Summary
I denne artikkelen viser vi hvordan du bruker et syv-punkts poengsystem for konsekvent å kvantifisere endringer i dopaminerg nevron dendrit morfologi i C. elegans. Dette systemet er beregnet på analyser av dopaminerge nevrodegenerasjonsanalyser ved hjelp av genetiske, kjemiske og aldersbaserte modeller av nevrodegenerative lidelser.
Abstract
Dopamin neuron tap er involvert i patologien til Parkinsons sykdom (PD), en svært utbredt nevrodegenerativ lidelse som rammer over 10 millioner mennesker over hele verden. Siden mange detaljer om PD-etiologi forblir ukjente, er det nødvendig med studier som undersøker genetiske og miljømessige bidragsytere til PD for å oppdage metoder for forebygging, ledelse og behandling. Riktig karakterisering av dopaminerge nevrontap kan være relevant ikke bare for PD-forskning, men for andre stadig mer utbredte nevrodegenerative lidelser.
Det er etablerte genetiske og kjemiske modeller av dopaminerg nevrodegenerasjon i Caenorhabditis elegans modellsystem, med enkel visualisering av nevrobiologi støttet av nematodenes gjennomsiktighet og invariant nevronarkitektur. Spesielt kan hermafroditiske C. elegans dopaminerge nevronmorfologiske endringer visualiseres ved hjelp av stammer med fluorescerende reportere drevet av cellespesifikke promotorer som dat-1 dopamintransportørgenet, som uttrykkes utelukkende i sine åtte dopaminerge nevroner.
Med evnene til dette modellsystemet og riktig teknologi har mange laboratorier studert dopaminerg nevrodegenerasjon. Det er imidlertid liten konsistens i måten dataene analyseres på, og mye av den nåværende litteraturen bruker binære scoringsanalyser som fanger opp tilstedeværelsen av degenerasjon, men ikke de fullstendige detaljene i progresjonen av nevrontap. Her introduserer vi et universelt poengsystem for å vurdere morfologiske endringer og degenerasjon i C. elegans' cephalic neuron dendrites. Denne syvpunktsskalaen muliggjør analyse på tvers av et komplett spekter av dendritmorfologi, alt fra sunne nevroner til fullstendig dendrittap, og vurderer morfologiske detaljer, inkludert kinks, forgrening, blebs og pauser. Med dette poengsystemet kan forskere kvantifisere subtile aldersrelaterte endringer samt mer dramatiske kjemiske induserte endringer. Til slutt gir vi et øvelsessett med bilder med kommentarer som kan brukes til å trene, kalibrere og vurdere skåringskonsistensen til forskere som er nye på denne metoden. Dette bør forbedres innen- og mellomlaboratoriets konsistens, noe som øker strengheten og reproduserbarheten.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er en stadig mer vanlig nevrodegenerativ sykdom som rammer opptil 10 millioner individer over hele verden1. Hanner og eldre individer har høyere risiko for å utvikle PD; Gjennomsnittsalderen for utbruddet for sykdommen er 60 år, og PD-forekomsten stiger fra en 0,3% forekomst i befolkningen generelt til 3% hos personer over 80 år1,2. Selv om detaljene i PD-patologi ikke er fullt ut forstått, innebærer denne progressive lidelsen tap av dopaminerge nevroner i substantia nigra-regionen i midbrain. Hypotetiske mekanismer for dette nevronale tapet involverer mitokondrie dysfunksjon, oksidativt stress og betennelse2. Årsakene og risikofaktorene for sykdommen blir fortsatt utforsket, men innebærer en kombinasjon av miljømessige og genetiske faktorer1. For eksempel har studier funnet positive assosiasjoner mellom livslang bruk av plantevernmidler og PD, samt genetisk følsomhet for familiær PD1,3.
C. elegans modellsystem, opprinnelig utviklet delvis for nevrobiologi forskning4, er godt egnet for evaluering av dopaminerge nevron tap in vivo. Nass og kolleger pionerer bruken av C. elegans for dopaminerg nevrodegenerasjon5, og mange grupper har siden vedtatt ormen som en vellykket modell for PD og dopaminerg dysfunksjon6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans er gode nevrodegenerative sykdomsmodeller av mange av de samme grunnene som de er en så populær modellorganisme for andre områder av biologi; deres åpenhet tillater in vivo-studie av cellulære prosesser, genetisk manipulasjon i ormer er relativt rask og enkel, de har en kort generasjonstid på omtrent tre dager, og de er enkle å vedlikeholde21. De fleste PD-ormmodeller faller inn i en av tre kategorier: aldersbaserte modeller, kjemiske modeller og genetiske modeller. Evnen til å synkronisere en populasjon av ormer gjør det mulig å studere aldersrelatert nevrodegenerasjon for en aldersbasert modell av nevrodegenerative sykdommer forbundet med aldring, for eksempel PD22. Kjemiske eksponeringer som induserer PD-lignende nevronfeil er etablert ved hjelp av en rekke kjemikalier, inkludert 6-hydroksydopamin (6-OHDA), rotenon og 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)22. Ormer brukes også vellykket som genetiske modeller av PD; stammer med utvalgte nevrale gen knockouts kan modellere ulike nevrodegenerative sykdommer1,4. Kombinasjoner av genetiske og miljømessige faktorer, eller "gen-miljø interaksjoner", som sannsynligvis spiller en viktig rolle i PD2,17,23,24,25,26,27,28, har blitt undersøkt av flere grupper ved hjelp av C. elegans. Til slutt har aldersrelatert dopaminerg nevrodegenerasjon også blitt observert29,30. Hvis du bruker en passende nevral transgen stamme i fluorescerende avbildning, kan noen av disse PD-ormemodellene brukes til å studere dopaminerg nevrodegenerasjon.
Kvantifisering av endringer i nevronal morfologi er en kritisk komponent i nevrodegenerativ forskning. I C. eleganshar mange fluorescerende reporterstammer blitt brukt til å visualisere morfologiske endringer og tap av nevroner. Stammer egnet for nevronal avbildning har et fluorescerende protein forbundet med cellespesifikke promotorer. For dopaminerge nevrodegenerasjonsanalyser har laboratoriet vårt brukt BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] stamme, som har en grønn fluorescerende protein (GFP) tag i dat-1-genet, uttrykt i de dopaminerge nevronene. Vær oppmerksom på at BY200s rullefenotype har en svært lav penetrans og sjelden observeres. Andre vanlige stammer som brukes til denne typen avbildning inkluderer BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], og flere andre tilgjengelige fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) eller på forespørsel fra spesifikke laboratorier1,21,22,29 . Disse stammene tillater vanligvis visualisering av alle tre klasser av dopaminerge nevroner: cephalic (CEP), fremre deirid (ADE) og postdeirid (PDE) nevroner. C. elegans uttrykker ikke naturlig alfa synucleinproteinet, men stammer som BY273 er konstruert for å uttrykke det. Vi merker oss imidlertid at poengsystemet vi presenterer ble utviklet ved hjelp av BY200, som ikke uttrykker alfasynuclein, og må valideres med den belastningen (eller annen ny stamme) før bruk. Ytterligere dopaminerge nevroner er tilstede hos menn, men vurderes sjelden fordi menn normalt utgjør <1% av en C. elegans befolkning. Her fokuserer vi på de fire CEP dopaminerge nevronene som finnes i hoderegionen C. elegans. Dette settet med nevroner er lett plassert under fluorescerende mikroskopi, er til stede i både hermafroditt og mannlige ormer, overlapper vanligvis ikke med andre områder av auto-fluorescens, og rapporteres ofte i ormstudier. Spesielt, selv om disse nevronene ikke er myelinerte, er CEP-dorsale (CEPD) nevroner direkte utsatt for pseudocoelomic kroppsvæske der cep ventrale nevroner ikke er. Et sunt sett med CEP-dendritter vises vanligvis som relativt rette, uavbrutte linjer. Degenererte dendritter kan vise en hvilken som helst kombinasjon av uregelmessigheter og tegn på skade, inkludert uttalt prikker kalt blebs langs linjen av dendritten og bryter i dendrittens linje. Eksempler på CEP-nevroner på ulike nivåer av degenerasjon kan ses i figur 1.
Selv om dopaminerg nevrodegenerasjon studeres av et økende antall C. elegans laboratorier, har det vært stor variasjon i analytiske metoder for kvantifisering av dopaminerge nevronskader29,31,32,33,34. Mange publiserte studier har rapportert om tilstedeværelse eller fravær av CEP soma med et binært poengsystem av degenerativ versus typisk eller vill type nevroner31,32. Disse scoringsmetodene kan identifisere visse stressfaktorer som induserer nevrodegenerasjon, men ikke kan kvantifisere detaljene i progresjonen av mer subtil nevronskade, eller lett oppdage forskjeller mellom nevrodegenerasjon som indusert av unike kjemikalier eller andre variabler. I tillegg kan det hende at poengsystemer som fokuserer på cellelegemene, ikke er følsomme for mindre alvorlige nivåer av skade eller nevronskade som bare påvirker en del av cellen, for eksempel dendritten. Siden dendritten ser ut til å ha det største spekteret av konsekvent påvisbare morfologiske endringer som svar på kjemiske stressorer, har vi valgt dem som grunnlag for vår analyse. Poengsystemet vi presenterer her er modifisert fra dendrit morfologi basert multi-punkt skalaer som tidligere har blitt brukt i vår lab29,33. Dette systemet utvider disse fem- og sekspunktsskalaene til en syvpunkts skala for å ta høyde for aldersrelaterte morfologiske endringer, for eksempel høyere forventet antall kinks hos eldre voksne dendritter, og for å skille mellom alvorlig skade og fullstendig dendrittap. Hensikten med å introdusere dette poengsystemet er å gi muligheten til å fange et omfattende bilde av nevrodegenerasjon på alle nivåer av nevronskade og gi et universelt system for å støtte konsistens på tvers av C. elegan dopaminerg nevrodegenerasjonsforskning. Fordi poengregning i seg selv er subjektivt, er det viktig å maksimere konsistensen mellom enkeltpersoner som skårer, og å blinde scoreren til identiteten til bildene ved hjelp av manuell blinding eller et automatisk blindingsprogram35. For å forbedre konsistensen presenterer vi en rekke treningsbilder og bruker JoVE sine videofunksjoner for å demonstrere vårt poengsystem i detalj. Vi anbefaler at du bruker et system som begge tillater automatisert blindet poengregning, og som gjør det mulig for målscoreren å kvantifisere henne eller hans poengkonsistens ved å score et delsett av bilder på nytt. Dette er spesielt viktig når du kombinerer eller sammenligner data fra flere forskere, eller trener forskere som er nye i å score.
Protocol
1. Forbered ormer for avbildning
MERK: Se relatert JoVE-videoartikkel31: https://www.jove.com/v/835/
- For hver eksperimentell gruppe, pipette eller velg 20 til 30 ormer til en bildeplattform som er kompatibel med bildemikroskopet. De vanligste plattformene inkluderer 2% agarose gel pads montert på glasssklier meden dekslelip 31 og 96-brønns plater som inneholder brønnvolumer på eller mindre enn 100 μL flytende medium.
- Lamme ormene ved å legge til 30-90 mM natriumazid (NaN3), 2,5-8,5 mM levamisol HCl, eller annet lammende middel til ormene. Hvis lammende i væske, bruk en høyere konsentrasjon av lammende middel enn hvis lammende på agarose pads. Trykk forsiktig på bildeplattformen for å blande.
- La ormer lamme helt.
MERK: Dette kan ta flere minutter.
2. Bilde dopaminerge nevroner
- Finn ormenes hoderegioner under enfarget GFP-fluorescens ved hjelp av bildemikroskop som er i stand til å ta z-stabler.
- Vær oppmerksom på eksponerings- og blenderåpningsinnstillinger; unngå overeksponering av dendritter og holde innstillingene konsekvente på tvers av forsøk. Gjør dendrittene så lyse som nødvendig for klar visualisering; Dette resulterer vanligvis i overeksponering av soma.
MERK: Bilder som er inkludert i denne protokollen, ble tatt med 400x forstørrelse.
- Vær oppmerksom på eksponerings- og blenderåpningsinnstillinger; unngå overeksponering av dendritter og holde innstillingene konsekvente på tvers av forsøk. Gjør dendrittene så lyse som nødvendig for klar visualisering; Dette resulterer vanligvis i overeksponering av soma.
- Bla gjennom fokus for å finne øvre og nedre grenser der dendrittene er klare. Angi disse som øvre og nedre grenser for et z-stack-bildeopptak.
- Klikk for å ta z-stack-bilder for hver orm.
MERK: Alle følgende trinn kan utføres når som helst.
3. Forbered dopaminerge nevronbilder for scoring
- For hver z-stack åpner du bildefilen ved hjelp av enten mikroskopprogramvaren eller en ekstern bildeanalyseprogramvare, laster inn stakken i programvaren og komprimerer stakken til ett enkelt sammenslått bilde.
- Blinde bilder mellom og innenfor behandlingsgrupper manuelt eller ved hjelp av automatisk blinding programvare.
4. Score Dopaminergic Neuron Dendrites
- Arbeid med ett nevronbilde om gangen. Velg en av de fire CEP-dendrittene du vil vurdere for blebs, pauser og uregelmessigheter, inkludert bøyninger, knekk og kurver. Å score fra venstre til høyre når nesen er øverst i bildet anbefales for å sikre repeterbarhet i scoring.
- Bruk følgende retningslinjer til å tilordne én poengsumverdi til dendritten. Se figur 1 hvis du vil se eksempler på representativ poengregning.
0- ingen skade, "perfekte" nevroner
1- uregelmessig (knekk, kurver, etc.)
2- <5 blebs
3- 5-10 blebs
4- >10 blebs og/eller brudd som fjerner <25 % av total dendrit
5- brudd, 25-75% av dendritten fjernet
6- brudd, >75% dendrit fjernet- Hvis flere kriterier oppfylles innenfor en enkelt dendrit (dvs. kinks og blebs), tilordner du den høyeste aktuelle poengsummen.
- Ikke score dendritter som ikke er tydelig synlige, på grunn av problemer med bildeopptak, overlapping med andre dendritter, etc. Hvis du zoomer inn på et sammenslått z-stakkbilde, må du være oppmerksom på forstørrede bildepunkter som ligner falske flekker.
- Gjenta for hver dendrit. Gjenta dette for alle bilder.
- Registrer alle poengsummer. Poengsummer kan være ikke-blindet for øyeblikket.
5. Forbered og presenter data
- Beregn totalt antall dendritter i hver behandlingsgruppe som er tildelt hver nevrodegenerasjonsskår. Beregn totalt antall skårede dendritter i hver behandlingsgruppe.
- Del neurodegenerasjonspoengene med det totale antallet dendritter scoret i behandlingsgruppen. Presentere data som en andel av dendritter i en behandlingsgruppe ved hver nevrodegenerasjonsskår.
6. Utføre statistisk analyse
- Bruk en programmeringsprogramvare eller kjør manuelt en kjikvadrert test for uavhengighet mellom alle behandlingsgruppepar som skal sammenlignes. Når det er hensiktsmessig, bruk en Bonferroni-korreksjon av p-verdien i henhold til antall sammenlignede eksperimentelle grupper for å gjøre rede for flere sammenligninger.
MERK: Denne testen vil avgjøre signifikante forskjeller mellom to grupper, men detaljer om typen forskjell må kvalifiseres for øyet.- Velg sammenligninger mellom eksperimentelle grupper. Dette vil variere basert på eksperimentell design.
MERK: I våre eksperimenter sammenlignes vanligvis kontroller med deres respektive behandlingsgrupper, alle kontroller sammenlignes, og alle behandlinger sammenlignes.
- Velg sammenligninger mellom eksperimentelle grupper. Dette vil variere basert på eksperimentell design.
7. Øv deg på å score med øvelsessett med dopaminerge nevronbilder
- Se Tilleggsfil 1 for et sett med neuronbilder som presenterer over hele spekteret av vårt poengsystem med kommentar- og poengsumnøkkel. Dette praksissettet er ment å trene forskere som er nye på denne metoden og sikre inter-rater pålitelighet.
8. Vurder alternative protokollalternativer
- I stedet for å ta z-stabler, fullfører du poengberegningen på mikroskopet, uten å lagre eller stable bilder.
MERK: Dette alternativet reduserer kravene til teknologifunksjoner, men fjerner muligheten for å opprette et arkiv med nevronbilder for å gå tilbake til på et senere tidspunkt, krever manuell blinding og tillater blinding bare mellom og ikke innenfor behandlingsgrupper. - I stedet for å opprette ett enkelt komprimert bilde per stakk, fullfører du poengberegningen ved å bla gjennom bildene av hver z-stakk.
MERK: Dette alternativet kan være enklere for noen scorere, og det reduserer risikoen for å se falske flekker på ormer som beveget seg under avbildning og tillater å score overlappende dendritter, men krever manuell blinding og tillater blinding bare mellom og ikke innenfor behandlingsgrupper.
Representative Results
Scoringssystemet beskrevet her ble brukt til å vurdere nevrodegenerasjon i L4 larval stadium BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans etter rotenone eksponering. Resultatene av dette eksperimentet er vist i figur 2 og representerer vårt poengsystems evne til å oppdage og kvantifisere variable nivåer av dopaminerge nevronskader. Rotenone er et naturlig forekommende elektrontransportkjedekompleks jeg hemmer som brukes i noen plantevernmidler, piscicider og insektmidler36,37. Vær oppmerksom på at arbeid med giftige kjemikalier som rotenon er iboende farlig, og alle laboratorier bør overholde alle bruks- og avhendingsforskrifter fastsatt av deres institusjoner. I dette eksperimentet ble flytende rotenoneksponeringer ved to doser, 0,03 μM og 0,5 μM, sammen med en kontrollgruppe, påbegynt umiddelbart etter en 0,5 M natriumhydroksid / 1% natriumhypoklorittlys for å høste egg38. Egg klekket ut i komplett K-medium33,39 med 0,25% dimetylsulfoksid (DMSO), og ormer forble i væske i ~ 48 timer til midten av L4 larvalstadiet, da de ble fjernet fra kjemisk eksponering, og forberedt, avbildet og, ved hjelp av figur 1 som referanse, scoret i henhold til protokolltrinnene ovenfor. For den høyere dosen på 0,5 μM rotenon ble egg høstet 24 timer i forveien for å gjøre rede for en rotenonindusert utviklingsforsinkelse og sikre at alle ormer ble stadiumsynkronisert på tidspunktet for avbildning.
Figur 2 viser videre hvordan laboratoriet visualiserer data som samles inn ved hjelp av dette poengsystemet. I denne figuren kan en doseavhengig nevrodegenerasjonsrespons verdsettes, og den spesifikke nedbrytingen av poengsumfordelingen vises tydelig. Disse spesielle resultatene viser hvordan nevronskade kan presenteres på forskjellige måter. For eksempel har den 0,03 μM rotenone-eksponerte gruppen en redusert andel sunne nevroner med en poengsum på 0, sammenlignet med kontrollgruppen, men har også en redusert andel på 5 score. Å oppdage denne detaljen om resultatfordelingene mellom eksperimentelle grupper fremhever følsomheten til vårt syv-punkts poengsystem. Disse dataene ble analysert for statistisk signifikans i henhold til protokollen, ved hjelp av en kjikvadrert test for uavhengighet med en Bonferroni-korreksjon.
Figur 1. Dopamin neuron morfologisk endring og degenerasjon scoring system representative bilder. Dette konsoliderte diagrammet inneholder eksempler på nevroner ved hver poengsum og er ment å brukes som referanse for poengregning. Her tilsvarer hver merket poengsum den mest skadede dendritten i hver orm, som angitt av pilen i hvert panel. Disse bildene ble tatt ved hjelp av protokollen som er beskrevet i dette dokumentet med BY200 C. elegans. Se Tilleggsfil 1 for et sett med poengbilder med kommentarer som skal brukes til å trene de som er nye på denne poengberegningsmetoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. BY200 L4 dopamin neuron morfologi og degenerasjon score etter rotenon eksponering. Denne illustrasjonen viser representative resultater analysert ved hjelp av poengberegningsmetodene som er beskrevet her. De visualiserte større proporsjonene av skadede dopaminerge nevroner med høyere rotenoneksponeringskonsentrasjoner ble statistisk analysert ved hjelp av kjikvadrattester for uavhengighet. Begge rotenonbehandlingsgruppene ga statistisk signifikante p-verdier sammenlignet med kontrollgruppen. Ulike bokstaver indikerer statistisk differanse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne protokollen demonstrerer hvordan du bruker syvpunktsskalaen utviklet i vårt laboratorium for å kvantifisere nivåer av dopaminerg nevron morfologiske endringer og degenerasjon i C. elegans. Vi opprettet og delte denne skalaen som et verktøy for å standardisere analyse av dopaminerg nevrodegenerasjonsarbeid i ormer. Ved å erkjenne viktigheten av å studere veier som er involvert i svært utbredte nevrodegenerative sykdommer, utnytter mange etterforskere C. elegans-modellens egnethet for nevrobiologivisualisering for å studere nevrodegenerasjon29,31,32,33. Imidlertid har det ennå ikke vært et forsøk på å redusere den store variasjonen i hvordan nevronskade kvantifiseres på tvers av nevrodegenerasjonsforskning i ormer. Poengsystemet som presenteres her er dermed ment å fremme konsistens i analyser og muliggjøre sammenligning mellom studier.
Vårt poengsystem kan brukes til å analysere data avledet fra C. elegans eksperimenter som bruker cellespesifikke fluorescerende reportere som tillater visualisering av dopaminerge nevroner - spesielt CEP dendritter. Spesielt stammer merket på dat-1-genet for GFP-visualisering av de dopaminerge nevronene er kompatible med denne scoringsprotokollen, selv om mange andre relaterte transgene modeller av PD eksisterer. Det er mulig at dette poengsystemet også vil være nyttig med disse modellene; Dette bør imidlertid valideres før du bruker dem. Spesielt er det mulig (men ikke testet til vår kunnskap) stammer med mCherry kan ikke være godt egnet for denne protokollen som mCherry aggregering kan være uutslettelig fra blebs eller føre til celle stress. I stedet for å gi en kommentar til alle spesifikke modeller av PD og relaterte nevrodegenerative lidelser, fokuserer vi på scoring av nevrodegenerasjonsdata selv. I tillegg fokuserer denne protokollen bare på nevronal morfologi og vurderer ikke fluorescensnivåer av soma. Neurodegenerasjonsanalyser kan utføres sammen med atferdsanalyser som er relevante for nevrodegenerative sykdommer, som bevegelse, levetid og helse-span eksperimenter. Nivåer av degenerasjon i etablerte kjemiske, aldersbaserte og genetiske modeller av PD kan også bekreftes og detaljert ved hjelp av dette poengsystemet. Måling av modeller, bidragsytere og veier knyttet til PD og andre nevrodegenerative sykdommer kan legge til den vitenskapelige kunnskapen om disse lidelsene og peke på hvordan man skal håndtere den voksende befolkningen av berørte individer. Å ha sammenlignbare nevrodegenerasjonsresultater på tvers av litteratur er nøkkelen til å støtte dette målet.
For å tolke resultatene fra dette poengsystemet foreslår vi å vurdere hver dendrite scoret som n = 1, fordi forskjellige nevroner innenfor samme orm ofte reagerer annerledes på behandlingen. Dette kan være drevet av det faktum at bare CEPD-nevronene er direkte utsatt for pseudocoelomic kroppsvæske. Som sådan gjør dette at poengsumspredningen av eksperimentelle grupper kan vises som proporsjoner av det totale antallet dendritter scoret i hver gruppe. Denne metoden, som brukes for de representative resultatene som vises her, gir enkel sammenligning på tvers av behandlingsgrupper, står for differensialresponser innenfor samme orm, og analyseres enkelt med en Chi-kvadrert test komplimentert av en Bonferroni-korreksjon for flere sammenligninger. Du finner en eksempelmal for registrering av neuron-poengsummer og beregningsprosenter i Tilleggsfil 2. Vi har vurdert to alternative metoder for dataanalyse og identifisere feil i hver. Det første alternativet er å beregne gjennomsnittet av poengsummene til de fire CEP-nevronene for hver orm. Dette parametrizes dataene; Det forutsetter imidlertid et lineært forhold til økende poengsum og mister informasjon om eventuelle variasjoner som svar på behandling innenfor samme orm. Det andre alternativet er å summere poengsummene til alle fire CEP-nevronene for hver orm, som også parametrizes dataene. Dette forutsetter fortsatt en lineær sammenheng mellom poengsummene, men det utgjør mer kapabelt forskjeller i hver orm enn gjennomsnittlige poengsummer ved å utvide parametrene for mulige poengsummer. Men individuelle forskere bestemmer seg for å vise dataene sine, resultatene bør vurderes sammen med eksperimentelle variabler som belastning og ormalder; Eldre ormer har for eksempel et høyere forventet grunnlinjenivå for degenerasjon.
Ettersom disse resultatene av nevrodegenerasjonspoeng tolkes, bør forskerne også være klar over noen få advarsler og begrensninger i poengberegningsmetoden. For det første er visse teknologiske krav nødvendige for å fange bilder som passer for scoring. Bildemikroskopet må støtte fluorescenskanaler og forstørrelses- og eksponeringsinnstillinger som muliggjør klar visualisering av CEP-dendritter. Som nevnt i protokollen, kan teknologiske krav reduseres ved protokolljusteringer som å score levende bilder gjennom det mikroskopiske feltet i stedet for å fange bilder som skal arkiveres og scores på et senere tidspunkt. For det andre er mulige statistiske analysemetoder for disse dataene begrenset siden dataene ikke er parametriske. Poengskalaen antas å være progressiv, men kan ikke betraktes som numerisk siden det er diskrete scorealternativer og scoreøkninger ikke nødvendigvis er proporsjonale med hverandre med hensyn til biologisk funksjon. Av disse grunnene er chi-kvadrerte tester for uavhengighet best egnet for denne typen data, noe som betyr at den statistiske analysen avhenger av observatøren for å bestemme retningen av statistisk signifikans. Spesielt analyserer den kjikvadriske testen også bare for forskjeller i poengsumfordeling og kan ikke gi bevis på forskjeller i spesifikke poengkategorier. Til slutt har den funksjonelle betydningen av de morfologiske endringene kvantifisert av dette poengsystemet ennå ikke blitt studert.
De fremtidige retningene forårsaket av utviklingen av dette poengsystemet innebærer å bestemme biologiske baser og korrelasjoner med individuelle nevronresultater. Å studere den funksjonelle betydningen (f.eks. nevronal signalering, ormadferd) av alle punkter på skåringsskalaen vil informere hvordan man bedre kan oversette resultater til konklusjoner som gjelder for å forstå årsakene og konsekvensene av nevrodegenerative sykdommer og utvikle forebyggings- og behandlingsalternativer. Fremtidig forskning på nevrodegenerasjon i ormer bør ta sikte på å oppdage forbindelser til annen morfologi, for eksempel ormform og størrelse. I tillegg kan nevrodegenerasjonsforskning støttes ved å studere andre reporter C. elegans stammer for å måle endepunkter som bioenergetikk, reaktiv oksygenartproduksjon og mitokondriemorfologi.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne Ian T. Ryde, for bidrag til utviklingen av skåringsskalaen og for hans støtte under opprettelsen av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (T32ES021432 støttet KSM, og P42ES010356 til JNM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3x1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
References
- Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson's Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
- Hayes, M. T. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
- Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson's disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1973).
- Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
- Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
- Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
- Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson's disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
- Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R. Manganese and C. elegans in Parkinson's disease. Parkinson's Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. Nass, R., Przedborski, S. , Elsevier Inc. (2008).
- Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson's Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
- Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson's Disease in C. elegans. Journal of Parkinson's Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
- Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson's disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
- Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
- Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
- Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
- Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
- Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
- Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
- Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
- Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
- Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
- Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson's disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
- Lesage, S., Brice, A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
- Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson's Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
- Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson's disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson's Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
- Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
- Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
- Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
- Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson's disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
- Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
- Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
- Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
- Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
- Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
- National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
- Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).
