Summary
이 기사에서는 7점 득점 시스템을 사용하여 C. elegans의도파민성 뉴런 원간 형태에 대한 변경 사항을 일관되게 정량화하는 방법을 소개합니다. 이 시스템은 유전, 화학 및 신경 퇴행성 질환의 노화 기반 모델을 활용한 도파민성 신경 변성 분석의 분석을 위한 것입니다.
Abstract
도파민 뉴런 손실은 파킨슨 병의 병리학에 관여 (PD), 전 세계적으로 1천만 명 이상에 영향을 미치는 매우 널리 퍼진 신경 퇴행성 장애. PD 병인학에 관하여 많은 세부 사항은 알려지지 않았기 때문에, PD에 유전 및 환경 기여자를 조사하는 연구 결과는 예방, 관리 및 처리의 방법을 발견하기 위하여 필요합니다. 도파민성 뉴런 손실의 적절한 특성화는 PD 연구뿐만 아니라 다른 점점 더 널리 퍼진 신경 퇴행성 질환과 관련이 있을 수 있습니다.
선충의 투명성과 불변성 뉴런 아키텍처에 의해 지원되는 신경생물학의 쉬운 시각화와 함께, Caenorhabditis elegans 모델 시스템에서 도파민저제 신경 변성의 확립된 유전 및 화학 모형이 있습니다. 특히, 헤르마필로디틱 C. 엘레간스의 도파민성 뉴런 형태학적 변화는 8가지 도파민 트랜스포닉 뉴런에서 독점적으로 발현되는 dat-1 도파민 수송 유전자와 같은 세포 별 프로모터에 의해 구동되는 형광 기자와 균주를 사용하여 시각화될 수 있다.
이 모델 시스템의 기능과 적절한 기술로 많은 실험실에서 도파민제 신경 변성을 연구했습니다. 그러나, 데이터가 분석되는 방식에 는 일관성이 거의 없으며, 현재 문헌의 대부분은 변성의 존재를 포착하지만 뉴런 손실의 진행에 대한 전체 세부 사항은 아니라 이진 점수 분석을 사용합니다. 여기에서, 우리는 C. elegans'cephalic 뉴런 원더라이트에서 형태학적 변화와 변성을 평가하기 위해 보편적 인 채점 시스템을 소개합니다. 이 7점 척도는 건강한 뉴런에서 완전한 원점 손실에 이르기까지 모든 수선성 형태학에 걸쳐 분석할 수 있으며 꼬임, 분기, 흠 및 파손을 포함한 형태학적 세부 사항을 고려할 수 있습니다. 이 점수 시스템을 통해 연구자들은 미묘한 노화 와 관련된 변화와 더 극적인 화학 적 유발 변화를 정량화 할 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법에 새로운 연구원의 점수 일관성을 훈련, 보정 및 평가하는 데 사용할 수 있는 해설이 있는 이미지 실습 세트를 제공합니다. 이것은 실험실 내 및 실험실 간 일관성을 향상시켜 엄격성과 재현성을 높여야 합니다.
Introduction
파킨슨 병 (PD)은 전 세계적으로 최대 1,000 만 명의 개인에 영향을 미치는 점점 더 흔한 신경 퇴행성질환입니다. 남성과 노인은 PD 개발을 위한 고위험에; 질병에 대한 발병의 평균 연령은 60 년이며, PD 부각은 일반 인구에서 0.3 %의 부각에서 80 세 이상 개인에서 3 %로 올라갑니다1,2. PD 병리학의 세부 사항은 완전히 이해되지 않지만,이 진보적 인 장애는 중뇌의 실질적인 니그라 영역에서 도파민 간 뉴런의 손실을 포함한다. 이 신경 손실의 가설된 기계장치는 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스 및 염증2를포함한다. 질병의 원인과 위험 요소는 여전히 탐구되고 있지만 환경 및 유전 적 요인1의조합을 포함합니다. 예를 들어, 연구는 평생 농약 사용과 PD 사이의 긍정적 인 연관성뿐만 아니라 가족 PD1,3에대한 유전 적 감수성을 발견했다.
원래 신경생물학 연구4를위해 부분적으로 개발된 C. elegans 모델 시스템은 생체 내에서 도파민성 뉴런 손실을 평가하는 데 적합합니다. Nass와 동료들은 도파민성 신경 변성5를위해 C. 엘레건의 사용을 개척했으며, 많은 그룹은 이후 PD및 도파민 기능장애6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17에 대한 성공적인 모델로 웜을채택했습니다. ,18,19,20. C. elegans는 생물학의 그밖 지역에 대한 그 같은 대중적인 모형 유기체인 것과 같은 이유의 많은 을 위한 좋은 신경 퇴행성 질병 모형입니다; 그들의 투명성은 세포 과정의 생체 내 연구를 허용하고, 벌레의 유전 조작은 상대적으로 빠르고 쉽고, 약 3 일의 짧은 세대 시간을 가지고 있으며,21을유지하기 쉽습니다. 대부분의 PD 웜 모델은 연령 기반 모델, 화학 모델 및 유전 모델의 세 가지 범주 중 하나에 속합니다. 벌레의 인구를 동기화하는 기능은 PD22와같은 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 연령 기반 모델에 대한 연령 관련 신경 변성의 연구를 허용합니다. PD와 같은 신경 결함을 유발하는 화학적 노출은 6-하이드록시도파민(6-OHDA), 로테네톤, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)22를포함한 다양한 화학물질을 사용하여 확립되었다. 벌레는 또한 PD의 유전 모델로 성공적으로 이용됩니다; 선택 신경 유전자 녹아웃균은 다양한 신경 퇴행성 질환1,4를모델링 할 수 있습니다. PD 2, 17,23,24,25,26,27, 27,28에서중요한 역할을 할 가능성이 있는 유전 적 및 환경 적 요인 또는 "유전자 환경 상호 작용"의 조합은 C. elegans를사용하여 여러 그룹에 의해 검사되었습니다. 마지막으로, 연령관련 도파민성 신경변성도관찰되었다 29,30. 형광 화상 진찰에 있는 적당한 신경 형질 긴장을 사용하는 경우에, 이 PD 벌레 모형의 어느 것이 도파민성 신경 변성을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
신경 형태에 변화를 정량화하는 것은 신경 퇴행성 연구의 중요한 구성 요소입니다. C. elegans에서,많은 형광 기자 균주는 뉴런의 형태학적 변화와 손실을 시각화하는 데 사용되었습니다. 신경 화상 진찰에 적합한 긴장은 세포 특정 프로모터와 관련되었던 형광 단백질을 특징으로 합니다. 도파민성 신경변성 애사에 대해, 저희 실험실은 dat-1 유전자에 녹색 형광 단백질(GFP) 태그를 가진 BY200 [vtIs1(dat-1p:GFP,rol-6)] 균주를 사용했으며, 도파민성 뉴런으로 표현되었다. BY200의 롤러 표현형은 침투가 매우 낮으며 거의 관찰되지 않습니다. 화상 진찰의 이 모형을 위해 이용된 그밖 일반적인 긴장은 BY250[dat-1p:::GFP]를 포함합니다, BY273 [baEx18[dat-1p:::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1[dat-1p:::GFP]], 그리고 특정 노동계의 요청에 따라 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에서 사용할 수있는 여러 가지 다른사람,21,29 . 이 긴장은 전형적으로 도파민제 뉴런의 모든 3개의 클래스의 시각화를 허용합니다: 세팔릭 (CEP), 전방 deirid (ADE), 및 포스트 데이리드 (PDE) 뉴런. C. 엘레간은 알파 시뉴클레인 단백질을 자연적으로 발현하지 는 않지만 BY273과 같은 균주는 이를 표현하도록 설계되었습니다. 그러나, 우리가 제시하는 득점 시스템은 알파 synuclein을 표현하지 않는 BY200을 사용하여 개발되었으며, 사용하기 전에 그 변형 (또는 다른 새로운 변형)으로 검증될 필요가 있음을 주목합니다. 추가 도파민성 뉴런은 남성에 존재하지만 남성은 일반적으로 C. elegans 인구의 <1 %를 구성하기 때문에 거의 고려되지 않습니다. 여기서, 우리는 C. elegans의머리 부위에서 발견되는 4개의 CEP 도파민성 뉴런에 초점을 맞추고 있습니다. 뉴런의이 세트는 쉽게 형광 현미경 검사의 밑에 위치하고, 헤르마크로디테와 남성 벌레 둘 다에 존재하고, 전형적으로 자동 형광의 그밖 지역과 겹치지 않으며, 일반적으로 벌레 연구 결과에서 보고됩니다. 특히, 이러한 뉴런은 골수화되지 않지만 CEP 등색 (CEPD) 뉴런은 CEP 복부 신경세포가 아닌 의사 류경상구체 유체에 직접 노출됩니다. CEP 수상라이트의 건강한 세트는 일반적으로 상대적으로 직선, 중단없는 선으로 표시됩니다. 퇴화 된 수상자는 점막의 라인을 따라 결점이라고 불리는 뚜렷한 점을 포함하여 부정과 손상의 징후의 조합을 표시 할 수 있으며, 수상자의 라인에서 파손. 다양한 수준의 변성에서 CEP 뉴런의 예는 도 1에서볼 수 있다.
도파민성 신경변성은 C. elegans 실험실의 증가에 의해 연구되고 있지만, 도파민성 뉴런 손상을 정량화하는 분석 방법에 큰 변화가 있었다29,31,32,33,34. 많은 출판 된 연구는 일반적인 또는 야생 형 뉴런31,32대 퇴행성 의 바이너리 채점 시스템을 가진 CEP 소마의 존재 또는 부재에 보고했다. 이러한 점수 매기기 방법은 신경 변성을 유도하는 특정 스트레스를 식별할 수 있지만 더 미묘한 신경 손상의 진행의 세부 사항을 정량화하거나 독특한 화학 물질 이나 다른 변수에 의해 유도 된 신경 변성 사이의 차이를 쉽게 감지 할 수 없습니다. 추가적으로, 세포 바디에 집중된 채점 시스템은 손상의 더 적게 가혹한 수준에 또는 원점과 같은 세포의 단지 부분에 영향을 미치는 신경 손상에 민감하지 않을 수 있습니다. 원원자는 화학 스트레스에 대한 응답으로 일관되게 검출 가능한 형태학적 변화의 가장 큰 범위를 가지고 있는 것으로 나타나기 때문에, 우리는 우리의 분석의 기초로 선택했습니다. 여기서 제시하는 채점 시스템은 이전에 당사의 실험실29,33에서사용되었던 원회성 형태기반 멀티포인트 스케일에서 수정됩니다. 이 시스템은 이러한 5점 및 6점 척도를 7점 척도로 확장하여 노인 성수기의 꼬임 수가 증가하고 심각한 손상과 완전한 민원 손실을 구별하는 등 연령과 관련된 형태학적 변화를 고려합니다. 이 점수 시스템을 도입하는 목적은 신경 손상의 모든 수준에서 신경 변성의 포괄적 인 그림을 캡처하고 C. elegan dopaminergic 신경 변성 연구에 걸쳐 일관성을 지원하는 보편적 인 시스템을 제공하는 것입니다. 득점은 본질적으로 주관적이기 때문에 개인 득점 사이의 일관성을 극대화하고 수동 블라인드 또는 자동 블라인드 프로그램(35)을사용하여 이미지의 정체성에 점수를 맹목적으로 하는 것이 중요합니다. 일관성을 향상시키기 위해 일련의 교육 이미지를 제시하고 JoVE의 비디오 기능을 활용하여 점수 매기기 시스템을 자세히 보여줍니다. 두 가지 모두 자동 블라인드 득점을 허용하고 득점자가 이미지의 하위 집합을 다시 득점하여 점수 일관성을 정량화할 수 있는 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 여러 과학자의 데이터를 결합하거나 비교하거나 점수를 새로 훈련할 때 특히 중요합니다.
Protocol
1. 이미징을 위한 웜 준비
참고 : 관련 JoVE 비디오 기사31: https://www.jove.com/v/835/
- 각 실험 군을 위해, 파이펫 또는 이미징 현미경과 호환되는 이미징 플랫폼에 20~30개의 웜을 선택한다. 가장 일반적인 플랫폼으로는 유리 슬라이드에 장착된 2% 아가로즈 젤 패드와 커버슬립31 및 액체 매체의 100 μL 미만의 음량을 포함하는 96웰 플레이트가 있습니다.
- 30-90 mM 나트륨 아지드(NaN3),2.5-8.5 mM 레바미솔 HCl 또는 다른 마비제를 웜에 추가하여 웜을 마비시킵니다. 액체에서 마비하는 경우 아가로즈 패드에서 마비되는 경우보다 마비 제의 농도가 높아지면 됩니다. 이미징 플랫폼을 부드럽게 탭하여 혼합합니다.
- 웜이 완전히 마비되도록 허용합니다.
참고: 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
2. 이미지 도파민기뉴런
- z 스택을 복용할 수 있는 이미징 현미경을 사용하여 단일 색 GFP 형광하에서 웜의 머리 영역을 찾습니다.
- 노출 및 조리개 설정을 염두에 두십시오. 수상자의 과다 노출을 방지하고 시험 전반에 걸쳐 설정을 일관되게 유지합니다. 명확한 시각화를 위해 필요한 만큼 선점을 밝게 만듭니다. 이것은 전형적으로 소마의 과다 노출을 초래합니다.
참고: 이 프로토콜에 포함된 이미지는 400배율을 사용하여 캡처되었습니다.
- 노출 및 조리개 설정을 염두에 두십시오. 수상자의 과다 노출을 방지하고 시험 전반에 걸쳐 설정을 일관되게 유지합니다. 명확한 시각화를 위해 필요한 만큼 선점을 밝게 만듭니다. 이것은 전형적으로 소마의 과다 노출을 초래합니다.
- 포커스를 스크롤하여 수상자가 선명한 상하 경계를 찾습니다. z 스택 이미지 캡처를 위해 상위 및 하부 경계로 설정합니다.
- 각 웜에 대해 z 스택 이미지를 캡처하려면 클릭합니다.
참고: 다음의 모든 단계는 언제든지 수행될 수 있습니다.
3. 득점도파민성 뉴런 이미지 준비
- 각 z 스택에 대해 현미경 소프트웨어 또는 외부 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 열고 소프트웨어의 스택을 로드하고 스택을 단일 평평한 이미지로 압축합니다.
- 수동으로 또는 자동 블라인드 소프트웨어를 사용하여 치료 그룹 간 및 치료 그룹 내의 블라인드 이미지.
4. 점수 도파민기 신경 민들라이트
- 한 번에 하나의 뉴런 이미지로 작업할 수 있습니다. 굽힘, 꼬임 및 곡선을 포함한 4개의 CEP 점장 중 하나를 선택하여 블렙, 브레이크 및 요철을 평가합니다. 코가 이미지 의 상단에있을 때 왼쪽에서 오른쪽으로 득점하는 것이 좋습니다 점수의 반복성을 보장하기 위해.
- 다음 지침을 사용하여 점선에 하나의 점수 값을 할당합니다. 대표적인 점수 매기기 이미지 예제의 그림 1을 참조하십시오.
0- 손상 없음, "완벽한" 뉴런
1- 불규칙한 (꼬임, 곡선 등)
2- <5 블
3- 5-10 블렙
4- >10 개의 흠 및 / 또는 파손 제거 <25% 총 점자
5-파손, 25-75% 담장 제거
6-파손, >75% 원원 제거- 단일 원점(즉, 꼬임 및 흠)내에서 여러 기준이 충족되는 경우 가장 높은 해당 점수를 할당합니다.
- 이미지 캡처 문제, 다른 점선과 겹치는 점원 등으로 인해 명확하게 표시되지 않는 점원기를 점수 매기지 마십시오. 평평한 z 스택 이미지를 확대하는 경우 거짓 블B와 유사한 확대된 픽셀을 염두에 두어야 합니다.
- 각 수상자식에 대해 반복합니다. 모든 이미지에 대해 반복합니다.
- 모든 점수를 기록합니다. 점수는 이 시점에서 눈이 멀지 않을 수 있습니다.
5. 데이터 준비 및 현재
- 각 신경 변성 점수에 할당 된 각 치료 그룹에서 점자의 총 수를 계산합니다. 각 치료 그룹에서 총 점자 점원수를 계산합니다.
- 치료 그룹에서 득점된 총 수의 담수로 신경변성 점수를 나눈다. 각 신경 변성 점수에서 치료 그룹 내에서 점생기의 비율로 데이터를 제시한다.
6. 통계 분석 수행
- 프로그래밍 소프트웨어를 사용하거나 수동으로 모든 치료 그룹 쌍 간의 독립성 용 치 제곱 테스트를 실행하여 비교할 수 있습니다. 적절한 경우, 비교 된 실험 그룹의 수에 따라 p 값의 Bonferroni 보정을 적용하여 여러 비교를 고려하십시오.
참고: 이 테스트는 두 그룹 간의 상당한 차이점을 결정하지만 차이 유형의 세부 사항은 눈으로 검증되어야 합니다.- 실험 그룹 간의 비교를 선택합니다. 이는 실험설계에 따라 달라질 수 있습니다.
참고: 우리의 실험에서, 전형적으로, 통제는 그들의 각각 처리 단에 비교되고, 모든 통제는 비교되고, 모든 처리는 비교됩니다.
- 실험 그룹 간의 비교를 선택합니다. 이는 실험설계에 따라 달라질 수 있습니다.
7. 도파민성 뉴런 이미지의 연습 세트와 연습 점수
- 해설 및 점수 키와 우리의 점수 시스템의 전체 범위에 걸쳐 제시 하는 신경 이미지의 집합에 대 한 보충 파일 1을 참조 하십시오. 이 연습 세트는 이 방법을 새로 연구원을 양성하고 인터 레이터 신뢰성을 보장하기 위한 것입니다.
8. 대체 프로토콜 옵션 고려
- z 스택을 캡처하는 대신 이미지를 저장하거나 적층하지 않고 현미경에서 완전한 점수를 획득합니다.
참고: 이 옵션은 기술 기능에 대한 요구 사항을 줄이지만 나중에 돌아갈 뉴런 이미지 아카이브를 만드는 옵션을 제거하고 수동 블라인드가 필요하며 치료 그룹 내에서만 눈을 멀게 할 수 있습니다. - 스택당 압축된 단일 이미지를 만드는 대신 각 z 스택의 이미지를 스크롤하여 전체 점수를 완료합니다.
참고: 이 옵션은 일부 득점자가 더 쉬울 수 있으며 이미징 중에 이동하여 중복되는 점원기를 득점할 수 있는 웜에 거짓 결점을 볼 위험을 줄이지만 수동 블라인드가 필요하며 치료 그룹 내에서만 눈을 멀게 할 수 있습니다.
Representative Results
여기에 설명된 채점 시스템은 L4 애벌레 단계 BY200 [vtIs1 (dat-1p:GFP, rol -6)] 로테네 노출 후 C. 엘레간에서 신경 변성을 평가하는 데 사용되었다. 이 실험의 결과는 그림 2에 표시되며 도파민성 뉴런 손상의 가변 수준을 감지하고 정량화하는 우리의 채점 시스템의 능력을 나타냅니다. 로테네네는 자연적으로 발생하는 전자 수송 사슬 복합체 I 억제제는 일부 살충제, 피시제 및 살충제36,37에사용된다. 로테네론과 같은 독성 화학 물질과 협력하는 것은 본질적으로 위험하며 모든 실험실은 기관이 정한 모든 사용 및 폐기 규정을 준수해야 합니다. 본 실험에서, 대조군과 함께 2회 용량의 액체 로테네 노출은 0.5M 나트륨 수산화나트륨/1% 저혈당 리시스(38)를 수확하기 위해 시작되었다. 완전한 K-medium33,39로 부화한 계란은 0.25% 디메틸 설산화물(DMSO)로, 벌레는 L4 중부 라발 단계까지 ~48시간 동안 액체에 남아 있었으며, 이 때 화학적 노출에서 제거되고, 이미지화하고, 그림 1을 참조로 사용하여 위의 프로토콜 단계에 따라 점수를 받았다. 0.5 μM 로테네네의 더 높은 용량을 위해, 계란은 로테네른 유도 발달 지연을 고려하고 모든 벌레가 이미징 시 단계 동기화되었는지 확인하기 위해 24 시간 전에 수확되었다.
그림 2는 실험실에서 이 채점 시스템을 사용하여 수집된 데이터를 시각화하는 방법을 더욱 보여줍니다. 이 그림에서, 투여량 의존성 신경변성 반응을 평가할 수 있고, 점수 분포의 특정 분석이 명확하게 표시됩니다. 이러한 특정 결과 어떻게 신경 손상 다른 방법으로 표시할 수 있습니다 전시. 예를 들어, 0.03 μM 로테네론-노출된 군은 대조군에 비해 0점을 가진 건강한 뉴런의 비율이 감소하지만, 5점수의 비율이 감소한다. 실험 그룹 간의 점수 분포에 대한 이 세부 사항을 감지하면 7점 득점 시스템의 민감도가 강조 표시됩니다. 이 데이터는 본페로니 보정을 통해 독립성에 대한 치제곱 테스트를 사용하여 프로토콜에 따른 통계적 유의를 분석했다.
그림 1. 도파민 뉴런 형태학적 변경 및 변성 점수 시스템 대표 이미지. 이 통합 차트는 각 점수의 뉴런 의 예를 포함하고 점수를 위한 참조로 사용됩니다. 여기서, 각 레이블이 지정된 점수는 각 패널의 화살표로 표시된 대로 각 웜에서 가장 손상된 원점과 일치합니다. 이러한 이미지는 BY200 C. elegans와함께이 논문에 설명 된 프로토콜을 사용하여 촬영되었습니다. 이 점수 매기기 방법에 새로 사용되는 해설이있는 점수 가있는 이미지 세트는 보충 파일 1을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. BY200 L4 도파민 뉴런 형태학 및 로테톤 노출 후 변성 점수. 이 수치는 여기에 설명된 채점 방법을 사용하여 분석된 대표적인 결과를 보여줍니다. 로테네 노출 농도가 높은 손상된 도파민성 뉴런의 더 큰 비율은 독립을 위한 치제곱 테스트를 사용하여 통계적으로 분석되었다. 두 로테네 치료 그룹은 대조군에 비해 통계적으로 유의한 p-값을 산출하였다. 문자가 다르면 통계적 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 C. elegans에서도파민성 뉴런 형태학적 변경 및 변성의 수준을 정량화하기 위해 실험실에서 개발 된 7 점 척도를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이 규모를 벌레에서 도파민성 신경변성 작업의 분석을 표준화하는 도구로 만들고 공유했습니다. 고도로 널리 퍼진 신경퇴행성 질환에 관여하는 경로를 연구하는 것의 중요성을 인식, 많은 연구자들은 신경 생물학 시각화에 대한 C. elegans 모델의 적합성을 활용하여 신경 변성29,31,32,33을연구합니다. 그러나, 뉴런 손상이 벌레의 신경 변성 연구를 통해 정량화되는 방법에 있는 큰 변이를 감소시키기 위하여 아직 노력이 없습니다. 따라서 여기에 제시된 채점 시스템은 분석의 일관성을 촉진하고 연구 간의 비교를 허용하기 위한 것입니다.
당사의 채점 시스템은 도파민성 뉴런의 시각화를 허용하는 세포별 형광 기자(특히 CEP 원더라이트)를 사용하는 C. elegans 실험에서 파생된 데이터를 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 구체적으로, 도파민성 뉴런의 GFP 시각화를 위한 dat-1 유전자에 태그된 균주는 PD의 다른 많은 관련 형질형성 모델이 존재하지만, 이 채점 프로토콜과 호환된다. 이 점수 매기기 시스템은 이러한 모델에도 유용할 수 있습니다. 그러나 이를 사용하기 전에 유효성을 검사해야 합니다. 특히, mCherry와의 균주가 이 프로토콜에 적합하지 않을 수 있으므로 mCherry 집계가 결안과 구별되거나 세포 스트레스로 이어질 수 있으므로 (우리의 지식에 대한 테스트되지 않음) 균주가 가능할 수 있다. PD와 관련 신경 퇴행성 질환의 모든 특정 모델에 대한 해설을 제공하는 대신, 우리는 신경 퇴행성 데이터 자체의 점수에 초점을 맞추고 있습니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 신경 형태학에만 초점을 맞추고 소마의 형광 수준을 고려하지 않습니다. 신경 변성 소사는 운동, 수명 및 건강 기간 실험과 같은 신경 퇴행성 질환과 관련된 행동 적 해석과 함께 수행 될 수 있습니다. PD의 확립된 화학, 연령 기반 및 유전 모델의 변성 수준은 또한 이 점수 시스템을 사용하여 확인되고 상세할 수 있다. PD 및 그밖 신경 퇴행성 질병과 관련되었던 모형, 기여자 및 통로를 측정하는 것은 이 무질서에 관하여 과학적인 지식에 추가하고 영향 받은 개별의 증가하는 인구를 처리하는 쪽으로 가리킬 수 있습니다. 문학 전반에 걸쳐 비교 신경 변성 결과를 갖는 것은이 목표를 지원하는 열쇠입니다.
이 점수 시스템에서 파생된 결과를 해석하기 위해 동일한 웜 내의 다른 뉴런이 종종 치료에 다르게 반응하기 때문에 각 원점이 n=1로 득점되는 것을 고려할 것을 제안합니다. 이것은 CEPD 뉴런만이 의사 체액에 직접 노출된다는 사실에 의해 구동 될 수있다. 따라서 실험 그룹의 점수 스프레드를 각 그룹에서 득점한 총 원점 수의 비율로 표시할 수 있습니다. 여기에 표시된 대표적인 결과에 사용되는 이 방법은 치료 군 전반에 걸쳐 쉽게 비교할 수 있게 해주며, 동일한 웜 내의 차동 반응을 기록하며, 여러 비교를 위한 본페로니 보정에 의해 칭찬된 치제곱 검사로 쉽게 분석된다. 뉴런 점수를 기록하고 백분율을 계산하기 위한 예제 템플릿은 보충 파일 2에서찾을 수 있습니다. 우리는 데이터 분석을 위한 두 가지 대체 방법을 고려하고 각각의 결함을 식별했습니다. 첫 번째 옵션은 각 웜에 대한 4개의 CEP 뉴런의 점수를 평균화하는 것입니다. 이것은 데이터를 마비시다. 그러나, 그것은 증가 점수와 선형 관계를 가정 하 고 동일한 웜 내에서 치료에 대 한 응답에 어떤 변화에 대 한 정보를 잃는다. 두 번째 옵션은 각 웜에 대한 4개의 CEP 뉴런 의 점수를 합산하는 것으로, 이는 또한 데이터를 패러크리징합니다. 이것은 여전히 점수 사이의 선형 관계를 가정하지만 가능한 점수의 매개 변수를 확장하여 평균 점수보다 각 웜 내의 차이를 더 많이 차지할 수 있습니다. 그러나 개별 연구원은 그들의 데이터를 표시하기로 결정합니다, 결과는 긴장과 벌레 나이와 같은 실험적인 변수와 더불어 고려되어야 합니다; 예를 들어, 이전 웜은 예상 기준 수준인 변성을 갖습니다.
이러한 신경 변성 점수 결과가 해석되기 때문에 연구자들은 또한 득점 방법의 몇 가지 주의 사항과 한계를 알고 있어야합니다. 첫째, 채점에 적합한 이미지를 캡처하려면 특정 기술 요구 사항이 필요합니다. 이미징 현미경은 CEP 모더라이트의 명확한 시각화를 허용하는 형광 채널 및 배율 및 노출 설정을 지원해야 합니다. 프로토콜에 언급된 바와 같이, 기술 요구 사항은 나중에 보관하고 득점할 이미지를 캡처하는 대신 현미경 필드를 통해 라이브 이미지를 채점하는 것과 같은 프로토콜 조정에 의해 감소될 수 있다. 둘째, 이 데이터에 대한 가능한 통계 분석 방법은 데이터가 비파라메트릭이기 때문에 제한됩니다. 채점 척도는 점진적인 것으로 추정되지만, 이산 점수 옵션과 점수 증가가 생물학적 기능에 대하여 반드시 서로 비례하지 않기 때문에 숫자로 간주될 수 없다. 이러한 이유로 독립성 검사는 이러한 유형의 데이터에 가장 적합하므로 통계 분석은 관찰자에 따라 통계적 유의 방향을 결정합니다. 특히, 치제곱 테스트는 점수 분포의 차이만 분석하고 특정 점수 범주의 차이에 대한 증거를 제공할 수 없습니다. 마지막으로, 이 채점 시스템에 의해 정량화된 형태학적 변화의 기능적 중요성은 아직 연구되지 않았습니다.
이 점수 시스템의 개발에 의해 자극된 미래 방향은 개별 적인 신경 점수와 생물학 기지 및 상관관계를 결정하는 관련시킵니다. 점수 척도의 모든 점의 기능적 중요성(예: 신경 신호, 웜 동작)을 연구하면 신경 퇴행성 질환의 원인과 결과를 이해하고 예방 및 치료 옵션을 개발하는 데 적용 가능한 결론으로 결과를 더 잘 번역하는 방법을 알 수 있습니다. 벌레의 신경 변성에 대한 향후 연구는 웜 모양과 크기와 같은 다른 형태에 대한 연결을 발견하는 것을 목표로해야합니다. 또한, 신경변성 연구는 생체 에너지, 반응성 산소 종 생산 및 미토콘드리아 형태와 같은 종점을 측정하기 위해 다른 기자 C. elegans 균주를 연구함으로써 지원될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개가 없습니다.
Acknowledgments
우리는 이안 T. 라이드, 점수 규모의 개발에 기여하고이 원고를 만드는 동안 그의 지원에 대한 인정하고자합니다. 이 작품은 국립 보건원 (T32ES021432 지원 KSM, JNM에 P42ES010356)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3x1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
References
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