Summary
この記事では、7点スコアリングシステムを使用して 、C.エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロンデンドライト形態の変化を一貫して定量化する方法を紹介します。このシステムは、神経変性疾患の遺伝的、化学的、および年齢ベースのモデルを利用したドーパミン作動性神経変性アッセイの分析を目的としています。
Abstract
ドーパミンニューロンの喪失は、パーキンソン病(PD)、世界中の1000万人以上の人々に影響を与える非常に普及した神経変性疾患の病理に関与しています。PD病因に関する多くの詳細は不明であるため、PDの遺伝的および環境的貢献者を調査する研究は、予防、管理、および治療の方法を発見するために必要とされている。ドーパミン作動性神経細胞喪失の適切な特徴付けは、PD研究だけでなく、他のますます流行している神経変性疾患にも関連している可能性がある。
線虫の透明性と不変神経アーキテクチャによって支えられている神経生物学の容易な視覚化と 、カエノハブディティスエレガンス モデルシステムのドーパミン作動性神経変性の確立された遺伝的および化学的モデルがある。特に、雌雄同体 C.エレガンスの ドーパミン作動性ニューロン形態学的変化は、8つのドーパミン性ニューロンで独占的に発現される dat-1 ドーパミントランスポーター遺伝子などの細胞特異的プロモーターによって駆動される蛍光レポーターとの株を使用して視覚化することができる。
このモデルシステムの能力と適切な技術を用いて、多くの研究所はドーパミン作動性神経変性を研究してきました。しかし、データの分析方法にはほとんど一貫性がなく、本文献の多くは変性の存在を捉えるバイナリスコアリング分析を使用していますが、ニューロン喪失の進行の完全な詳細は捉えていない。ここでは 、C.エレガンスの頭蓋ニューロンデンドライトにおける形態変化と変性を評価するための普遍的なスコアリングシステムを紹介する。この7点スケールは、健康なニューロンから樹状突起の損失を完了し、キンク、分岐、ブレブ、およびブレークを含む形態学的詳細を考慮する、樹状突起形態の全範囲にわたる分析を可能にする。このスコアリングシステムにより、研究者は微妙な加齢に伴う変化と、より劇的な化学的誘発変化を定量化することができます。最後に、この方法に新しい研究者の採点一貫性をトレーニング、較正、評価するために使用できる解説を用いて、一連の画像を実践します。これは、実験室内および実験室間の一貫性を向上させ、厳格さと再現性を高める必要があります。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、世界中で最大1000万人の個人に影響を与えるますます一般的な神経変性疾患です 1.男性および高齢者はPDを発症するリスクが高い;この疾患の発症の平均年齢は60歳であり、PDの発生率は、一般集団の0.3%の発生率から80歳1歳、2歳以上の個体では3%に上昇する。PD病理の詳細は十分に理解されていないが、この進行性障害は、中脳の実質的なニグラ領域におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失を伴う。この神経細胞喪失の仮説的メカニズムは、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、および炎症2を伴う。病気の原因と危険因子はまだ検討されているが、環境と遺伝的要因の組み合わせを含む1.例えば、研究は、生涯の農薬使用とPDとの間に肯定的な関連を発見しただけでなく、家族PD1、3に対する遺伝的感受性も見つかった。
C.エレガンスモデルシステムは、もともと神経生物学研究4の一部で開発され、生体内のドーパミン作動性ニューロン喪失を評価するために適している。Nassたちの研究グループは、ドーパミン作動性神経変性症にC.エレガンスを使用し、その後、PDおよびドーパミン作動性機能不全6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17の成功モデルとしてワームを採用しました。 、18,19,20.C.エレガンスは、生物学の他の分野でこのような人気のあるモデル生物であるのと同じ理由の多くのための良い神経変性疾患モデルです。その透明性は、細胞プロセスのin vivo研究を可能にし、ワームにおける遺伝子操作は比較的迅速かつ容易であり、彼らは約3日間の短い生成時間を有し、彼らは21を維持することが容易である。ほとんどの PD ワーム モデルは、年齢ベースのモデル、化学モデル、および遺伝的モデルの 3 つのカテゴリのいずれかに分類されます。ワームの集団を同期させる能力は、PD22のような老化に関連する神経変性疾患の年齢ベースのモデルに対する加齢関連神経変性の研究を可能にする。PD様神経細胞の欠陥を誘発する化学的暴露は、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)、ロテノーン、および1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)22を含む様々な化学物質を用いて確立されている。ワームはPDの遺伝的モデルとしてもうまく使用されています。選択された神経遺伝子ノックアウトを有する株は、様々な神経変性疾患1、4をモデル化することができる。遺伝的要因と環境要因の組み合わせ、または「遺伝子環境相互作用」の組み合わせは、PD2、17、23、24、25、26、27、28において大きな役割を果たす可能性が高く、C.エレガンスを用いたいくつかのグループによって検討されている。最後に、加齢に伴うドーパミン作動性神経変性も29,30に観察されている。蛍光イメージングに適切な神経トランスジェニック株を使用する場合、これらのPDワームモデルのいずれかがドーパミン作動性神経変性を研究するために使用され得る。
神経形態の変化を定量化することは、神経変性研究の重要な要素です。C.エレガンスでは、多くの蛍光レポーター株が形態学的変化およびニューロンの喪失を視覚化するために使用されてきた。神経細胞イメージングに適した株は、細胞特異的プロモーターに関連する蛍光タンパク質を特徴とする。ドーパミン作動性神経変性アッセイの場合、我々の研究室では、ドーパミン作動性神経細胞で発現されるdat-1遺伝子に緑色蛍光タンパク質(GFP)タグを有するBY200[vtIs1(dat -1p::GFP、rol-6)株を使用しています。 BY200のローラー表現型は、浸透が非常に低く、ほとんど観察されない点に注意してください。このタイプのイメージングに使用される他の一般的な株には、BY250[dat- 1p::GFP]が含まれます。 BY273 [baEx18::GFP+dat-1p::WT α-syn], BZ555[dat-1p::GFP]、およびカエノールハブディティス遺伝学センター(CGC)から入手可能な他のいくつかの人1、21、22、29.これらの株は、通常、ドーパミン作動性ニューロンの3つのクラスすべて(CEP)、前陰性(ADE)、およびポストデイリッド(PDE)ニューロンの視覚化を可能にする。C.エレガンスは、天然にαシヌクレインタンパク質を発現していないが、BY273などの株はそれを発現するように設計されている。しかし、我々は、我々が提示するスコアリングシステムは、アルファシヌクレインを発現しないBY200を使用して開発され、使用前にその株(または他の新しい株)で検証する必要があることに注意してください。追加のドーパミン作動性ニューロンは、男性に存在するが、男性は通常、C.エレガンスの人口の<1%を含むので、めったに考慮されません。ここでは、C.エレガンスの頭領域に見られる4つのCEPドーパミン作動性ニューロンに焦点を当てます。この一組のニューロンは、蛍光顕微鏡下で容易に位置し、雌雄同体と男性の両方のワームに存在し、通常、自己蛍光の他の領域と重複せず、一般的にワーム研究で報告されています。特に、これらのニューロンは髄膜化されていないが、CEP側の側線(CEPD)ニューロンは、CEP腹側ニューロンがそうではない偽性血体液に直接さらされる。正常なCEPデンドライトのセットは、通常、比較的直線的で途切れない線として表示されます。退化樹状突起は、樹状突起の線に沿ってブレブと呼ばれる顕著なドットや樹状突起のラインの破断を含む、不規則性と損傷の兆候の任意の組み合わせを示し得る。変性の様々なレベルでのCEPニューロンの例は図1に見ることができる。
ドーパミン作動性神経変性は、増加するC.エレガンス研究所によって研究されているが、ドーパミン作動性ニューロン損傷29、31、32、33、34を定量する分析方法に大きなばらつきがあった。多くの公表された研究は、変性対典型的または野生型ニューロン31、32のバイナリスコアリングシステムを有するCEPソーマの存在または存在について報告している。これらのスコアリング方法は、神経変性を誘発するが、より微妙な神経損傷の進行の詳細を定量化することができない特定のストレッサーを識別したり、ユニークな化学物質または他の変数によって誘発される神経変性の違いを容易に検出することができる。さらに、細胞体に焦点を当てたスコアリングシステムは、より深刻なレベルの損傷や樹状突起などの細胞の一部にのみ影響を与える神経損傷に敏感ではない可能性があります。デンドライトは化学ストレータに反応して一貫して検出可能な形態変化の範囲が最も大きいように見えるので、我々は分析の基礎としてそれらを選択しました。ここで提示するスコアリングシステムは、我々の研究室29、33で以前に使用されていた樹状突起形態ベースのマルチポイントスケールから変更されます。このシステムは、高齢者樹状突起の増加するキンク数などの加齢に伴う形態学的変化を考慮し、重度の損傷と完全な樹状突起損失を区別するために、これらの5ポイントと6ポイントスケールを7ポイントスケールに拡大します。このスコアリングシステムを導入する目的は、神経損傷のすべてのレベルで神経変性の包括的な画像をキャプチャし、C.エレガンドーパミン作動性神経変性研究全体の一貫性をサポートするための普遍的なシステムを提供する能力を提供することです。スコアリングは本質的に主観的であるため、個人スコアリング間の一貫性を最大化し、手動ブラインドまたは自動ブラインドプログラム35を使用して画像のアイデンティティにスコアラーを盲目にすることが重要である。一貫性を向上させるために、一連のトレーニング画像を提示し、JoVEのビデオ機能を利用してスコアリングシステムを詳細に実証します。両方の自動ブラインドスコアリングを許可し、スコアラーが画像のサブセットを再スコアリングすることによって彼女または彼の得点の一貫性を定量化できるようにするシステムを使用することをお勧めします。これは、複数の科学者のデータを組み合わせたり比較したり、採点に新しい科学者を訓練したりする場合に特に重要です。
Protocol
1. イメージング用のワームの準備
注:関連するJoVEビデオ記事31を参照してください: https://www.jove.com/v/835/
- 実験グループごとに、ピペットまたは20〜30個のワームをイメージング顕微鏡と互換性のあるイメージングプラットフォームにピックします。最も一般的なプラットフォームは、カバースリップ31 と96ウェルプレートで、液体媒体の100μL未満でウェルボリュームを含むガラススライドに取り付けられた2%アガロースゲルパッドが含まれます。
- 30-90 mMナトリウムアジド(NaN 3)、2.5-8.5 mMレバミソールHCl、または他の麻痺剤をワームに加えて、ワームを麻痺させる。液体中で麻痺する場合は、アガロースパッド上で麻痺する場合よりも高濃度の麻痺剤を使用してください。イメージングプラットフォームを軽くタップして混合します。
- ワームが完全に麻痺することを許可します。
注: これには数分かかる場合があります。
2. 画像ドーパミン作動性ニューロン
- Zスタックを取ることができるイメージング顕微鏡を使用して、単色GFP蛍光の下でワームの頭領域を見つけます。
- 露出と絞りの設定に注意してください。樹状突起の過度の露出を避け、試行間で設定を一貫して保ちます。樹状突起を明確な視覚化のために必要に応じて明るくします。これは通常、ソーマの過度の露出をもたらす。
注: このプロトコルに含まれる画像は、400 倍の倍率でキャプチャされました。
- 露出と絞りの設定に注意してください。樹状突起の過度の露出を避け、試行間で設定を一貫して保ちます。樹状突起を明確な視覚化のために必要に応じて明るくします。これは通常、ソーマの過度の露出をもたらす。
- フォーカスをスクロールして、樹状突起がはっきりしている上限と下限を見つけます。Z スタック イメージ キャプチャの上限と下限として設定します。
- 各ワームの Z スタック イメージをキャプチャするには、クリックします。
注: 以下の手順はすべて、いつでも実行できます。
3. スコアリングのためのドーパミン作動性ニューロン画像を準備する
- 各 z スタックについて、顕微鏡ソフトウェアまたは外部イメージ解析ソフトウェアを使用してイメージファイルを開き、スタックをソフトウェアにロードし、スタックを単一のフラット化されたイメージに圧縮します。
- 手動で、または自動ブラインドソフトウェアを使用して、治療グループ間および治療グループ内のブラインド画像。
4. スコアドーパミン作動性ニューロンデンドライト
- 一度に 1 つのニューロンイメージを操作します。4 つの CEP デンドライトのいずれかを選択して、ブブ、ブレーク、および曲げ、キンク、曲線などの不規則性を評価します。マウスが画像の上部にある場合は左から右にスコアリングを行い、スコアリングの再現性を確保することをお勧めします。
- 次のガイドラインを使用して、1 つのスコア値をデンドライトに割り当てます。代表的なスコアリング イメージの例については 、図 1 を参照してください。
0-ダメージなし、「完璧な」ニューロン
1- 不規則 (キンク、カーブなど)
2- <5ブレブ
3- 5-10 ブレブ
4- >10ブレブおよび/または破損除去<全樹状突起の25%を除去
5-破損、樹状突起の25〜75%を除去
6- 破損、>75%デンドライト除去- 単一のデンドライト内で複数の基準が満たされている場合(すなわち、キンクとブレブ)、最高の適用可能なスコアを割り当てます。
- 画像のキャプチャや他の樹状突起との重なりなどの問題により、はっきりと見えない樹状突起をスコア付けしないでください。平坦化された z スタックイメージを拡大する場合は、偽のブレブに似た拡大されたピクセルに注意してください。
- 各樹状突起に対して繰り返します。すべての画像に対して繰り返します。
- すべてのスコアを記録します。スコアは、現時点では盲目ではないかもしれません。
5. データの準備と提示
- 各神経変性スコアに割り当てられた各治療群の樹状突起の総数を計算する。各治療群のスコア付け樹状突起の総数を計算します。
- 神経変性スコアを、治療群で採点された樹状突起の総数で割る。各神経変性スコアにおいて治療群内の樹状突起の割合としてデータを提示する。
6. 統計分析の実行
- プログラミング ソフトウェアを使用するか、または手動で、比較対象のすべての治療グループペア間の独立性を確認するカイ二乗検定を実行します。適宜、複数比較を考慮して、比較実験群の数に応じてp値のボンフェローニ補正を適用する。
注: このテストでは、2 つのグループ間の有意な違いが決定されますが、相違点の種類の詳細は目で修飾する必要があります。- 実験グループ間の比較を選択します。これは実験計画によって異なります。
注:私たちの実験では、通常、コントロールはそれぞれの治療群と比較され、すべてのコントロールが比較され、すべての治療法が比較されます。
- 実験グループ間の比較を選択します。これは実験計画によって異なります。
7. ドーパミン作動性ニューロン画像の練習セットによる練習スコアリング
- 解説とスコアキーを使用して、スコアリングシステムの全範囲にわたって表示するニューロン画像のセットについては 、補足ファイル1 を参照してください。この一連の実践は、研究者を新しく訓練し、評価者間の信頼性を確保することを目的としています。
8. 代替プロトコルオプションを検討する
- Zスタックをキャプチャする代わりに、画像を保存または積み重ねることなく、顕微鏡でのスコアリングを完了します。
注: このオプションは、テクノロジ機能の要件を軽減しますが、後で戻るニューロン イメージのアーカイブを作成するオプションを削除し、手動によるブラインドを必要とし、治療グループ内と治療グループ内でのみブラインドを許可します。 - スタックごとに 1 つの圧縮イメージを作成する代わりに、各 z スタックのイメージをスクロールしてスコア付けを完了します。
注:このオプションは、一部のスコアラーにとって簡単であり、イメージング中に移動したワームに偽のブレブを見るリスクを軽減し、重複する樹状突起をスコアリングすることができますが、手動ブラインドを必要とし、治療グループ内でのみブラインドを許可します。
Representative Results
ここで説明するスコアリングシステムは、ロテノン暴露後のL4幼虫ステージBY200[vtIs1(dat-1p::GFP、rol -6)C.エレガンスにおける神経変性を評価するために使用された。 この実験の結果は図2に示されており、ドーパミン作動性ニューロン損傷の可変レベルを検出し定量化するスコアリングシステムの能力を表しています。ロテノーンは、いくつかの農薬、ピシサイド、および殺虫剤36、37に使用される天然の電子輸送鎖複合体I阻害剤である。ロテノーネなどの有毒化学物質の使用は本質的に危険であり、すべてのラボは、その機関によって設定されたすべての使用および処分規制に準拠する必要があることに注意してください。この実験では、2回の用量で、0.03 μMおよび0.5μMの液体ロテノーン曝露を、対照群とともに、0.5M水酸化ナトリウム/1%次亜塩素酸ナトリウム溶糖分解の直後に始め、卵38を収穫した。卵は完全なK培地33、0.25%のジメチルスルホキシド(DMSO)で39で孵化し、ワームはL4幼虫期中まで約48時間液体に残り、その時点で化学物質暴露から取り除かれ、図1を基準として調製し、画像化し、上記のプロトコルステップに従って採点した。0.5 μMロテノーンの高用量では、卵を24時間前に採取して、ロテノーン誘発性の発達遅延を考慮し、イメージング時にすべてのワームがステージ同期化されたことを確認した。
図2は、この採点システムを用いて収集したデータを、我々の研究室がどのように可視化するかをさらに示しています。この図では、用量依存性神経変性応答が理解でき、スコア分布の具体的な内訳が明確に示されている。これらの特定の結果は、ニューロンの損傷が異なる方法で提示する方法を示しています。例えば、0.03 μMロテノーン暴露群は、対照群と比較して0のスコアを有する健康なニューロンの割合が減少するが、さらに5つのスコアの減少割合も有する。実験グループ間のスコア分布に関するこの詳細を検出すると、7点スコアリングシステムの感度が強調されます。このデータは、ボンフェローニ補正による独立性のカイ二乗検定を用いて、プロトコルに従って統計的有意性について分析した。
図 1.ドーパミンニューロン形態変化および変性スコアリングシステム代表画像. この統合されたチャートには、各スコアでのニューロンの例が含まれ、スコアリングの基準として使用されることを意図しています。ここでは、各パネルの矢印で示されているように、各ワームの中で最も損傷した樹状突起に対応する各ラベルスコア。これらの画像は、BY200 C. elegansと共にこの論文で説明されているプロトコルを使用して撮影したものです。このスコアリング方法の新しいトレーニングに使用する一連のスコア付きの画像については、 補足ファイル 1 を参照してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.BY200 L4ドーパミンニューロン形態とロテノーネ暴露後の変性スコア. この図は、ここで説明したスコアリング方法を用いて分析した代表的な結果を示しています。ロテノン露光濃度が高い損傷したドーパミン作動性ニューロンのより大きな割合を視覚化し、独立性のためのカイ二乗検定を使用して統計的に分析した。ロテノン処理群はいずれも対照群と比較した場合に統計的に有意なp値を得た。異なる文字は、統計的な違いを示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、我々の研究室で開発された7点スケールを使用して、C.エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロン形態変化および変性のレベルを定量化する方法を示している。私たちは、ワームにおけるドーパミン作動性神経変性の分析を標準化するためのツールとして、この規模を作成し、共有しました。非常に流行している神経変性疾患に関与する経路を研究することの重要性を認識し、多くの研究者は、神経変性29、31、32、33を研究するために、神経生物学の可視化に対するC.エレガンスモデルの適合性を利用する。しかし、ワームの神経変性研究全体でニューロンの損傷を定量化する方法に大きなばらつきを減らす努力はまだありません。ここで提示されるスコアリングシステムは、分析の一貫性を促進し、研究間の比較を可能にすることを目的としています。
我々のスコアリングシステムは、ドーパミン作動性ニューロン、特にCEP樹状突起の視覚化を可能にする細胞特異的蛍光レポーターを使用する C.エレガンス 実験から得られたデータを分析するために使用することができる。具体的には、ドーパミン作動性ニューロンのGFP可視化用 dat-1 遺伝子でタグ付けされた株は、このスコアリングプロトコルと互換性があるが、PDの他の多くの関連トランスジェニックモデルが存在する。このスコアリングシステムは、これらのモデルでも役に立つ可能性があります。ただし、これを使用する前に検証する必要があります。特に、mCherry凝集はブレブと区別がつかないか、細胞ストレスを引き起こすことができるので、mCherryを用いた株は、このプロトコルには適していない可能性がある(しかし我々の知る限りでは試験されない)。PDおよび関連する神経変性疾患のすべての特定のモデルに関する解説を提供するのではなく、神経変性データ自体のスコアリングに焦点を当てています。さらに、このプロトコルは神経形態のみに焦点を当て、相馬の蛍光レベルを考慮しません。神経変性アッセイは、移動、寿命、および健康スパン実験などの神経変性疾患に関連する行動アッセイと共に行うことができる。PDの確立された化学、年齢ベース、および遺伝的モデルにおける変性のレベルも、このスコアリングシステムを使用して確認および詳述することができる。PDおよび他の神経変性疾患に関連するモデル、寄与者、経路を測定することは、これらの障害に関する科学的知識を追加し、影響を受ける個人の増加する人口を管理する方法を指し示すことができます。文学全体で同等の神経変性の結果を持つことは、この目標をサポートする上で重要です。
このスコアリングシステムから得られた結果を解釈するために、同じワーム内の異なるニューロンが治療に対して異なる反応を示すことが多いため、n=1としてスコア付けされた各樹状突起を考慮することを提案する。これは、CEPDニューロンのみが偽血体体液に直接さらされるという事実によって駆動され得る。したがって、実験群のスコアスプレッドを、各グループで採点された樹状突起の総数の割合として表示することができる。この方法は、ここに示す代表的な結果に使用され、治療群間での比較を容易にし、同じワーム内の差動応答を占め、複数比較のためのボンフェローニ補正によって補完されたカイ二乗検定で容易に分析される。ニューロンのスコアを記録し、パーセンテージを計算するためのテンプレートの例は、 補足ファイル 2にあります。我々は、データ分析のための2つの代替方法を検討し、それぞれの欠陥を特定しました。最初のオプションは、各ワームの 4 つの CEP ニューロンのスコアを平均します。これにより、データがパラメータ化されます。ただし、スコアの増加と線形関係を想定し、同じワーム内の治療に応答するバリエーションに関する情報を失います。2番目の選択肢は、各ワームの4つのCEPニューロンすべてのスコアを合計することです。これはスコア間の線形関係を前提としますが、可能なスコアのパラメータを拡張することで、各ワーム内の違いを平均スコアよりも重く説明できます。しかし、個々の研究者はデータを表示することを決定し、結果は株やワームの年齢などの実験変数と一緒に考慮されるべきです。たとえば、古いワームの予想されるベースライン レベルが高い場合、その結果、デジェネレーションが発生します。
これらの神経変性スコアの結果が解釈されるように, 研究者はまた、いくつかの注意点とスコアリング方法の制限を認識する必要があります。.まず、スコアリングに適した画像をキャプチャするために、特定の技術的要件が必要です。イメージング顕微鏡は、蛍光チャネルと、CEPデンドライトの明確な可視化を可能にする拡大および露出設定をサポートする必要があります。プロトコルで述べたように、技術的要件は、後でアーカイブおよびスコアリングする画像をキャプチャするのではなく、顕微鏡的な分野を通じてライブ画像をスコアリングするようなプロトコル調整によって減少する可能性があります。第二に、このデータの可能な統計分析方法は、データが非パラメトリックであるため、制限されています。スコアリングスケールはプログレッシブであると推測されますが、離散スコアオプションがあり、スコアの増加は生物学的機能に関して必ずしも互いに比例するとは限らないため、数値とは見なされません。これらの理由から、独立性のカイ二乗検定はこのタイプのデータに最も適しており、統計的分析は観測者に依存して統計的有意性の方向を決定します。特に、カイ二乗検定はスコア分布の差異を分析するだけであり、特定のスコアカテゴリの違いの証拠を提供することはできません。最後に、このスコアリングシステムによって定量化された形態学的変化の機能的意義はまだ研究されていない。
この採点システムの開発によって促される将来の方向性は、生物学的塩基および個々のニューロンスコアとの相関を決定することを含む。スコアリングスケール上のすべてのポイントの機能的意義(例えば、神経シグナル伝達、ワーム行動)を研究することは、神経変性疾患の原因と結果を理解し、予防および治療オプションを開発するのに適用される結論に結果をより良く翻訳する方法を知らせるでしょう。ワームの神経変性に関する今後の研究は、ワームの形状や大きさなどの他の形態との関連を発見することを目指すべきである。さらに、神経変性研究は、バイオエネルギー、活性酸素種の生産、ミトコンドリア形態などのエンドポイントを測定するために他のレポーター C.エレガンス 株を研究することによってサポートすることができます。
Disclosures
著者は開示を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、イアン・T・ライド、得点スケールの発展への貢献と、この原稿の作成中の彼の支援を認めたいと思います。この研究は、国立衛生研究所(T32ES021432サポートKSM、およびP42ES010356からJNM)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3x1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
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