Summary
هنا ، نصف نظام إعادة برمجة مباشر محسن للخلايا الصباغية ونظام تعبئة فيروسات عالي الكفاءة ومركز يضمن إعادة برمجة مباشرة سلسة.
Abstract
فقدان وظيفة الخلايا الصباغية يؤدي إلى البهاق ، مما يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. في الوقت الحاضر ، لا يوجد علاج فعال طويل الأجل للبهاق. لذلك ، من الضروري تطوير علاج مناسب وفعال للبهاق. يبدو أن تقنية الطب التجديدي لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية هي علاج جديد واعد للبهاق. وهذا ينطوي على إعادة برمجة مباشرة من خلايا الجلد المريض إلى الخلايا الصباغية الوظيفية للمساعدة في تخفيف فقدان الخلايا الصباغية في المرضى الذين يعانون من البهاق. ومع ذلك ، يجب اختبار هذه الطريقة أولا على الفئران. على الرغم من أن إعادة البرمجة المباشرة تستخدم على نطاق واسع ، إلا أنه لا يوجد بروتوكول واضح لإعادة البرمجة المباشرة في الخلايا الصباغية. علاوة على ذلك ، فإن عدد عوامل النسخ المتاحة ساحق.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول نظام تغليف فيروس lentivirus المركز لإنتاج عوامل النسخ المختارة لإعادة برمجة خلايا الجلد إلى الخلايا الصباغية ، بما في ذلك Sox10 و Mitf و Pax3 و Sox2 و Sox9 و Snai2. أصيبت الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFs) بفيروس lentivirus المركز لجميع عوامل النسخ هذه لإعادة البرمجة المباشرة ل MEFs إلى الخلايا الصباغية المستحثة (iMels) في المختبر. علاوة على ذلك ، تم فحص عوامل النسخ هذه ، وتم تحسين النظام لإعادة البرمجة المباشرة إلى الخلايا الصباغية. تم زيادة التعبير عن العلامات المميزة للميلانين في iMels على مستوى الجين أو البروتين بشكل كبير. تشير هذه النتائج إلى أن إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية يمكن أن تكون استراتيجية علاجية جديدة ناجحة للبهاق وتؤكد آلية تطور الخلايا الصباغية ، والتي ستوفر الأساس لمزيد من إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية في الجسم الحي.
Introduction
البهاق هو مرض جلدي يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. لأسباب مختلفة ، بما في ذلك تشوهات التمثيل الغذائي ، والإجهاد التأكسدي ، وتوليد الوسطاء الالتهابيين ، وانفصال الخلايا ، واستجابة المناعة الذاتية ، يتم فقدان الخلايا الصباغية الوظيفية ، ويتم إيقاف إفراز الميلانين ، مما يؤدي إلى تطور البهاق 1,2. تحدث هذه الحالة على نطاق واسع وهي مشكلة خاصة على الوجه. العلاج الرئيسي هو الاستخدام النظامي للكورتيكوستيرويدات وأجهزة المناعة. يمكن استخدام العلاج الضوئي للأمراض الجهازية أو المحلية ، وهناك علاجات جراحية ، مثل زرع الجلد المثقب وزرع الخلايا الصباغية الذاتية3،4،5. ومع ذلك ، فإن المرضى الذين يستخدمون العلاج الدوائي والعلاج الضوئي عرضة للانتكاس ، وهذه العلاجات لها آثار علاجية سيئة على المدى الطويل. العلاج الجراحي مؤلم وفعال بشكل معتدل فقط 2,6. لذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجية علاجية جديدة وفعالة للبهاق.
إن إعادة برمجة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) تعكس هذه الخلايا من حالتها الطرفية إلى حالة متعددة القدرات ، وهي عملية تتوسط فيها عوامل النسخ ، Oct4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc7. ومع ذلك ، نظرا لإمكانية الإصابة بالأورام ووقت الإنتاج الطويل ، فقد قوبلت هذه التكنولوجيا بالشك عند تطبيقها على الإعدادات السريرية8. إعادة البرمجة المباشرة هي تقنية تجعل نوعا واحدا من الخلايا الطرفية يتحول إلى نوع آخر من الخلايا الطرفية9. يتم تحقيق هذه العملية من خلال عوامل النسخ المناسبة. وقد تمت بالفعل إعادة برمجة خلايا مختلفة مباشرة بنجاح، بما في ذلك الخلايا العضلية القلبية10 والخلايا العصبية 11 وخلايا الشعر القوقعية12. حتى أن بعض الباحثين أعادوا برمجة أنسجة الجلد مباشرة في الموقع ، والتي يمكن استخدامها لإصلاح الجروح13. تشمل مزايا إعادة البرمجة المباشرة تقليل أوقات الانتظار والتكاليف ، وانخفاض خطر الإصابة بالسرطان ، وتقليل المشاكل الأخلاقية ، وفهم أفضل للآلية الكامنة وراء تحديد مصير الخلية9.
على الرغم من أن طريقة إعادة البرمجة المباشرة تستخدم على نطاق واسع ، إلا أنه لا توجد حاليا طريقة محددة لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية ، خاصة بسبب عوامل النسخ العديدة التي يجب مراعاتها14,15. تم استخدام عوامل النسخ ، Mitf و Sox10 و Pax3 ، لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى الخلايا الصباغية14. في المقابل ، تم استخدام مزيج من MITF و PAX3 و SOX2 و SOX9 أيضا لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا ميلانية بشرية في دراسة أخرى15. في هذا البروتوكول ، على الرغم من استخدام طريقة فحص مختلفة ، تم الحصول على نفس النتيجة مع مزيج من Mitf و Sox10 و Pax3 لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية كما هو موضح سابقا14. يمكن أن يوفر تطوير نظام لتوليد الخلايا الصباغية من خلايا الجلد الأخرى مخططا لتحويل خلايا الجلد الأخرى لمرضى البهاق إلى خلايا صباغية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان بناء طريقة بسيطة وفعالة لإعادة البرمجة المباشرة هذه لتوليد الخلايا الصباغية بنجاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة إدارة واستخدام المختبر في جامعة جيانغسو (UJS-IACUC-AP--20190305010). تم إجراء التجارب وفقا للمعايير التي وضعتها جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية المختبرات (AAALAC International). لم تكن هناك تجارب تشمل البشر ، لذلك لم يكن هذا العمل بحاجة إلى موافقة من لجنة أخلاقيات البحوث البشرية. ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف.
1. بناء نظام تغليف فيروس lentivirus مركز لعوامل النسخ
- إنتاج الفيروس المركز (الشكل 1 ألف، باء)
- طبق 1.5 × 106 خلايا HEK-293T في طبق 60 مم واستزرع هذه الخلايا بوسط طبيعي (انظر الجدول 1) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2.
ملاحظة: إذا كان الفيروس بحاجة إلى تعبئته على دفعات ، فيمكن استخدام طبق زراعة خلايا 100 مم (لمزيد من التفاصيل ، انظر الجدول 2). - بعد 24 ساعة ، تأكد من أن خلايا HEK-293T قد وصلت إلى التقاء 80-90٪ في يوم النقل ، واستبدل الوسط ب 3.5 مل من DMEM (150 ميكرولتر من DMEM لكل 1 سم2). اترك الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ CO 2 لمدة2 ساعة.
ملاحظة: يجب أن يكون الوسط البديل خاليا من المصل ، بحيث يمكن "تجويع" الخلايا لتحسين نقل البلازميد. - تحضير خليط البلازميدات (المزيج A) الذي يحتوي على 3 ميكروغرام من البلازميدات المستهدفة من Mitf أو Sox10 أو Pax3 أو Sox2 أو Sox9 أو Snai2 ؛ 1 ميكروغرام من بلازميد التعبئة والتغليف PMD2. G ، و 2 ميكروغرام من بلازميد التعبئة والتغليف PSPAX2. قم بتكوين حجم المزيج A إلى 150 ميكرولتر باستخدام DMEM الخالي من المصل. تحضير مزيج كاشف النقل (المزيج B) عن طريق إضافة 12 ميكرولتر من كاشف النقل (الحجم هو ضعف الكتلة الكلية لجميع البلازميدات) ، وتكوين حجم المزيج B إلى 150 ميكرولتر مع DMEM خالية من المصل.
ملاحظة: عند تحضير الخلطات ، من المهم إضافة السائل ببطء لتجنب فقاعات الهواء. - امزج المزيج A و B بعد السماح لهما بالوقوف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة لتشكيل مجمع النقل.
- أخرج خلايا HEK-293T من الحاضنة ، واستبدل الوسط ب DMEM + 2٪ FBS ، وأضف الخليط من الخطوة 1.1.4 قطرة ، واخلط السائل بلطف.
- بعد 8 ساعات ، قم بتغيير الوسط ب 3.5 مل من الوسط العادي. بعد تغيير الوسط ، قم بجمع supernatant الفيروس كل 24 ساعة و 48 ساعة.
- امزج المواد الخارقة للفيروس التي تم جمعها في نقطتين زمنيتين مختلفتين. جهاز طرد مركزي عند 200 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. مرر السوبرناتانت من خلال مرشحات 0.45 ميكرومتر وجمعها في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
ملاحظة: يمكن تخزين الفيروس الذي تم جمعه في 24 ساعة عند 4 درجات مئوية وخلطه مع الفيروس الذي تم جمعه في الساعة 48. - ركز الفيروس الفائق عن طريق الطرد المركزي عند 6000 × جم عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة). تأكد من أن حبيبات الفيروس مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي بعد الطرد المركزي.
- صب من supernatant ببطء. قم بإذابة بيليه الفيروس في حجم من الوسط الطبيعي الذي هو 1/100عشر من حجم الفيروس supernatant. باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، ماصة لأعلى ولأسفل بلطف حتى يتم الحصول على خليط متجانس. قسم الفيروس المركز إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة حسب الحاجة. يخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يتركز الفيروس 100x بهذه الطريقة. يمكن تخزين الفيروس المركز (100x) لمدة >1 سنة عند -80 درجة مئوية. تجنب التجميد المتكرر وذوبان الفيروس.
- طبق 1.5 × 106 خلايا HEK-293T في طبق 60 مم واستزرع هذه الخلايا بوسط طبيعي (انظر الجدول 1) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2.
- الكشف عن عيار الفيروسات المركز (الشكل 1 جيم)
- لوحة 1 × 105 خلايا HEK-293T في بئر واحد من لوحة 6 آبار. تذكر إضافة واحدة بشكل جيد بالإضافة إلى عنصر تحكم سلبي. استزرع هذه الخلايا ذات الوسط الطبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2.
- أضف 0.1 ميكرولتر أو 0.2 ميكرولتر من فيروس الفلورسنت المركز (100x) إلى كل بئر بعد 24 ساعة ، وأضف 4 نانوغرام / ميكرولتر من كاشف النقل البوليمري الكاتيوني إلى كل بئر. حوالي 8-12 ساعة بعد الإصابة ، استبدل الوسط بوسط عادي.
ملاحظة: لضمان دقة وكفاءة الكشف عن التألق ، يجب أن يكون معدل الإصابة 10-30٪. إضافة 0.1 ميكرولتر أو 0.2 ميكرولتر من الفيروس المركز الفلورسنت يمكن أن يحافظ على كفاءة العدوى ضمن هذا النطاق. يمكن أن يصل عيار الفيروسات المركز إلى 1 × 108 وحدات تحويل (TU) / مل على الأقل. - بعد حوالي 48 ساعة من الإصابة ، اغسل الطبق ب 1 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الخلايا الميتة.
- التربسين هذه الخلايا باستخدام 250 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين-EDTA لكل بئر في لوحة من 6 آبار لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ثم قم بإزالة السوبرناتانت.
- أعد تعليق بيليه الخلية في 1 مل من PBS ، وأضف التعليق إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل ، واكتشف كفاءة العدوى في تألق الفيروس (بروتين الفلورسنت الأخضر ، GFP +) باستخدام قياس التدفق الخلوي.
- احسب عيار الفيروسات المركز باستخدام الصيغة التالية: 105 (حجم الخلية) × معدل الإصابة (GFP+٪)/حجم الفيروس المضاف (0.1 ميكرولتر أو 0.2 ميكرولتر).
2. إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية (الشكل 2A)
- قم بتغطية بئر واحد من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار بمحلول جيلاتين 1 مل من محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة. تأكد من تغطية البئر بالكامل بمحلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪. شفط محلول الجيلاتين 0.1٪ بعد الطلاء.
ملاحظة: تحضير محلول الجيلاتين 0.1٪ (100 مل) على النحو التالي: 0.1 غرام من مسحوق الجيلاتين يذوب في 100 مل من الماء فائق النقاء في زجاجة زجاجية معقمة ثم يتم تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن شهرين. - لوحة 5 × 104 MEFs في بئر واحد من لوحة 6 آبار مغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين (كما هو الحال في الخطوة 2.1)، وزرع هذه الخلايا مع وسط طبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
- بعد 24 ساعة ، تأكد من أن MEFs قد وصلت إلى التقاء 40-50٪. استبدل الوسط بالوسط العادي.
- في اليوم 0 ، أخرج الفيروس المركز من الفريزر وقم بإذابة الفيروس على الجليد. احسب حجم الفيروس المراد إضافته باستخدام eq. (1). أضف الفيروس المركز لعوامل النسخ الستة ، Mitf و Pax3 و Sox10 و Sox9 و Sox2 و Snai2 (انظر جدول المواد) إلى كل بئر وفقا للحجم المحسوب ، ثم أضف 4 ميكروغرام / مل من عامل النقل البوليمري الكاتيوني.
رقم الخلية (5 × 104) × 30 (تعدد العدوى، وزارة الداخلية)/عيار الفيروسات (1) - في اليوم الأول ، 8-12 ساعة بعد الإصابة ، قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على الفيروس واستبدله بوسط طبيعي طازج مع إضافة 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين لفحص خطوط الخلايا المصابة المستقرة.
- في اليوم 2 ، بعد 48 ساعة من الإصابة ، استبدل الوسط الفائق تدريجيا بوسيط إعادة البرمجة. أولا ، قم بتغيير 1/4th من إجمالي الحجم المتوسط ، وأضف 3 ميكرومتر CHIR99021.
- من اليوم 3 إلى اليوم 7 ، اعتمادا على حالة الخلايا ، قم بتغيير الوسيط عن طريق استبداله بنسبة أعلى من وسيط إعادة البرمجة (انظر الجدول 1) تدريجيا ، والتبديل إلى وسيط إعادة برمجة كامل في غضون 5 أيام.
ملاحظة: خلال هذه الفترة، يجب استخدام البيروميسين و CHIR99021 كل يوم. ستظهر العديد من الخلايا الميتة في اليوم الأول والثاني من تغيير وسيط إعادة البرمجة. هذا أمر طبيعي حيث تتكيف الخلايا تدريجيا مع التحول. لذلك ، يجب تغيير الوسط تدريجيا لضمان الانتشار الصحي للخلايا. - لتمرير الخلايا ، أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ من التربسين-EDTA لهضم الخلايا لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تطفو ~ 60٪ من الخلايا ، توقف عن الهضم عن طريق إضافة الوسط الطبيعي 2x حجم الإنزيم الهضمي. جمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم 15 مل ، وأجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة supernatant ، وإعادة تعليق بيليه الخلية مع وسط إعادة البرمجة ، ولوحة الخلايا في طبق معقم 60 ملم بكثافة 3 × 104 / سم2. استزرع هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 رطبة.
ملاحظة: من اليوم 8 إلى اليوم 21 ، يتم استزراع هذه الخلايا كل 3-5 أيام وزرعها في أطباق معقمة 60 مم للتوسع. يمكن استزراعها للوصول إلى المقطع 5 على الأقل.
3. التحسين لإعادة البرمجة المباشرة وتحديد الهوية
- فحص عوامل النسخ المحسنة
- كرر الخطوات 2.1-2.7، مما يقلل من أحد عوامل النسخ الستة في كل مرة. إصابة MEFs بالفيروس بمجموعات من خمسة عوامل نسخ.
- بعد سبعة أيام من الإصابة ، قم باستخراج الحمض النووي الريبي لهذه الخلايا16 ، وقم بتحليل مستويات التعبير عن جيناتها الصباغية باستخدام النسخ العكسي PCR (RT-PCR)17 لفحص عوامل النسخ ذات التأثير الأكبر على التحويل إلى الخلايا الصباغية عن طريق إزالتها واحدة تلو الأخرى (الشكل 3A).
- استخدم عوامل النسخ الثلاثة الأولى التي تؤثر على التحويل إلى الخلايا الصباغية لإصابة MEFs. كرر الخطوات 2.1-2.7.
ملاحظة: بعد سبعة أيام من الإصابة ، يجب أن تكون جينات الخلايا الصباغية قابلة للكشف في هذه الخلايا المتحولة (الشكل 3B). وترد في الجدول 3 معلومات تمهيدية لتوصيف iMels.
- تحديد الخلايا الصباغية المستحثة (iMels)
- استخدم تلطيخ التألق المناعي18 للتحقق من أن iMels تعبر عن بروتينات الخلايا الصباغية ، بما في ذلك TYRP-1 و DCT (الشكل 4A).
- تلطيخ 3,4-ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين (DOPA) خاص بالميلانين (الشكل 4B)
- تحضير 4 ٪ بارافورمالديهايد (10 مل) على النحو التالي: إذابة 0.4 غرام من مسحوق بارافورمالديهايد في 10 مل PBS. ضع المحلول في فرن على درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتعزيز الذوبان.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالمحلول عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن شهر واحد. - استزرع iMels في طبق 30 مم واغسل الطبق مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا. أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة ، واغسل الطبق 3 مرات باستخدام PBS.
- تحضير 0.1٪ محلول بقع DOPA (10 مل) قبل الاستخدام مباشرة عن طريق إذابة 0.01 غرام من مسحوق L-DOPA في 10 مل من PBS. ضع المحلول في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ؛ هزها عدة مرات لتعزيز الذوبان.
- أضف 1 مل من محلول تلطيخ DOPA الطازج بنسبة 0.1٪. تحضن في فرن على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2-5 ساعات. إذا لم تكن هناك جزيئات بنية سوداء ، فاستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أخرى ولكن ليس لمدة >5 ساعة. تحقق من العينات كل 30 دقيقة.
- اغسل الطبق 3 مرات باستخدام PBS لمدة 1 دقيقة في كل مرة. وصمة عار النواة مع 1 مل من محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة.
- للتخزين على المدى الطويل ، قم بتجفيف العينات باستخدام 95٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق ثم 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق. ختم الطبق مع الزيلين والبلسم محايد.
- تحضير 4 ٪ بارافورمالديهايد (10 مل) على النحو التالي: إذابة 0.4 غرام من مسحوق بارافورمالديهايد في 10 مل PBS. ضع المحلول في فرن على درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتعزيز الذوبان.
- تلطيخ ماسون فونتانا الخاص بالميلانين (الشكل 4B)
- طبق iMels في طبق 30 مم وإصلاح الخلايا مع 4 ٪ paraformaldehyde لمدة 20 دقيقة ؛ اغسل الطبق 3 مرات باستخدام PBS.
- أضف 1 مل من المحلول A (محلول الأمونيا الفضي) من مجموعة تلطيخ Masson-Fontana (انظر جدول المواد) ، وضع الطبق في صندوق مظلم ، وضع الصندوق المظلم في فرن عند 56 درجة مئوية لمدة 15-40 دقيقة.
ملاحظة: إذا لم تكن الجسيمات البنية والسوداء مرئية بعد 15 دقيقة في الفرن، فأعد العينات إلى الفرن الذي تبلغ درجة حرارته 56 درجة مئوية لمواصلة الحضانة ولكن ليس لمدة >40 دقيقة. يمكن إضافة بعض الماء إلى الصندوق المظلم لمنع الجفاف. - شفط المحلول A وغسل الطبق 5-6 مرات بالماء المقطر ، 1-2 دقيقة في كل مرة.
- أضف محلول 1 مل B (محلول hypo) من مجموعة تلطيخ Masson-Fontana ، واترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق.
- شفط المحلول B وغسل الطبق بماء الصنبور 3 مرات ، 1 دقيقة في كل مرة.
- أضف 1 مل من المحلول C (صبغة حمراء محايدة) من مجموعة تلطيخ Masson-Fontana ، واترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق.
- شفط المحلول C وغسل الطبق 3 مرات بالماء المقطر ، 1 دقيقة في كل مرة.
- أضف 1 مل من الإيثانول 100٪ للجفاف السريع ، واستنشق الإيثانول بعد 3 دقائق.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات الملطخة لفترة طويلة بعد ختمها بالزيلين والبلسم المحايد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتضمن هذه المقالة بروتوكولات نظام تغليف فيروس lentivirus المركز لإنتاج lentivirus من عوامل النسخ لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية وبروتوكولات لفحص عوامل النسخ وإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية من MEFs.
تم تقييم نجاح إنتاج فيروس lentivirus المركز من خلال ملاحظة شدة التألق ل GFP (الشكل 1A) أو عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 1B) بعد إصابة خلايا HEK-293T لمدة 48 ساعة بفيروس lentivirus غير المركز (1x) و lentivirus المركز (100x). وكان عيار الفيروس المركز 108 TU/mL أو أكثر، وهو مرتفع نسبيا (الشكل 1C).
يتم تحقيق إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية من خلال العدوى بعامل النسخ lentivirus والتحول باستخدام وسيط إعادة البرمجة الأمثل. ويبين الشكل 2 ألف مخطط توليد ال iMels من MEFs. يتغير مورفولوجيا الخلية تدريجيا أثناء إعادة البرمجة المباشرة. تصبح نقاط الاشتباك العصبي للخلايا ممدودة ، وتتضخم نوى الخلية. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا تتقدم في العمر تدريجيا بعد اليوم 20 ~ (~ 5 مقاطع) (الشكل 2B).
تمت إزالة عامل نسخ واحد في وقت واحد من المجموعة الأصلية المكونة من ستة عوامل نسخ (Mitf و Pax3 و Sox10 و Sox9 و Sox2 و Snai2) لتحديد عامل النسخ مع أكبر تأثير على إعادة البرمجة. أدت إزالة Mitf أو Pax3 أو Sox10 إلى إسكات التعبير عن جينات الخلايا الصباغية Tyr و Tyrp1 و Mlana (الشكل 3A) ، مما يشير إلى أن عوامل النسخ الثلاثة هذه كان لها أكبر تأثير على تحويل الخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية. كان التعبير عن جينات الخلايا الصباغية الناجمة عن إعادة البرمجة المباشرة بثلاثة عوامل نسخ أعلى من جميع عوامل النسخ الستة (الشكل 3B).
وأخيرا ، تم تحديد خصائص iMels التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النظام الأمثل لإعادة البرمجة المباشرة. تم الكشف عن التعبير عن علامات الخلايا الصباغية (TYR ، TYYP1) باستخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي (الشكل 4A). كما أظهرت طرق التلطيخ الخاصة بالميلانين ، بما في ذلك تلطيخ DOPA و Masson-Fontana ، نتائج إيجابية (الشكل 4B).
الشكل 1: إنتاج الفيروس المركز وتقدير العيار . (أ) شدة التألق ل GFP بعد إصابة خلايا HEK-293T بفيروس lentivirus غير المركز (1x) و lentivirus المركز (100x) (B) مقارنة معدلات الإصابة بفيروس lentivirus غير المركز (1x) و lentivirus المركز (100x) كما تم اكتشافه بواسطة قياس التدفق الخلوي. (ج) تقدير العيار للفيروس اللينتي المركز. أشرطة المقياس = 250 ميكرومتر. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. TU = وحدات التحويل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توليد iMels من MEFs. (أ) رسم تخطيطي لتوليد iMels. (ب) التغيرات في مورفولوجيا الخلايا أثناء التحويل من MEFs إلى iMels في إعادة البرمجة المباشرة في اليوم 0 واليوم 3 واليوم 10 واليوم 20+. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: iMels = الخلايا الصباغية المستحثة. MEFs = الخلايا الليفية الجنينية الفأر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: فحص عوامل النسخ المحسنة. (أ) qRT-PCR لمستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال ل Tyr و Tyrp1 و Mlana في الخلايا المحولة بخمسة عوامل نسخ (تمت إزالة أحد عوامل النسخ الستة الأصلية). يتم استخدام MEF + EV و MEF + 6F كتحكم سلبي وتحكم إيجابي ، على التوالي. يتم تطبيع تعبير mRNA إلى تعبير Gapdh . (ب) qRT-PCR من مستويات Tyr و Tyrp1 و Mlana mRNA في الخلايا المحولة مع عوامل النسخ الستة الأصلية ومع ثلاثة عوامل نسخ. يتم استخدام MEF و MEF + EV و MMC كعنصر تحكم فارغ وسلبي وتحكم إيجابي ، على التوالي. يتم تطبيع مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال إلى مستويات Gapdh . جميع القيم هي متوسط SD ± لثلاث تجارب مستقلة. وترد تسلسلات التمهيدي في الجدول 3. الاختصارات: qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي. MEF = الخلايا الليفية الجنينية الفأر; MEF + EV = الخلايا الليفية الجنينية الفأرية + ناقل فارغ ؛ MMC = الخلايا الصباغية الفأر. 6F = ستة عوامل نسخ تشمل Mitf و Pax3 و Sox10 و Sox9 و Sox2 و Snai2 ؛ 3F: ثلاثة عوامل نسخ تشمل Mitf و Pax3 و Sox10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحديد الوظيفي ل iMels. (أ) التلطيخ المناعي لعلامات الخلايا الصباغية (TYR ، TYYP1) في iMels. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. انظر جدول المواد لتخفيف الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة. (ب) تلطيخ ماسون فونتانا وتلطيخ DOPA. يتم استخدام MEF وخط خلية Melan-a كعنصر تحكم سلبي وتحكم إيجابي ، على التوالي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: iMels = الخلايا الصباغية المستحثة. DOPA = 3,4-ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين; MEF = الأرومة الليفية الجنينية الفأرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكونات | الجرعة (التركيز والحجم) | التركيز النهائي | |
| عادي متوسط (100 مل) | DMEM / ارتفاع الجلوكوز | 89 مل | |
| FBS معطل حراريا | 10 مل | ||
| المضادات الحيوية (القلم / العقدية) | 10000 يو/مل، 1 مل | 100 يو/مل | |
| إعادة برمجة متوسطة (100 مل) | RPMI-1640 | 88 مل | |
| FBS معطل حراريا | 10 مل | ||
| SCF البشري المؤتلف | 200 ميكروغرام/مل، 50 ميكرولتر | 100 نانوغرام/مل | |
| الإنسان المؤتلف bFGF | 4 ميكروغرام/مل، 250 ميكرولتر | 10 نانوغرام/مل | |
| الأنسولين البشري المؤتلف | 10 ملغم/مل، 50 ميكرولتر | 5 ميكروغرام/مل | |
| EDN3 الإنسان | 100 ميكرومتر، 100 ميكرولتر | 0.1 ميكرومتر | |
| سموم الكوليرا | 0.3 ملغم/مل، 0.56 ميكرولتر | 20 ظهرا | |
| فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (TPA) | 1 ملليمتر، 20 ميكرولتر | 200 نانومتر | |
| الهيدروكورتيزون | 100 ميكروغرام/مل، 500 ميكرولتر | 0.5 ميكروغرام/مل | |
| الادنين | 40 ملغم/مل، 60 ميكرولتر | 24 ميكروغرام/مل |
الجدول 1: مكونات الوسائط العادية وإعادة البرمجة.
| طبق ثقافي | كثافة البذر (الخلايا / الطبق) | متوسطة (مل) | نظام البلازميد | كاشف النقل (ميكرولتر) | ||
| البلازميد المستهدف (ميكروغرام) | PMD2. G (ميكروغرام) | PSPAX2 (ميكروغرام) | ||||
| 35 ملم | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 ملم | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 مم | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
الجدول 2: تفاصيل نظام التعبئة والتغليف lentivirus.
| RT-PCR الاشعال | |
| هدف | مجموعات التمهيدي |
| غابده | خط الهجوم: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| العكس: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| صور | خط الهجوم: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| العكس: ATGGGTGTTGACCTGTGTT | |
| Tyrp1 | إلى الأمام: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| العكس: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| ملانا | إلى الأمام: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| العكس: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
الجدول 3: معلومات تمهيدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد جودة الفيروس أمرا بالغ الأهمية لنجاح إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية في هذا البروتوكول. طريقة تعبئة وتركيز الفيروسات في هذا البروتوكول بسيطة وسهلة التكرار ولا تعتمد على أي كاشف مركز مساعد. يمكن اتباع هذا البروتوكول بنجاح في معظم المختبرات. لضمان جودة الفيروس المركز ، تحتاج النقاط التالية إلى اهتمام خاص. واحد هو حالة خلية HEK-293T. على الرغم من أن خلايا HEK-293T هي خلايا مخلدة ، إلا أن الخلايا المستخدمة لصنع الفيروس المركز يجب أن تكون خلايا سليمة في غضون 10 ممرات (يتناقص العيار مع مرور أعلى).
نقطة حرجة أخرى هي نسبة كاشف النقل (في هذه الحالة ، ليبوفيكتامين) المستخدم. نظرا لأن الخلايا تالفة بعد إضافة كاشف النقل ، يجب فحص نسبة الكاشف إلى البلازميدات بشكل متكرر لضمان الحالة المثلى للخلايا وجودة الفيروس. نسبة 2: 1 من كاشف النقل إلى البلازميدات هي الأنسب لخلايا HEK-293T لتعبئة الفيروس في هذا النظام. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب جميع الخطوات معالجة لطيفة طوال العملية. نظرا لأنه يمكن امتصاص جزيئات الفيروس بعد الطلاء ، مما يؤثر على عيار الفيروس ، فلا ينصح بطلاء الطبق بأي مصفوفة عند تعبئة الفيروس. نظرا لإمكانية انفصال HEK-293T ، يجب استبدال supernatant بعناية ، خاصة عند إضافة وسط طازج بعد جمع supernatant الفيروس بعد 24 ساعة. وتشمل بعض الاعتبارات الأخرى كثافة الخلايا، وطول وقت النقل، ومحتوى المصل في الوسط. هذه قضايا مهمة تؤثر على كفاءة النقل. الشروط المقدمة في هذا البروتوكول هي الأنسب ، بناء على النتائج التي تم الحصول عليها بعد العديد من التجارب المتكررة.
في عملية إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية ، من المهم النظر في حالة MEFs الخلية الأصلية وكثافة MEFs المستخدمة لإعادة البرمجة المباشرة. قبل البدء في إعادة البرمجة المباشرة ، يجب استزراع MEFs في أطباق زراعة الخلايا غير المطلية. وينبغي اختيار الخلايا في مرحلة الانتشار (التقاء 40-50 في المائة) لإعادة برمجتها مباشرة؛ تنخفض كفاءة العدوى مع زيادة كثافة الخلايا. يجب أن تكون الخلايا المعاد برمجتها مطلية بأطباق الثقافة المغلفة بالجيلاتين.
كما أن طول الفترة الزمنية اللازمة لإصابة الفيروس بالخلايا أمر بالغ الأهمية. وقت العدوى الطويل جدا سيضعف بقاء الخلايا على قيد الحياة ، في حين أن وقت العدوى القصير جدا سيقلل من الكفاءة. وتبين أن ثماني ساعات مناسبة للفيروس المركز ليصيب مركبات MEFs في هذا البروتوكول. النقطة الحرجة الأخيرة هي الطريقة الصحيحة لتغيير وسيط إعادة البرمجة. تحتاج MEFs إلى التكيف مع وسيط جديد. يجب فحص حالة الخلايا كل يوم ، ويجب تغيير الوسط بعناية وفقا لحالة الخلية. سيؤدي تغيير وسيط إعادة البرمجة بسرعة كبيرة إلى موت عدد كبير من الخلايا.
عند زراعة iMels وزراعتها الفرعية ، تكون كثافة مرور الخلايا أمرا بالغ الأهمية. تحتاج iMels إلى كثافة عالية نسبيا للحفاظ على النمو. يجب أن تكون نقاط الاشتباك العصبي للخلايا على اتصال مع بعضها البعض من أجل الانتشار الطبيعي لهذه الخلايا. إذا كانت الكثافة منخفضة جدا ، فقد تتوقف الخلايا عن التكاثر. هنا ، تم العثور على كثافة 3 × 104 / سم2 لتكون كثافة مرور مناسبة ل iMels. بعد 5 مقاطع ، تبدأ iMels في الشيخوخة (الشكل 2B) ؛ الميلانين أكثر نضجا في هذا الوقت ، ويمكن استخدام الخلايا الناتجة للتألق المناعي أو DOPA أو Masson-Fontana. يمكن استخدام الممرات السابقة للخلايا ل RT-PCR لأن التعبير عن الجينات سيتغير في مرحلة مبكرة نسبيا.
على الرغم من أن إعادة البرمجة المباشرة تتم دراستها على نطاق واسع ، إلا أن هناك القليل من الأبحاث حول إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية. استخدمت دراسات مختلفة عوامل نسخ مختلفة14,15 ، مما أدى إلى الكثير من الارتباك. يشرح هذا البروتوكول كيفية إنتاج فيروسات مركزة عالية الجودة وفحص العديد من عوامل النسخ لاختيار أهمها لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية. وقد استكمل الوسط بعوامل غذائية لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية في هذا البروتوكول (الجدول 2). أخيرا ، تم تحديد iMels الوظيفية بنجاح. يمكن لنظام إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية الواضح والمحسن أن يوفر استراتيجيات علاج جديدة لأمراض التصبغ مثل البهاق.
ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض القيود على التكنولوجيا المقدمة في هذه المقالة. أولا، من الصعب تقدير كفاءة هذا البروتوكول. يمكن دمج تحرير الجينات CRISPR-Cas9 مع هذا البروتوكول لضرب جينات الخلايا الصباغية ، مثل Tyr أو Tyrp-1 ، في الخلايا الأولية لمراقبة النسبة المئوية للخلايا المستحثة أثناء عملية إعادة البرمجة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يحمل نظام إدخال الفيروس lentivirus المستخدم في هذا البروتوكول خطر إعادة تركيب الجينات وطفرة الإدخال19. وفي المستقبل، يمكن استخدام أساليب إدخال أكثر كفاءة وأمانا، مثل ناقلات التعبير عن البروتين المؤتلف غير الفيروسي أو ناقلات الحمض النووي الريبوزي المرسال. التجربة في هذا البروتوكول لا تزال في مرحلة المختبر . الخطوة التالية هي إعادة برمجة الخلايا الصباغية مباشرة في الجسم الحي ، مما يتسبب في أن تصبح البشرة غير المصطبغة مصطبغة واستخدام نظام إعادة البرمجة المباشر لتصميم علاج فعال للبهاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070638 و 81770621) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
