och se till att alla maskar synkroniserades i stadiet vid tidpunkten för avbildningen.
Figur 2 visar vidare hur vårt laboratorium visualiserar data som samlas in med hjälp av detta poängsystem. I denna siffra kan ett dosberoende neurodegenerationssvar uppskattas, och den specifika uppdelningen av poängfördelningen visas tydligt. Dessa särskilda resultat visar hur neuronal skada kan presentera på olika sätt. Till exempel har gruppen 0,03 μM rotenonexponerad en minskad andel friska nervceller med en poäng på 0, jämfört med kontrollgruppen, men har också en minskad andel av 5 poäng. Att upptäcka den här detaljen om poängfördelningen mellan experimentella grupper belyser känsligheten i vårt sjupoängssystem. Dessa data analyserades för statistisk signifikans enligt protokollet, med hjälp av ett chi-squared test för oberoende med en Bonferroni korrigering.
Figur 1. Dopamin neuron morfologiska förändring och degeneration poängsystem representativa bilder. Detta konsoliderade diagram innehåller exempel på nervceller vid varje poäng och är avsett att användas som referens för poängsättning. Här motsvarar varje märkt poäng den mest skadade dendriten i varje mask, vilket indikeras av pilen i varje panel. Dessa bilder togs med hjälp av protokollet som beskrivs i detta dokument med BY200 C. elegans. Se kompletterande arkiv 1 för en uppsättning poängsade bilder med kommentarer som ska användas för att träna de som är nya i denna poängsättningsmetod. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. BY200 L4 dopamin neuron morfologi och degeneration poäng efter rotenon exponering. Den här siffran visar representativa resultat som analyserats med hjälp av de poängsättningsmetoder som beskrivs här. De visualiserade större proportionerna av skadade dopaminerga nervceller med högre rotenon exponering koncentrationer analyserades statistiskt med chi-kvadratiska tester för oberoende. Båda rotenonbehandlingsgrupperna gav statistiskt signifikanta p-värden jämfört med kontrollgruppen. Olika bokstäver anger statistisk skillnad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande akt 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande akt 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Detta protokoll visar hur man använder den sju-punktsskala som utvecklats i vårt laboratorium för att kvantifiera nivåerna av dopaminerg neuron morfologiska förändring och degeneration i C. elegans. Vi skapade och delade denna skala som ett verktyg för att standardisera analys av dopaminerg neurodegeneration arbete i maskar. Med tanke på vikten av att studera vägar som är involverade i mycket utbredda neurodegenerativa sjukdomar, drar många utredare nytta av C. elegans-modellens lämplighet för neurobiologivisualisering för att studera neurodegeneration29,31,32,33. Det har dock ännu inte varit ett försök att minska den stora variationen i hur neuronskador kvantifieras över neurodegeneration forskning i maskar. Det poängsystem som presenteras här är således avsett att främja konsekvens i analyserna och möjliggöra jämförelser mellan studier.
Vårt poängsystem kan användas för att analysera data som härrör från C. elegans experiment som använder cellspecifika fluorescerande reportrar som möjliggör visualisering av dopaminerga nervceller - särskilt CEP dendrites. Specifikt är stammar taggade vid dat-1 genen för GFP visualisering av dopaminerga nervceller kompatibla med detta poängprotokoll, även om många andra relaterade transgena modeller av PD finns. Det är möjligt att detta poängsystem också skulle vara användbart med dessa modeller. Detta bör dock valideras innan de används. I synnerhet är det möjligt (men inte testat enligt vår kunskap) stammar med mCherry kanske inte är väl lämpade för detta protokoll eftersom mCherry aggregering kan vara oskiljbar från fläckar eller leda till cellstress. Snarare än att ge en kommentar om alla specifika modeller av PD och relaterade neurodegenerativa störningar, fokuserar vi på poängsättning av neurodegeneration data själv. Dessutom fokuserar detta protokoll endast på neuronal morfologi och tar inte hänsyn till fluorescensnivåer i soma. Neurodegeneration analyser kan utföras tillsammans med beteendemässiga analyser som är relevanta för neurodegenerativa sjukdomar, såsom rörelse, livslängd och hälso-span experiment. Nivåer av degeneration i etablerade kemiska, åldersbaserade och genetiska modeller av PD kan också bekräftas och specificeras med hjälp av detta poängsystem. Att mäta modeller, bidragsgivare och vägar i samband med PD och andra neurodegenerativa sjukdomar kan öka den vetenskapliga kunskapen om dessa sjukdomar och peka mot hur man hanterar den växande befolkningen av drabbade individer. Att ha jämförbara neurodegeneration resultat över litteraturen är nyckeln till att stödja detta mål.
För att tolka resultaten som härrör från detta poängsystem föreslår vi att man överväger varje dendrit poäng som n = 1, eftersom olika nervceller inom samma mask ofta svarar olika på behandling. Detta kan drivas av det faktum att endast CEPD nervceller är direkt utsatta för pseudocoelomic kroppsvätska. Som sådan gör detta att poängspridningen för experimentella grupper kan visas som proportioner av det totala antalet dendriter som poängsätts i varje grupp. Denna metod, som används för de representativa resultaten som visas här, möjliggör enkel jämförelse mellan behandlingsgrupper, står för differentierade svar inom samma mask och analyseras enkelt med ett Chi-kvadratiskt test kompletterat med en Bonferroni-korrigering för flera jämförelser. En exempelmall för registrering av neuronpoäng och beräkningsprocent kan hittas i kompletterande fil 2. Vi har övervägt två alternativa metoder för dataanalys och identifierar brister i var och en. Det första alternativet är att beräkna poängen för de fyra CEP-nervcellerna för varje mask. Detta parametriser data; emellertid antar det ett linjärt förhållande med ökande poäng och förlorar information om eventuella variationer som svar på behandling inom samma mask. Det andra alternativet är att summera poängen för alla fyra CEP-nervcellerna för varje mask, vilket också parametriser data. Detta förutsätter fortfarande ett linjärt förhållande mellan poäng, men det står mer capably för skillnader inom varje mask än genomsnittliga poäng genom att utöka parametrarna för möjliga poäng. Hur enskilda forskare än bestämmer sig för att visa sina data bör resultaten beaktas tillsammans med experimentella variabler som stam- och maskålder. Äldre maskar har till exempel en högre förväntad baslinjenivå för degeneration.
Eftersom dessa resultat av neurodegenerationspoäng tolkas bör forskare också vara medvetna om några varningar och begränsningar av poängmetoden. För det första är vissa tekniska krav nödvändiga för att fånga bilder som är lämpliga för poängsättning. Bildmikroskopet måste stödja fluorescenskanaler och förstorings- och exponeringsinställningar som möjliggör tydlig visualisering av CEP-dendriter. Som anges i protokollet kan tekniska krav minskas genom protokolljusteringar som att poängsätta livebilder genom det mikroskopiska fältet snarare än att ta bilder som ska arkiveras och poängsätts vid ett senare tillfälle. För det andra är möjliga statistiska analysmetoder för dessa data begränsade eftersom uppgifterna inte är parametriska. Poängskalan antas vara progressiv, men kan inte anses numerisk eftersom det finns diskreta poängalternativ och poängökningar inte nödvändigtvis står i proportion till varandra när det gäller biologisk funktion. Av dessa skäl är chi-kvadratiska tester för oberoende bäst lämpade för denna typ av uppgifter, vilket innebär att den statistiska analysen är beroende av observatören för att bestämma riktningen för någon statistisk signifikans. I synnerhet analyserar chi-squared-testet också bara skillnader i poängfördelning och kan inte ge bevis på skillnader i specifika poängkategorier. Slutligen har den funktionella betydelsen av de morfologiska förändringar som kvantifierats av detta poängsystem ännu inte studerats.
De framtida riktningarna som föranleds av utvecklingen av detta poängsystem innebär att bestämma biologiska baser och korrelationer med individuella neuronpoäng. Att studera den funktionella betydelsen (t.ex. neuronal signalering, maskbeteende) av alla punkter på poängskalan kommer att informera hur man bättre översätter resultat till slutsatser som är tillämpliga på att förstå orsakerna till och konsekvenserna av neurodegenerativa sjukdomar och utveckla förebyggande och behandlingsalternativ. Framtida forskning om neurodegeneration hos maskar bör syfta till att upptäcka kopplingar till annan morfologi, såsom maskform och storlek. Dessutom kan neurodegeneration forskning stödjas genom att studera andra reporter C. elegans stammar för att mäta endpoints såsom bioenergi, reaktiv syre arter produktion och mitokondriell morfologi.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Vi vill erkänna Ian T. Ryde, för bidrag till utvecklingen av poängskalan och för hans stöd under skapandet av detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (T32ES021432 stödde KSM och P42ES010356 till JNM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3x1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
References
- Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson's Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
- Hayes, M. T. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
- Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson's disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1973).
- Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
- Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
- Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
- Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson's disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
- Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R. Manganese and C. elegans in Parkinson's disease. Parkinson's Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. Nass, R., Przedborski, S. , Elsevier Inc. (2008).
- Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson's Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
- Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson's Disease in C. elegans. Journal of Parkinson's Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
- Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson's disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
- Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
- Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
- Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
- Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
- Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
- Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
- Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
- Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
- Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
- Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson's disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
- Lesage, S., Brice, A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
- Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson's Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
- Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson's disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson's Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
- Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
- Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
- Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
- Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson's disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
- Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
- Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
- Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
- Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
- Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
- National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
- Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).
