Summary
In dit artikel laten we zien hoe we een zevenpuntenscoresysteem kunnen gebruiken om veranderingen in dopaminerge neuron dendrietmorfologie in C. elegansconsequent te kwantificeren . Dit systeem is bedoeld voor analyses van dopaminerge neurodegeneratie-assays met behulp van genetische, chemische en op leeftijd gebaseerde modellen van neurodegeneratieve aandoeningen.
Abstract
Dopamine neuron verlies is betrokken bij de pathologie van de ziekte van Parkinson (PD), een veel voorkomende neurodegeneratieve aandoening die meer dan 10 miljoen mensen wereldwijd treft. Omdat veel details over PD-etiologie onbekend blijven, zijn studies nodig die genetische en omgevingsbijdragen aan PD onderzoeken om methoden voor preventie, management en behandeling te ontdekken. Een goede karakterisering van dopaminerge neuronale verliezen kan niet alleen relevant zijn voor PD-onderzoek, maar ook voor andere steeds vaker voorkomende neurodegeneratieve aandoeningen.
Er zijn gevestigde genetische en chemische modellen van dopaminerge neurodegeneratie in het Caenorhabditis elegans-modelsysteem, met eenvoudige visualisatie van neurobiologie ondersteund door de transparantie van de nematoden en invariante neuronale architectuur. In het bijzonder kunnen de dopaminerge neuronmorfologische veranderingen van hermafrodiete C. elegans worden gevisualiseerd met behulp van stammen met fluorescerende verslaggevers aangedreven door celspecifieke promotors zoals het dat-1 dopaminetransporter-gen, dat uitsluitend tot expressie komt in hun acht dopaminerge neuronen.
Met de mogelijkheden van dit modelsysteem en de juiste technologie hebben veel laboratoria dopaminerge neurodegeneratie bestudeerd. Er is echter weinig consistentie in de manier waarop de gegevens worden geanalyseerd en veel van de huidige literatuur maakt gebruik van binaire scoringsanalyses die de aanwezigheid van degeneratie vastleggen, maar niet de volledige details van de progressie van neuronverlies. Hier introduceren we een universeel scoresysteem om morfologische veranderingen en degeneratie in C. elegans' cefalische neuron dendrieten te beoordelen. Deze zevenpuntsschaal maakt analyse mogelijk over een volledig scala van dendrietmorfologie, variërend van gezonde neuronen tot volledig dendrietverlies, en rekening houdend met morfologische details zoals knikken, vertakkingen, blebs en breuken. Met dit scoresysteem kunnen onderzoekers subtiele leeftijdsgerelateerde veranderingen kwantificeren, evenals meer dramatische chemisch geïnduceerde veranderingen. Ten slotte bieden we een oefenset van afbeeldingen met commentaar die kunnen worden gebruikt om de scoringsconsistentie van onderzoekers die nieuw zijn in deze methode te trainen, te kalibreren en te beoordelen. Dit zou de consistentie binnen en tussen laboratoria moeten verbeteren, waardoor de striktheid en reproduceerbaarheid toenemen.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een steeds vaker voorkomende neurodegeneratieve ziekte die wereldwijd tot 10 miljoen personentreft 1. Mannen en oudere personen lopen een hoger risico op het ontwikkelen van PD; de gemiddelde aanvangsleeftijd voor de ziekte is 60 jaar en de PD-incidentie stijgt van een incidentie van 0,3% in de algemene bevolking tot 3% bij personen ouder dan 80 jaar1,2. Hoewel de details van PD-pathologie niet volledig worden begrepen, omvat deze progressieve aandoening het verlies van dopaminerge neuronen in het substantia nigra-gebied van de middenhersenen. Veronderstelde mechanismen van dit neuronale verlies omvatten mitochondriale disfunctie, oxidatieve stress en ontsteking2. De oorzaken en risicofactoren voor de ziekte worden nog onderzocht, maar omvatten een combinatie van omgevings- en genetische factoren1. Studies hebben bijvoorbeeld positieve associaties gevonden tussen levenslang gebruik van pesticiden en PD, evenals genetische gevoeligheid voor familiale PD1,3.
Het C. elegans-modelsysteem, oorspronkelijk gedeeltelijk ontwikkeld voor neurobiologisch onderzoek4, is zeer geschikt voor het evalueren van dopaminerge neuronverlies in vivo. Nass en collega's pionierden met het gebruik van C. elegans voor dopaminerge neurodegeneratie5,en veel groepen hebben sindsdien de worm aangenomen als een succesvol model voor PD en dopaminerge disfunctie6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans zijn goede neurodegeneratieve ziektemodellen om veel van dezelfde redenen dat ze zo'n populair modelorganisme zijn voor andere gebieden van de biologie; hun transparantie maakt in vivo studie van cellulaire processen mogelijk, genetische manipulatie in wormen is relatief snel en gemakkelijk, ze hebben een korte generatietijd van ongeveer drie dagen en ze zijn gemakkelijk te onderhouden21. De meeste PD-wormmodellen vallen in een van de drie categorieën: op leeftijd gebaseerde modellen, chemische modellen en genetische modellen. Het vermogen om een populatie van wormen te synchroniseren maakt de studie van leeftijdsgebonden neurodegeneratie mogelijk voor een op leeftijd gebaseerd model van neurodegeneratieve ziekten geassocieerd met veroudering, zoals PD22. Chemische blootstellingen die PD-achtige neuronale defecten induceren, zijn vastgesteld met behulp van een verscheidenheid aan chemicaliën, waaronder 6-hydroxydopamine (6-OHDA), rotenon en 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)22. Wormen worden ook met succes gebruikt als genetische modellen van PD; stammen met geselecteerde neurale gen knock-outs kunnen verschillende neurodegeneratieve ziekten modelleren1,4. Combinaties van genetische en omgevingsfactoren, of "gen-omgevingsinteracties", die waarschijnlijk een belangrijke rol spelen bij PD2,17,23,24,25,26,27,28, zijn onderzocht door verschillende groepen met behulp van C. elegans. Ten slotte is leeftijdsgebonden dopaminerge neurodegeneratie ook waargenomen29,30. Bij gebruik van een geschikte neurale transgene stam in fluorescerende beeldvorming, kan elk van deze PD-wormmodellen worden gebruikt om dopaminerge neurodegeneratie te bestuderen.
Het kwantificeren van veranderingen in neuronale morfologie is een cruciaal onderdeel van neurodegeneratief onderzoek. In C. eleganszijn veel fluorescerende reporterstammen gebruikt om morfologische veranderingen en verlies van neuronen te visualiseren. Stammen die geschikt zijn voor neuronale beeldvorming hebben een fluorescerend eiwit geassocieerd met celspecifieke promotors. Voor dopaminerge neurodegeneratie-assays heeft ons laboratorium de BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] stam gebruikt, die een groen fluorescerend eiwit (GFP) -label heeft in het dat-1-gen, uitgedrukt in de dopaminerge neuronen. Merk op dat het rollerfenotype van de BY200 een zeer lage penetrantie heeft en zelden wordt waargenomen. Andere veel voorkomende stammen die voor dit type beeldvorming worden gebruikt, zijn BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], en verschillende andere verkrijgbaar bij het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) of op verzoek van specifieke laboratoria1,21,22,29 . Deze stammen maken meestal visualisatie mogelijk van alle drie de klassen van dopaminerge neuronen: cefalische (CEP), anterieure deirid (ADE) en postdeirid (PDE) neuronen. C. elegans drukt het alfa-synucleïne-eiwit niet van nature uit, maar stammen zoals BY273 zijn ontworpen om het tot expressie te laten komen. We merken echter op dat het scoresysteem dat we presenteren is ontwikkeld met BY200, dat geen alfa-synucleïne tot expressie brengt, en vóór gebruik met die stam (of een andere nieuwe stam) moet worden gevalideerd. Extra dopaminerge neuronen zijn aanwezig bij mannen, maar worden zelden overwogen omdat mannen normaal gesproken <1% van een C. elegans-populatie uitmaken. Hier richten we ons op de vier CEP dopaminerge neuronen gevonden in het hoofdgebied van C. elegans. Deze set neuronen is gemakkelijk te vinden onder fluorescerende microscopie, is aanwezig in zowel hermafrodiet als mannelijke wormen, overlapt meestal niet met andere gebieden van autofluorescentie en wordt vaak gerapporteerd in wormstudies. Met name, hoewel deze neuronen niet gemyeliniseerd zijn, worden de CEP dorsale (CEPD) neuronen direct blootgesteld aan de pseudocoelomic lichaamsvloeistof waar de CEP ventrale neuronen dat niet zijn. Een gezonde set CEP-dendrieten wordt meestal weergegeven als relatief rechte, ononderbroken lijnen. Gedegenereerde dendrieten kunnen elke combinatie van onregelmatigheden en tekenen van schade vertonen, inclusief uitgesproken stippen die blebs worden genoemd langs de lijn van de dendriet en breuken in de lijn van de dendriet. Voorbeelden van CEP-neuronen bij verschillende niveaus van degeneratie zijn te zien in figuur 1.
Hoewel dopaminerge neurodegeneratie wordt bestudeerd door een groeiend aantal C. elegans-laboratoria, is er een grote variatie in analytische methoden voor het kwantificeren van dopaminerge neuronschade29,31,32,33,34. Veel gepubliceerde studies hebben gerapporteerd over de aan- of afwezigheid van CEP-soma met een binair scoresysteem van degeneratieve versus typische of wilde type neuronen31,32. Deze scoringsmethoden kunnen bepaalde stressoren identificeren die neurodegeneratie induceren, maar kunnen de details van de progressie van subtielere neuronale schade niet kwantificeren, of gemakkelijk verschillen detecteren tussen neurodegeneratie zoals geïnduceerd door unieke chemicaliën of andere variabelen. Bovendien zijn scoresystemen gericht op de cellichamen mogelijk niet gevoelig voor minder ernstige niveaus van schade of voor neuronale schade die slechts een deel van de cel treft, zoals de dendriet. Omdat de dendriet het grootste bereik van consistent detecteerbare morfologische veranderingen lijkt te hebben in reactie op chemische stressoren, hebben we ze geselecteerd als basis voor onze analyse. Het scoresysteem dat we hier presenteren, is aangepast van op dendrietmorfologie gebaseerde meerpuntsschalen die eerder zijn gebruikt in ons laboratorium29,33. Dit systeem breidt deze vijf- en zespuntsschalen uit tot een zevenpuntsschaal om rekening te houden met leeftijdsgebonden morfologische veranderingen, zoals hogere verwachte aantallen knikken in oudere volwassen dendrieten, en om onderscheid te maken tussen ernstige schade en volledig dendrietverlies. Het doel van de introductie van dit scoresysteem is om de mogelijkheid te bieden om een uitgebreid beeld te krijgen van neurodegeneratie op alle niveaus van neuronale schade en een universeel systeem te bieden om consistentie in C. elegan dopaminerge neurodegeneratie-onderzoek te ondersteunen. Omdat scoren inherent subjectief is, is het van cruciaal belang om de consistentie tussen individuen die scoren te maximaliseren en om de scorer blind te maken voor de identiteit van de afbeeldingen met behulp van handmatige verblinding of een automatisch verblindingsprogramma35. Om de consistentie te verbeteren, presenteren we een reeks trainingsbeelden en gebruiken we de videomogelijkheden van JoVE om ons scoresysteem in detail te demonstreren. We raden aan een systeem te gebruiken dat zowel geautomatiseerd geblindeerd scoren mogelijk maakt als de scorer in staat stelt om haar of zijn scoringsconsistentie te kwantificeren door een subset van afbeeldingen opnieuw te scoren. Dit is vooral belangrijk bij het combineren of vergelijken van gegevens van meerdere wetenschappers, of het trainen van wetenschappers die nieuw zijn in scoren.
Protocol
1. Bereid wormen voor op beeldvorming
OPMERKING: Zie gerelateerd JoVE video artikel31: https://www.jove.com/v/835/
- Pipetteer of pluk voor elke experimentele groep 20 tot 30 wormen naar een beeldvormingsplatform dat compatibel is met de beeldvormingsmicroscoop. De meest voorkomende platforms zijn 2% agarose gel pads gemonteerd op glazen dia's met een coverslip31 en 96-well platen met putvolumes op of minder dan 100 μL vloeibaar medium.
- Verlam de wormen door 30-90 mM natriumazide (NaN3), 2,5-8,5 mM levamisol HCl of een ander verlammend middel aan de wormen toe te voegen. Als het verlammend is in vloeistof, gebruik dan een hogere concentratie verlammend middel dan wanneer het verlamt op agarose pads. Tik zachtjes op het beeldplatform om te mixen.
- Laat wormen volledig verlammen.
OPMERKING: Dit kan enkele minuten duren.
2. Afbeelding Dopaminerge neuronen
- Lokaliseer de kopgebieden van wormen onder eenkleurige GFP-fluorescentie met behulp van een beeldmicroscoop die z-stacks kan nemen.
- Houd rekening met belichtings- en diafragma-instellingen; vermijd overmatige blootstelling van dendrieten en houd de instellingen consistent in alle onderzoeken. Maak de dendrieten zo helder als nodig is voor een duidelijke visualisatie; dit resulteert meestal in overbelichting van de soma.
OPMERKING: Afbeeldingen in dit protocol zijn vastgelegd met een vergroting van 400x.
- Houd rekening met belichtings- en diafragma-instellingen; vermijd overmatige blootstelling van dendrieten en houd de instellingen consistent in alle onderzoeken. Maak de dendrieten zo helder als nodig is voor een duidelijke visualisatie; dit resulteert meestal in overbelichting van de soma.
- Blader door de focus om de boven- en ondergrenzen te vinden waar de dendrieten duidelijk zijn. Stel deze in als boven- en ondergrenzen voor het vastleggen van een z-stack-afbeelding.
- Klik om z-stack afbeeldingen voor elke worm vast te leggen.
OPMERKING: Alle volgende stappen kunnen op elk moment worden uitgevoerd.
3. Bereid Dopaminerge neuronafbeeldingen voor om te scoren
- Open voor elke z-stack het afbeeldingsbestand met behulp van de microscoopsoftware of een externe beeldanalysesoftware, laad de stapel in de software en comprimeer de stapel tot één afgeplatte afbeelding.
- Blind beelden tussen en binnen behandelgroepen handmatig of met behulp van automatische blinderingssoftware.
4. Score Dopaminerge Neuron Dendrieten
- Werk met één neuronbeeld tegelijk. Kies een van de vier CEP-dendrieten om te beoordelen op blebs, breuken en onregelmatigheden, waaronder bochten, knikken en curven. Scoren van links naar rechts wanneer de neus zich bovenaan het beeld bevindt, wordt aanbevolen om herhaalbaarheid bij het scoren te garanderen.
- Wijs aan de hand van de volgende richtlijnen één scorewaarde toe aan de dendriet. Zie figuur 1 voor voorbeelden van representatieve scoringsafbeeldingen.
0- geen schade, "perfecte" neuronen
1- onregelmatig (knikken, rondingen, enz.)
2- <5 blebs
3- 5-10 blebs
4- >10 blebs en/of breuk verwijderen <25% van de totale dendriet
5- breuk, 25-75% dendriet verwijderd
6- breuk, >75% dendriet verwijderd- Als aan meerdere criteria binnen één dendriet wordt voldaan (d.w.z. knikken en blebs), wijst u de hoogst toepasselijke score toe.
- Scoor geen dendrieten die niet duidelijk zichtbaar zijn, vanwege problemen met het vastleggen van afbeeldingen, overlapping met andere dendrieten, enz. Als u inzoomt op een afgevlakte z-stackafbeelding, moet u rekening houden met vergrote pixels die lijken op valse blebs.
- Herhaal dit voor elke dendriet. Herhaal dit voor alle afbeeldingen.
- Noteer alle scores. Scores kunnen op dit moment niet verblind zijn.
5. Gegevens voorbereiden en presenteren
- Bereken het totale aantal dendrieten in elke behandelingsgroep dat is toegewezen aan elke neurodegeneratiescore. Bereken het totale aantal gescoorde dendrieten in elke behandelingsgroep.
- Deel de neurodegeneratiescores door het totale aantal gescoorde dendrieten in de behandelingsgroep. Presenteer gegevens als een percentage dendrieten binnen een behandelingsgroep bij elke neurodegeneratiescore.
6. Voer statistische analyse uit
- Voer met behulp van een programmeersoftware of handmatig een chi-kwadraattest uit voor onafhankelijkheid tussen alle behandelgroepparen die moeten worden vergeleken. Pas indien nodig een Bonferroni-correctie van de p-waarde toe op basis van het aantal vergeleken experimentele groepen om rekening te houden met meerdere vergelijkingen.
OPMERKING: Deze test zal significante verschillen tussen twee groepen bepalen, maar details van het type verschil moeten met het oog worden gekwalificeerd.- Selecteer vergelijkingen tussen experimentele groepen. Dit zal variëren op basis van experimenteel ontwerp.
OPMERKING: In onze experimenten worden controles meestal vergeleken met hun respectieve behandelingsgroepen, alle controles worden vergeleken en alle behandelingen worden vergeleken.
- Selecteer vergelijkingen tussen experimentele groepen. Dit zal variëren op basis van experimenteel ontwerp.
7. Oefen scoren met oefenset dopaminerge neuronafbeeldingen
- Zie aanvullend bestand 1 voor een reeks neuronbeelden die zich presenteren over het volledige bereik van ons scoresysteem met commentaar en scoresleutel. Deze praktijkset is bedoeld om onderzoekers op te leiden die nieuw zijn in deze methode en om de betrouwbaarheid van de inter-rater te waarborgen.
8. Overweeg alternatieve protocolopties
- In plaats van z-stacks vast te leggen, voltooit u het scoren onder de microscoop, zonder afbeeldingen op te slaan of te stapelen.
OPMERKING: Deze optie vermindert de vereisten voor technologische mogelijkheden, maar verwijdert de optie voor het maken van een archief van neuronbeelden om op een later tijdstip naar terug te keren, vereist handmatige verblinding en staat blindering alleen toe tussen en niet binnen behandelingsgroepen. - In plaats van één gecomprimeerde afbeelding per stapel te maken, kunt u de score voltooien door door de afbeeldingen van elke z-stack te scrollen.
OPMERKING: Deze optie kan voor sommige scorers gemakkelijker zijn en vermindert het risico op het zien van valse blebs op wormen die tijdens het beeldvorming bewogen en maakt het mogelijk om overlappende dendrieten te scoren, maar vereist handmatige blindering en staat blindering alleen toe tussen en niet binnen behandelingsgroepen.
Representative Results
Het hier beschreven scoresysteem werd gebruikt om neurodegeneratie te beoordelen in L4 larvale stadium BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans na blootstelling aan rotenon. De resultaten van dit experiment zijn weergegeven in figuur 2 en vertegenwoordigen het vermogen van ons scoresysteem om variabele niveaus van dopaminerge neuronschade te detecteren en te kwantificeren. Rotenon is een natuurlijk voorkomende elektronentransportketen complex I-remmer die wordt gebruikt in sommige pesticiden, pisciciden en insecticiden36,37. Merk op dat het werken met giftige chemicaliën zoals rotenon inherent gevaarlijk is en dat alle laboratoria moeten voldoen aan alle gebruiks- en verwijderingsvoorschriften die door hun instellingen zijn vastgesteld. In dit experiment werden blootstellingen aan vloeibaar rotenon bij twee doses, 0,03 μM en 0,5 μM, samen met een controlegroep, onmiddellijk na een natriumhydroxide van 0,5 M / 1% natriumhypochlorietlysis begonnen om eieren te oogsten38. Eieren kwamen uit in volledig K-medium33,39 met 0,25% dimethylsulfoxide (DMSO) en wormen bleven ~48 uur in vloeistof tot halverwege het L4 larvale stadium, waarna ze werden verwijderd van chemische blootstelling en werden voorbereid, afgebeeld en, met behulp van figuur 1 als referentie, gescoord volgens de bovenstaande protocolstappen. Voor de hogere dosis van 0,5 μM rotenon werden eieren 24 uur van tevoren geoogst om rekening te houden met een door rotenon geïnduceerde ontwikkelingsachterstand en ervoor te zorgen dat alle wormen op het moment van beeldvorming werden gesynchroniseerd.
Figuur 2 laat verder zien hoe ons laboratorium gegevens visualiseert die zijn verzameld met behulp van dit scoresysteem. In deze figuur kan een dosisafhankelijke neurodegeneratierespons worden gewaardeerd en wordt de specifieke uitsplitsing van de scoreverdeling duidelijk weergegeven. Deze specifieke resultaten laten zien hoe neuronale schade zich op verschillende manieren kan presenteren. De 0,03 μM rotenon-blootgestelde groep heeft bijvoorbeeld een verminderd aandeel gezonde neuronen met een score van 0, in vergelijking met de controlegroep, maar heeft ook een verminderd aandeel van 5 scores. Het detecteren van dit detail over de scoreverdelingen tussen experimentele groepen benadrukt de gevoeligheid van ons zevenpuntenscoresysteem. Deze gegevens werden geanalyseerd op statistische significantie volgens het protocol, met behulp van een chi-kwadraattest voor onafhankelijkheid met een Bonferroni-correctie.
Figuur 1. Dopamine neuron morfologische verandering en degeneratie scoresysteem representatieve beelden. Deze geconsolideerde grafiek bevat voorbeelden van neuronen bij elke score en is bedoeld als referentie voor het scoren. Hier komt elke gelabelde score overeen met de meest beschadigde dendriet in elke worm, zoals aangegeven door de pijl in elk paneel. Deze foto's zijn gemaakt met behulp van het protocol beschreven in dit artikel met BY200 C. elegans. Zie aanvullend bestand 1 voor een reeks gescoorde afbeeldingen met commentaar die moeten worden gebruikt voor het trainen van degenen die nieuw zijn in deze scoringsmethode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. BY200 L4 dopamine neuron morfologie en degeneratie scores na blootstelling aan rotenon. Deze figuur toont representatieve resultaten geanalyseerd met behulp van de hier beschreven scoringsmethoden. De gevisualiseerde grotere proporties van beschadigde dopaminerge neuronen met hogere rotenonblootstellingsconcentraties werden statistisch geanalyseerd met behulp van chi-kwadraattests voor onafhankelijkheid. Beide rotenonbehandelingsgroepen leverden statistisch significante p-waarden op in vergelijking met de controlegroep. Verschillende letters duiden op statistisch verschil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit protocol laat zien hoe de zevenpuntsschaal die in ons laboratorium is ontwikkeld, kan worden gebruikt om niveaus van dopaminerge neuronmorfologische verandering en degeneratie in C. eleganste kwantificeren. We creëerden en deelden deze schaal als een hulpmiddel om de analyse van dopaminerge neurodegeneratie in wormen te standaardiseren. Erkennend het belang van het bestuderen van pathways die betrokken zijn bij veel voorkomende neurodegeneratieve ziekten, maken veel onderzoekers gebruik van de geschiktheid van het C. elegans-model voor neurobiologische visualisatie om neurodegeneratie29,31,32,33te bestuderen. Er moet echter nog een poging worden gedaan om de grote variatie in de manier waarop neuronschade wordt gekwantificeerd in neurodegeneratieonderzoek bij wormen te verminderen. Het hier gepresenteerde scoresysteem is dus bedoeld om de consistentie in analyses te bevorderen en vergelijking tussen studies mogelijk te maken.
Ons scoresysteem kan worden gebruikt om gegevens te analyseren die zijn afgeleid van C. elegans-experimenten die celspecifieke fluorescerende verslaggevers gebruiken die visualisatie van dopaminerge neuronen mogelijk maken - met name de CEP-dendrieten. In het bijzonder zijn stammen die zijn gelabeld op het dat-1-gen voor GFP-visualisatie van de dopaminerge neuronen compatibel met dit scoringsprotocol, hoewel er veel andere gerelateerde transgene modellen van PD bestaan. Het is mogelijk dat dit scoresysteem ook nuttig zou zijn bij die modellen; dit moet echter worden gevalideerd voordat u ze gebruikt. In het bijzonder is het mogelijk (maar niet getest voor zover wij weten) stammen met mCherry zijn mogelijk niet goed geschikt voor dit protocol, omdat mCherry-aggregatie mogelijk niet te onderscheiden is van blebs of tot celstress kan leiden. In plaats van commentaar te geven op alle specifieke modellen van PD en gerelateerde neurodegeneratieve aandoeningen, richten we ons op het scoren van neurodegeneratiegegevens zelf. Bovendien richt dit protocol zich alleen op neuronale morfologie en houdt het geen rekening met fluorescentieniveaus van de soma. Neurodegeneratie-assays kunnen worden uitgevoerd naast gedragstests die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten, zoals locomotie, levensduur en gezondheidsexperimenten. Niveaus van degeneratie in gevestigde chemische, op leeftijd gebaseerde en genetische modellen van PD kunnen ook worden bevestigd en gedetailleerd met behulp van dit scoresysteem. Het meten van modellen, bijdragers en paden geassocieerd met PD en andere neurodegeneratieve ziekten kan bijdragen aan de wetenschappelijke kennis over deze aandoeningen en wijzen op hoe de groeiende populatie van getroffen individuen te beheren. Het hebben van vergelijkbare neurodegeneratieresultaten in de literatuur is de sleutel tot het ondersteunen van dit doel.
Om de resultaten van dit scoresysteem te interpreteren, stellen we voor om elke dendrietscore als n = 1 te beschouwen, omdat verschillende neuronen binnen dezelfde worm vaak anders reageren op de behandeling. Dit kan worden aangedreven door het feit dat alleen de CEPD-neuronen direct worden blootgesteld aan de pseudocoeloïmische lichaamsvloeistof. Als zodanig kan de scorespreiding van experimentele groepen worden weergegeven als verhoudingen van het totale aantal gescoorde dendrieten in elke groep. Deze methode, gebruikt voor de representatieve resultaten die hier worden getoond, maakt een eenvoudige vergelijking tussen behandelingsgroepen mogelijk, houdt rekening met differentiële reacties binnen dezelfde worm en kan gemakkelijk worden geanalyseerd met een Chi-kwadraattest aangevuld met een Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen. Een voorbeeldsjabloon voor het registreren van neuronscores en het berekenen van percentages is te vinden in Aanvullend bestand 2. We hebben twee alternatieve methoden voor gegevensanalyse overwogen en identificeren fouten in elk. De eerste optie is het gemiddelde van de scores van de vier CEP-neuronen voor elke worm. Dit parametreert de gegevens; het gaat echter uit van een lineaire relatie met toenemende score en verliest informatie over eventuele variaties in respons op behandeling binnen dezelfde worm. De tweede optie is om de scores van alle vier cep-neuronen voor elke worm op te tellen, die ook de gegevens parametriseren. Dit veronderstelt nog steeds een lineaire relatie tussen scores, maar het verklaart beter verschillen binnen elke worm dan gemiddelde scores door de parameters van mogelijke scores uit te breiden. Hoe individuele onderzoekers ook besluiten om hun gegevens weer te geven, de resultaten moeten worden beschouwd naast experimentele variabelen zoals stam- en wormeieren; oudere wormen hebben bijvoorbeeld een hoger verwacht basisniveau van degeneratie.
Naarmate deze neurodegeneratiescoreresultaten worden geïnterpreteerd, moeten onderzoekers zich ook bewust zijn van een paar kanttekeningen en beperkingen van de scoringsmethode. Ten eerste zijn bepaalde technologische vereisten nodig om beelden vast te leggen die geschikt zijn om te scoren. De beeldvormingsmicroscoop moet fluorescentiekanalen en vergrotings- en belichtingsinstellingen ondersteunen die een duidelijke visualisatie van CEP-dendrieten mogelijk maken. Zoals opgemerkt in het protocol, kunnen technologische vereisten worden verminderd door protocolaanpassingen zoals het scoren van live beelden door het microscopische veld in plaats van het vastleggen van beelden die op een later tijdstip moeten worden gearchiveerd en gescoord. Ten tweede zijn mogelijke statistische analysemethoden voor deze gegevens beperkt omdat de gegevens niet-parametrisch zijn. De scoringsschaal wordt verondersteld progressief te zijn, maar kan niet als numeriek worden beschouwd omdat er discrete scoreopties zijn en scoreverhogingen niet noodzakelijkerwijs evenredig zijn met elkaar met betrekking tot de biologische functie. Om deze redenen zijn chi-kwadraattests voor onafhankelijkheid het meest geschikt voor dit soort gegevens, wat betekent dat de statistische analyse afhankelijk is van de waarnemer om de richting van een statistische significantie te bepalen. Met name de chi-kwadraattest analyseert ook alleen op verschillen in scoreverdeling en kan geen bewijs leveren van verschillen in specifieke scoringscategorieën. Ten slotte moet de functionele significantie van de morfologische veranderingen die door dit scoresysteem worden gekwantificeerd, nog worden bestudeerd.
De toekomstige richtingen die worden ingegeven door de ontwikkeling van dit scoresysteem omvatten het bepalen van biologische bases en correlaties met individuele neuronscores. Het bestuderen van de functionele significantie (bijv. neuronale signalering, wormgedrag) van alle punten op de scoreschaal zal informeren hoe de resultaten beter kunnen worden vertaald naar conclusies die van toepassing zijn op het begrijpen van de oorzaken en gevolgen van neurodegeneratieve ziekten en het ontwikkelen van preventie- en behandelingsopties. Toekomstig onderzoek naar neurodegeneratie bij wormen moet gericht zijn op het ontdekken van verbanden met andere morfologie, zoals de vorm en grootte van de worm. Bovendien kan neurodegeneratie-onderzoek worden ondersteund door andere reporter C. elegans-stammen te bestuderen om eindpunten te meten, zoals bio-energetica, productie van reactieve zuurstofsoorten en mitochondriale morfologie.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
We willen Ian T. Ryde bedanken voor zijn bijdragen aan de ontwikkeling van de scoreschaal en voor zijn steun bij de creatie van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (T32ES021432 ondersteunde KSM en P42ES010356 tot JNM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3x1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
References
- Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson's Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
- Hayes, M. T. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
- Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson's disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1973).
- Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
- Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
- Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
- Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson's disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
- Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R. Manganese and C. elegans in Parkinson's disease. Parkinson's Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. Nass, R., Przedborski, S. , Elsevier Inc. (2008).
- Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson's Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
- Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson's Disease in C. elegans. Journal of Parkinson's Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
- Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson's disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
- Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
- Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
- Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
- Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
- Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
- Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
- Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
- Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
- Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
- Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson's disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
- Lesage, S., Brice, A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
- Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson's Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
- Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson's disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson's Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
- Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
- Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
- Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
- Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson's disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
- Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
- Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
- Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
- Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
- Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
- National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
- Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).
