Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62945
Automatic Translation
1, 1
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Summary

מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) הועסק כדי לדמיין בו זמנית את התמלילים עבור שני קולטנים מצמידי חלבון G וגורם שעתוק אחד בכל הקומפלקס הגנגליוני של העכבר הבוגר. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים vagal afferent.

Abstract

מחקר זה מתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) של הגרעינים וריד הצוואר-לולאה העכבר, עם דגש מיוחד על זיהוי הביטוי של קולטנים חלבון G (GPCRs). גרעיני וריד הצוואר-לולאה קבועים בפורמלין עובדו עם טכנולוגיית RNAscope כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של שני GPCRs מייצגים (קולטני cholecystokinin ו ghrelin) בשילוב עם גן סמן אחד של או לולאה (תיבת הומיאוbox דמוית זיווג 2b, Phox2b) או נוירונים מושבעים ורידיים (חלבון אצבע אבץ יחסי ציבור 12, Prdm12). גרעינים מסומנים צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבוע את דפוסי ההפצה והביטוי של התעתיקים הנ"ל. בקצרה, נוירונים afferent Phox2b נמצאו לבטא בשפע את קולטן cholecystokinin (Cck1r) אבל לא את קולטן גרלין (Ghsr). תת-קבוצה קטנה של נוירונים afferent Prdm12 נמצא גם להביע Ghsr ו / או Cck1r. אזהרות טכניות פוטנציאליות בעיצוב, עיבוד, ופרשנות של מולטיפלקס ISH נדונים. הגישה המתוארת במאמר זה עשויה לסייע למדענים ביצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים זרים vagal.

Introduction

גופי התאים של זרים vagal כלולים בגרעפי הצוואר, פטרוסאל ונודים1,2,3. האקסונים שלהם נוסעים יחד דרך כמה ענפים של עצב הוואגוס לשטחים קרניוקרוויים, בית החזה והבטן4,5,6,7. מן סופם הקרבי, afferents vagal יכול להגיב למגוון רחב של גירויים פיזיולוגיים ומזיקים8,9,10. עם זאת, ההתפלגות של מולקולות איתות וקולטנים המעורבים חישת vagal נשאר מאופיין בצורה גרועה. הסיבה לכך היא שגרעי הוואגל, למרות גודלם הקטן, מבטאים קשת רחבה של קולטנים, כולל מספר גדול של GPCRs8,11,12,13. יתר על כן, נוירונים afferent vagal הם הטרוגניים מטבעם ולהציג פרופילים מולקולריים ברורים14. כדי לסבך את העניין, הגרעינים הצוואריים, הפטרוסאליים והנודים מחוברים לעכבר, ובכך יוצרים מסה גנגליונית אחת. לבסוף, בתת קבוצה של בעלי חיים, גנגליון הנודים מחובר לגנגליון צוואר הרחם העליון האוהד15.

בעבר, חוקרים פנו אימונוהיסטוכימיה ללמוד את האיפור הנוירוכימי של נוירונים afferent vagal16,17,18. בעוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים מאומתים היא שימושית, התוצאות של מחקרים אימונוהיסטוכימיים חייבים להתפרש בזהירות. לדוגמה, מאמצים רבים לזהות נוגדנים ספציפיים נגד GPCRs נכשלו19,20,21,22,23,24,25, מוביל חוקרים למסקנה כי רוב הנוגדנים נגד GPCRs אינם אמינים. כדי לעקוף בעיות אלה, PCR כמותי (qPCR) שימש נרחב להערכת ביטוי גנים במסה גנגל גנגליוני מכרסם26,27,28,29. עם זאת, בחינת ביטוי גנים באמצעות qPCR מתרחשת במחיר של אובדן מידע מרחבי. בפרט, לא ניתן לחזות כמה תאים או אילו סוגי תאים מבטאים גן מסוים של עניין (למשל, לולאה לעומת תאי הצוואר). בעיות חוזרות ונשנות כוללות גם את הזיהום עם רקמות סמוכות ואת הכללת אורכים משתנים של עצב vagus, גרעיני צוואר הרחם מעולה, וגרעיני הצוואר במהלך ניתוח15. כתוצאה מהקשיים הנ"ל, המחלוקת מקיפה את הביטוי וההפצה של מספר GPCRs בנוירונים זרים vagal. דוגמה תמוהה במיוחד מתייחסת לקולטן הגרלין (Ghsr). בעוד כמה מחקרים מצאו ביטוי נרחב של קולטן זה נוירונים afferent vagal30,31,32, אחרים מצאו Ghsr mRNA להיות כמעט בלתי ניתן לגילוי בגנגליון הנודים11,14. מיפוי מפורט של Ghsr mRNA במסה גנגליוני הוא אפוא מוצדק.

בהכלאה במקום (ISH) שימש גם להערכת דפוסי ביטוי גנים במסה הגנגלית הוואגליונית7,11,12,33,34,35. מכיוון שטכניקות מבוססות RNA נשארות אמינות וספציפיות יותר מאשר טכניקות מבוססות נוגדנים ברובהנסיבות 36,37, מחקרי ISH הוכיחו ערך להבנה טובה יותר של הקידוד הנוירוכימי של נוירונים עבים. עם זאת, טכניקות ISH המסורתיות עצמן אינן נטולות אזהרות. ISH רדיואקטיבי הוא רגיש אבל מייצר רקע ונשאר מסורבל38. ISH לא רדיואקטיבי הוא פחות מסובך אבל גם פחות רגיש38. לעומת זאת, שיטת RNAscope ISH שפותחה לאחרונה רגישה מאוד ומייצרת רקע מינימלי39. המחקר הנוכחי יישם מולטיפלקס פלואורסצנטי RNAscope לגילוי של GPCRs נוירונים afferent vagal של העכבר. התמקדנו במיפוי ההתפלגות של Ghsr והשווינו את תפוצתו לזו של קולטן cholecystokinin (Cck1r), GPCR אחר ידוע לבוא לידי ביטוי גנגליון הנודים34. לבסוף, שני גורמי שעתוק, הומיאובוקס 2b (Phox2b) וחלבון אצבע אבץ 12 (Prdm12), שימשו כסמנים סלקטיביים לנוירונים נודים ורידים, בהתאמה14. מבלי לדמיין Phox2b או Prdm12, זה יהיה מאתגר לזהות וריד לעומת נודים afferents בוודאות. מלכודות טכניות פוטנציאליות נדונות גם לאורך המאמר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: עכברים המשמשים במחקר זה היו זכרים מסוג בר על רקע C57BL / 6J טהור. בסך הכל 4 עכברים שימשו מולטיפלקס ISH. כל העכברים היו בערך בני 8 שבועות בזמן ההקרבה. עכבר זכר אחד (בערך בן שנה) שימש גם להדגמת פלואורסצנטיות אנדוגני הקשורה להזדקנות. בעלי חיים שוכנו בכלובים מאווררים בתוך מתקן מחסום עם גישה למזון ומים. הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי UT Southwestern בחנה ואישרה את הנהלים המתוארים להלן. פרטים על ריאגנטים וכלים ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. אוסף דוגמאות

  1. ביום ההקרבה, לתת מנת יתר של הידרציה כלורל (500 מ"ג/ק"ג, i.p.) לעכברים. לחדיר את העכברים מרדים עמוק באופן transcardially באמצעות משאבה peristaltic עם 5 מ"ל של 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ואחריו 50 מ"ל של 10% פורמלין בטמפרטורת החדר.
    הערה: זה נעשה במכסה אדים כדי למנוע שאיפת פורמלין.
  2. כמו להנהון, פטרוסאלי, הגרעינים הצוואר מותכים ליצור מסה גנגליונית אחת בעכבר15, בזהירות לאסוף את כל המסה הגנגליונית vagal מכל צד (שמאל וימין) בעזרת היקף ניתוח ומספריים קפיציים עדינים ומלקחיים (ראה טבלת החומרים).
  3. בעת עריפת ראש העכבר עם זוג מספריים גדולים (ראה טבלת החומרים),הימנעו מריסוק גזע המוח.
  4. בעקבות גישת ניתוח שתוארה בעבר בחולדה40, להסיר את שרירי עצם החזה ו omohyoid לרוחב קנה הנשימה עם מלקחיים קטנים (שולחן החומרים) כדי לחשוף את עצם העורף. נקה את כל האזור של שריר, רקמת שומן, ורקמת הלחמית עד העורק הראשי, עצב vagus, העצב hypoglossal, מגנום foramen נראים. חותכים את כל העצב ההיפוגלוסאלי עם מספריים קפיציים קטנים(שולחן החומרים).
  5. חפשו את גנגליון הנודן כמסה שקופה קרוב למגנוםפורם 15. באמצעות מספריים קטנים (שולחן החומרים),בזהירות לשבור את העצם העורפית כדי לחשוף עוד יותר את גנגליון הצוואר. חפש מלנוציטים שחורים על פני השטח של וריד הצוואר כציון דרך חזותי.
  6. לחתוך חיבורים עצביים בין המסה הגנגלית vagal ולחלץ את כל המסה הגנגליונית על ידי משיכה בעדינות על הקצה ההיקפי של עצב vagus ובו זמנית חיתוך גנגליון הצוואר לכיוון גזע המוח עם מספריים קפיץ קטן(שולחן החומרים).
  7. הסר את רקמת הלחמית ואת השומן דבק עצב vagus ומסה גנגליונית ככל האפשר.
  8. כפי שקל לאבד גנגליון אחד במהלך ההעברה מצינור אחד לשני, לשמור ~ 0.5 ס"מ של עצב vagus כדי להקל על טיפול ולוקליזציה של דגימות.
  9. מניחים גרעינים בעזרת מלקחיים עדינים בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ודגרה ב 4 °C (5 °F) בפורמלין במשך 24 שעות ועם 30% סוכרוז עוד 24 שעות.
  10. מקם גרעינים בתוך טיפה קטנה (~ 4 מ"מ Ø) של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינוני על פיסת רדיד אלומיניום. לאחר מכן, להקפיא את הדגימה על מצע של קרח יבש.
  11. לחתוך את הדגימות עם cryostat ב -20 °C לחלקים של עובי 14 מיקרומטר ולאסוף על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כמו 3 סדרה 42 מיקרומטר זה מזה.
    הערה: הימנעו מהצבת מקטעים קרובים לשולי השקופית. כדי להציל ריאגנטים, לשמור על קטעי הרקמה ארוזים היטב ככל האפשר, אך ללא חפיפה.
  12. לאחסן את הדגימות במקפיא -80 °C עד הצורך עבור ISH במשך 6 חודשים לפחות.
    הערה: עיין באיור 1 לפתרון בעיות עבור פלואורסצנטיות אנדוגנית.

2. טיפול מקדים ו-ISH

  1. לפני יום הניסויים, כלי זכוכית מעבדה autoclave לשמש ISH, כולל כלים מכתימים וצנצנות חוצץ כביסה.
    הערה: בעוד עבודה בתנאים ללא RNase אינה קריטית, ללבוש כפפות בכל עת. שמור RNase בקבוקי פתרון טיהור (שולחן החומרים) בהישג יד במקרה זיהום חשוד.
  2. ביום הראשון, להביא את השקופיות לטמפרטורת החדר על ספסל המוקדש במיוחד ISH. שוטפים את השקופיות ב-1x PBS ואופים אותן במשך 30 דקות ב-60 מעלות צלזיוס בתנור אפייה(שולחן חומרים).
  3. לאחר לתקן את השקופיות ב 4% פורמלין במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
  4. הביאו את ריאגנטים בערכת מולטיפלקס(שולחן החומרים)לטמפרטורת החדר.
  5. ייבשו את השקופיות ב-50%, 70% ו-100% אתנול למשך 5 דקות כל אחת. יש למרוח את תמיסת H2O2 על הדגימות למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים כפולים (ddH2O).
  6. לטפל בדגימות עם ריאגנט אחזור היעד במשך 5 דקות, לשטוף ddH2O ואחריו 100% אתנול, ואוויר יבש. באמצעות עט הידרופובי, ליצור מחסום סביב הדגימות.
    הערה: אין להחיל את המחסום ההידרופובי קרוב מדי לחלקי הרקמה.
  7. החל פרוטאז במשך 30 דקות ב 40 °C (40 °C) בתנור הכלאה(שולחן החומרים).
  8. בינתיים, לפני המלחמה של הבדיקות ב 40 °C (50 °F) ולקרר אותם בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לדגור את השקופיות עם השילוב הרצוי של בדיקות היעד (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; או Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) למשך 2 שעות ב-40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה.
  9. דגירה רקמת שליטה שלילית עם דיהידרודיפיקולינט רדוקטאז (DapB) יעד C1 בדיקה עבור 2 שעות ב 40 °C (50 °F) בתנור הכלאה.
  10. יש לשטוף את השקופיות במאגר הכביסה ולאחסן למשך הלילה ב-5x תמיסת מלח נתרן סיטראט (SSC) בטמפרטורת החדר. לנוחות, לפצל את הניסוי ליומיים. למחרת, לשטוף את השקופיות עם חוצץ לשטוף ולדגירה אותם עם ריאגנטים הגברה המפורטים להלן (ראה מדריך למשתמש בטבלת החומרים).
  11. החל AMP1 (30 דקות ב 40 °C ),AMP2 (30 דקות ב 40 °C (70 °F), ו AMP 3 (15 דקות ב 40 °C (50 °F). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  12. להמיס כל צבע אופל (שולחן החומרים) דימתיל גופרתית ולאחסן את הפתרונות ב 4 °C (50 °F) עד הצורך.
  13. עבור ערוץ 1, לדגור את השקופיות עם HRP-C1 (15 דקות ב 40 °C) ואופל 520 (צבע ירוק; דילול 1/1,500; 30 דקות ב 40 °C). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  14. עבור ערוץ 2, לדגור את השקופיות עם HRP-C2 (15 דקות ב 40 °C (570° C) ואופל 570 (צבע צהוב; דילול 1/1,500; במשך 30 דקות ב 40 °C (50 °F). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  15. עבור ערוץ 3, לדגור על השקופיות עם HRP-C3 (15 דקות ב 40 °C (40 °C) ואופל 690 (צבע אדום רחוק; דילול 1/1,500; במשך 30 דקות ב 40 °C (40 °C). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  16. לשטוף את השקופיות ולחשוף אותם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) עבור 30 s.
  17. יש למרוח מיד על כל שקופית ולהניח כיסוי על מקטע הרקמה.
  18. שמור את הרקמות אופקיות במחזיק שקופית ב 4 °C (5 °F) עד הדמיה.

3. מיקרוסקופיה וניתוח נתונים

הערה: ניתן לדמיין נתוני מולטיפלקס ISH עם מגוון רחב של מכשירים עם המסננים המתאימים. עם זאת, שיטת הדמיה מועדפת היא מיקרוסקופיה קונפוקלית עם מטרות 20x ו 63x (שמן); עיין בדיון מהסיבות. עיין באיור 2 לקביעת יחס האות לרעש האופטימלי.

  1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בקווי לייזר 488, 561 ו- 633 ננומטר. השתמש בפרמטרים הבאים רכישה (ראה טבלה 1): אופל 690 (HeNe 633 ננומטר, טווח זיהוי 668-696 ננומטר, כוח 2.0, רווח 724); אופל 570 (לייזר DPSS 561 ננומטר, טווח זיהוי 579-627 ננומטר, <כוח 15.0, <גיין 450); אופל 520 (לייזר ארגון 488 ננומטר, טווח זיהוי 499-535 ננומטר, <כוח 6.0, <גיין 830); DAPI (לייזר דיודה 405, טווח זיהוי 415-502 ננומטר, < כוח 12.0, <גיין 532).
  2. כדי לשפר את איכות התמונות, רכש עם קו בממוצע של 4 וגודל פיקסלים של לפחות 1024 x 1024.
    הערה: הפרמטרים לעיל מסופקים רק כדוגמה, ושינויים מומלצים בהתאם למכשיר אחד, הגדלה (20x או 63x), רמות ביטוי ורמות אנדוגניות של פלואורסצנטיות עבור כל רקמה נתונה.
  3. לאחר סיפוק הפרמטרים הרכישה, לאסוף תמונות באמצעות אותן הגדרות. ייחס צבעים כוזבים לכל ערוץ כדי להקל על הפריט החזותי.
    הערה: לדוגמה, אדום (Phox2b או Prdm12), ציאן (Cck1r), צהוב (Ghsr) ואפור (DAPI).
  4. בצע ספירת תאים באמצעות התמונות הדיגיטליות על-ידי זיהוי קווי המתאר של פרופילים חיוביים ל- RNAscope עם גרעין אחד מוכתם קלות ב- DAPI. חשב את אחוז הפרופילים החיוביים ל- RNAscope המבטאים כל תעתיק [איור 3A-C].
  5. כדי לשפר את ההקפדה והדיוק של האומדנים, לספור לפחות 2,000 פרופילים עצביים מלפחות 4 בעלי חיים שונים. בצע ספירה מגנעים שמאל וימין בנפרד.
  6. הזן את הנתונים בתרשים עוגה עם המספר הכולל של פרופילים שנספרו.
  7. השתמש בתוכנת הדמיה כדי להשיג תמונות ולתפור יחד תמונות 20x. השתמש ImageJ-פיג'י ותוכנה אחרת תמונה ועיצוב כדי ליצור את הלוחות הסופיים. יש למרוח התאמות על ניגודיות וקלילות באופן אחיד על כל התמונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעוד RNAScope יכול להיות מיושם על בעלי חיים בכל גיל, מין, או רקע גנטי, מומלץ לעבוד עם מבוגרים צעירים (<3 חודשים). הסיבה לכך היא כי ממצאים פלואורסצנטיים (למשל, lipofuscin) הם ממצאים נפוצים נוירונים של בעלי חיים מבוגרים41. הגרעינים הקבועים בפורמלין מעכברים מבוגרים מכילים לעתים קרובות פלואורסצנטיות אנדוגנית אינטנסיבית באופן מפתיע, שניתן לטעות בה בקלות בהכתמה אמיתית(איור 1A,B). בכל מקרה, מומלץ לאמת את רמות הפלואורסצנטיות האנדוגנית ברקמה לפני העיבוד.

חשוב לקבוע פרמטרי רכישה אופטימליים ויחס אות לרעש עבור כל לייזר והגדלה באמצעות מקטעים מרקמת בקרה שלילית המודגרת עם הגשוש השלילי DapB כפי שמוצג באיור 2A,B. מכיוון ש- DapB הוא גן פרוקריוטי, אותות RNAscope צריכים להיעדר לחלוטין מרקמת השליטה השלילית. מלבד פסולת וגבישים מזדמנים, פלואורסצנטיות זניחה נראית בתמונות מרקמות בקרה שליליות, בתנאי פרמטרים הרכישה משמשים מתאימים. עם זאת, מעל כוח ורווח מסוימים בלייזר, רקע לא רצוי ונקודות פלואורסצנטיות אקראיות מתחילים להופיע(איור 2C). מטרה נוספת של מזעור כוח הלייזר היא להימנע מרוויה פיקסלים והלבנת תמונות. לא נצפו בעיות עיקריות של הלבנת פלואורסצנטיות בעת עבודה עם הפרמטרים לעיל. אם בעיה כזו עלולה להתעורר, מומלץ לכסות את הרקמה עם מדיום הרכבה עבור תאים מתויגים פלואורסצנטית (טבלה של חומרים) בנוסף להורדת כוח הלייזר ככל האפשר (ראה את הפרמטרים המומלצים בטבלה 1).

טכניקת RNAscope הוחלה לגילוי 3 גנים בקטעי רקמות של המסה הגנגלית הוואגליונית של העכבר (איור 3 ואיור 4). פרופיל אחד נחשב חיובי עבור Ghsr ו / או Cck1r כאשר נקודות צהובות ו / או ציאן, בהתאמה, נראו מעל פרופיל אחד מלא נקודות אדומות (איור 3A-C). הדוגמה שניתנה באיור 3 מציגה פרופילים רבים המכילים תמלילי Phox2b ו- Cck1r (איור 3D). Phox2b שימש לזיהוי נוירונים זרים. שפע אותות Phox2b שהצטברו בתאי העצב של גנגליון הנודים(איור 4A,B). אותות Cck1r התגלו בכ-52% מתאי Phox2b(איור 4C). שימו לב, רמות הביטוי של Cck1r השתנו מאוד בין תאים, החל ממתון (כ-20 נקודות לפרופיל) ועד לתיוג אינטנסיבי (ציטופלסמה מלאה). לעומת זאת, האותות עבור Ghsr היו דלילים מאוד בגנגליון הנודים(איור 4A,B). רק כ-0.65% מהתאים החיוביים ל-Phox2b היו חיוביים גם הם לתמלילי Ghsr (איור 4C). תאים המביעים ר'סר לעתים קרובות מבטאים במשותף את Cck1r. סקר חזותי של הרקמות לא חשף הבדלים ברורים בין הגרעינים השמאליים והימנים. אותות ISH נעדרו כמעט מאזורים נטולי נוירונים (למשל, אפינוריום ודרכי סיבים).

Prdm12 שימש לזיהוי נוירונים ורידים. כצפוי, ביטוי Prdm12 היה מועשר מאוד בתאי העצב של גנגליון הצוואר וכמה נוירונים הסתננו לחלק הרוסטרל של גנגליון הנודים(איור 5A-C). באופן מעניין, אותות Cck1r זוהו בתת-קבוצה של תאי Prdm12(איור 5B,C). מעט פחות מ-9% מהנוירונים החיוביים של Prdm12 הביעו גם הם Cck1r(איור 5D). עם זאת, גנגליון הצוואר מכיל רק תאים עם רמות מתונות של Cck1r (<20 נקודות לתאים) ולא את התאים Cck1r-חיוביים שכותרתו גבוהה נמצא בדרך כלל גנגליון הנודים. תאים חיוביים ל-Ghsr היו נפוצים יותר באופן משמעותי בווריד הצוואר מאשר בחבל הנוגדים(איור 5C). כ-3% מתאי Prdm12 היו גם הם GHSR-חיוביים(איור 5D). מעניין, 1% מכלל Prdm12 שיתוף ביטא הן Ghsr ו Cck1r. רמות הביטוי עבור Ghsr היו תמיד מתונים (<20 נקודות לתא). לא ניתן היה לראות אותות ISH באזורים נטולי נוירונים.

Figure 1
איור 1: פתרון בעיות של פלואורסצנטיות אנדוגנית. (A, B) פלואורסצנטיות אנדוגנית בגנגליון הנודים/וריד הצוואר של עכבר מזדקן אחד (~1 בן שנה). תמונות דיגיטליות נרכשו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות קווי הלייזר המצוינים בצבעים ובפרמטרים לרכישה זהים לאלה המשמשים ל- ISH מולטיפלקס עם עכברים צעירים יותר (ראה מאוחר יותר). חשוב לציין, הרקמה הקבועה לא עובדה בשום דרך אחרת מאשר להיות מאוחסן ב -80 °C (50 °F) ונחשף DAPI. כפי שמוצג ב- A, רמה משמעותית של פלואורסצנטיות לא רצויה נצפתה בתאים עצביים ולא עצביים, במיוחד כאשר נחשפים ללייזר 488 ננומטר (ירוק). זהו ממצא נפוץ בהיסתולוגיה, המצדיק הערכת פלואורסצנטיות אנדוגנית לפני ניתוח היסתולוגי. (B)בהגדלה גבוהה יותר, פלואורסצנטיות דמתה לפיגמנטים ליפופוסין המצטברים לעתים קרובות בתאים מזדקנים ויכולים בקלות לטעות לגבי אותות חיסוניים ו/או RNAScope אמיתיים. סרגלי קנה מידה = 158 מיקרומטר(A)ו- 15 מיקרומטר(B). (B). קיצורים: DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; NG = גנגליון הנוי; ISH = בהכלאה במקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: קביעת יחס אות לרעש אופטימלי. (A, B)שליטה שלילית המורכבת מזיהוי RNAScope עבור הגן הפרוקריוטי DapB. שים לב כי פלואורסצנטיות אנדוגני בגנגליון הנודים של עכבר צעיר הוא מינימלי, וכי דגירה עם בדיקה DapB לא לגרום אותות. פרמטרי הרכישה היו זהים לאלה ששימשו עבור מולטיפלקס ISH. הדבר מראה כי הליך RNAScope עצמו אינו מייצר רקע משמעותי אם פרמטרי הרכישה נבחרים בקפידה. (C)תמונות דיגיטליות של אותה רקמה שנרכשו בלייזר כוח גוברות ורווח עם לייזר 488 ננומטר. שים לב כיצד כמה רקע ירוק מטושטש ונקודות מדי פעם להתעורר מעל כוח לייזר מסוים ולהשיג. לכן, חשוב לבחור בקפידה פרמטרי רכישה עבור כל לייזר בהתבסס על כמות הפלואורסצנטיות הלא מוגדרת המתקבלת ברקמת הבקרה השלילית. סרגלי קנה מידה = 158 מיקרומטר(A)ו- 15 מיקרומטר (B, C). קיצורים: DapB = דיהידרודיפיקולינט רדוקטאז; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; NG = גנגליון הנוי; ISH = בהכלאה במקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי וספירה של פרופילים חיוביים. (A)תמונה דיגיטלית מייצגת של פרופילים המסומנים ב- Phox2b (אדום) בחלק הרוטאלי של גנגליון ההחמה. בדוגמה זו זוהו בסך הכל 18 פרופילים סלולריים (המסומנים כ- 1 עד 18). שים לב כי כתמי DAPI מסייעים עוד יותר לוקליזציה של נוירונים, אשר בדרך כלל הציג גרעין גדול ועגול עם כתם DAPI בהיר. לעומת זאת, הגרעינים של תאים שאינם תאי עצב מסומנים בצורה בהירה, מוארכים וקטנים יותר בגודלם. בסך הכל, אותות ה- RNAScope התאימו להפצה ולצורה של תאים עצביים ולא לא עצביים. (B)שני נוירונים בעלי תווית של Ghsr חיובי (צהוב) מוצגים (פרופילים 19 ו -20). אותות Ghsr היו דלילים וקשה לראות. לכן, הבהירות והרוויה של האותות הצהובים שופרו באופן סלקטיבי ואחיד בתוכנת צילום. (C)מזוהים בסך הכל תשעה פרופילים המסומנים בתווית Cck1r (ציאן) (המסומנים כ- 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 ו- 19). שים לב כיצד עוצמת האותות Cck1r השתנתה מאוד בין תאים. לדוגמה, פרופיל 11 מכיל רק כמה אותות חיוביים, בעוד שפרופיל 7 כמעט מלא באותות Cck1r. (D)תצוגה ממוזגת של כל הערוצים אפשרה זיהוי של דפוסי colocalization. פרופילים חיוביים רבים של Phox2b גם הביעו את Cck1r (למשל, פרופילים 2, 8 ו-14), כפי שמעידות נקודות RNAScope אדומות וציאן באותו פרופיל סלולרי. לעומת זאת, פרופילים חיוביים של Phox2b לא הביעו תמלילי ר"ג (פרופילים 19 ו-20). עם זאת, תא אחד חיובי Ghsr גם הביע רמות נמוכות של Cck1r (פרופיל 19). שני הגרעינים הגדולים מוכתמים DAPI המסומנים עם כוכבית לבנה תואמים ככל הנראה למיקום של נוירונים afferent שלילי Phox2b נטולי אותות RNAScope. בתוצאות הייצוגיות המתוארות להלן, נספרו לפחות 2,000 פרופילים עצביים מגושים גנגליאוניים שמאליים וימין מ-4 בעלי חיים שונים. סרגלי קנה מידה = 24 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; Phox2b = תיבת הומיאוbox 2b דמוית זיווג; Ghsr = קולטן גרלין; Cck1r = קולטן כולציסטוקינין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של מולטיפלקס ISH בנוירונים זרים. תמונות דיגיטליות של מסה גנגלית ייצוגית עם מולטיפלקס RNAscope עבור Phox2b, Cck1r ו- Ghsr. תמונות נרכשו עם המטרות 20x (A) ו 63x (B, C) של מיקרוסקופ קונפוקלי (Zeiss LSM880). ב- A, 20× מספר תמונות נתפרו יחד באמצעות תוכנת Zen והוציגו כערוצים לא מעורבים או ממוזגים. אותות Phox2b (אדום) שנצברו במיוחד בתאי עצב אמינים הממוקמים בגנגליון הנודים. כצפוי, אותות Cck1r (ציאן) תייגו באינטנסיביות נוירונים רבים, אך לא כולם, בגנגליון הנודים. בהגדלה נמוכה, תאים המבטאים רמות נמוכות של Cck1r או כל תאים עם אותות Ghsr (צהוב) לא ניתן היה לראות בקלות. DAPI (אפור) עזר לדמיין את הרקמה ולזהות נוירונים עבים ווגל עם גרעין גדול ומוכתם קלות. ההסתה הלבנה בתמונה הממוזגת תואמת למיקומי התמונה הכלולה להלן. (B)בהגדלה גבוהה, פרופילים חיוביים Phox2b (אדום) ניכרים. תאים רבים גם הביעו Cck1r אך ברמות שונות, החל בינוני עד גבוה מאוד. הפרופיל "1" הוא דוגמה של תא Phox2b שלילי עבור Cck1r ו Ghsr. פרופילים "2" ו "3" הם תאי Phox2b עם אותות Cck1r גבוהים ומתונים, בהתאמה. אותות מתונים עבור Ghsr (צהוב) נראו מדי פעם בגנגליון הנודד rostral אבל כמעט תמיד בתאים שלילי עבור Phox2b, כפי שמוצג עם פרופיל "4". מעניין, פרופיל "4" ביטא הן Ghsr ו Cck1r. כפי שניתן לראות באיור הבא, Ghsr היה נפוץ יותר בתאי Prdm12. (C)תרשים עוגה המסכם את ההערכות של אחוז תאי Phox2b (אדום) המבטאים במשותף את Ghsr (צהוב), Cck1r (ציאן) או שניהם (אפור). המספר הכולל של הפרופילים שנספרו מצוין לצד התרשים (n = 4 גרעינים שונים, שמאל וימין משולבים). התוצאות מכל צד אוגדו מכיוון שלא הבחינו בהבדלים. סרגלי קנה מידה = 158 מיקרומטר(A)ו- 15 מיקרומטר(B). קיצורים: DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; NG = גנגליון הנוי; JG = גנגליון וריד; ISH = בהכלאה במקום; Phox2b = תיבת הומיאוbox 2b דמוית זיווג; Ghsr = קולטן גרלין; Cck1r = קולטן כולציסטוקינין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות מייצגות של נוירונים א-ערעריים ורידיים מולטיפלקס ISH. תמונות דיגיטליות של מסה גנגלית וגליונית מייצגת המסומנת במולטיפלקס RNAscope Prdm12, Cck1r ו- Ghsr. תמונות נרכשו עם המטרות 20x (A) ו - 63x (B, C) של מיקרוסקופ קונפוקלי (Zeiss LSM880). ב- A, 20× מספר תמונות נתפרו יחד באמצעות תוכנת Zen והוציגו כערוצים לא מעורבים או ממוזגים. תמליל Prdm12 (אדום) שנצבר במיוחד בתאי עצב אמידים הממוקמים בגנגליון הצוואר ורק כמה נוירונים המסתננים לחלק הרוסטרל של גנגליון הנודים. אותות Cck1r (ציאן) שכותרתו באינטנסיביות גנגליון הנודים. בהגדלה נמוכה, תאים המבטאים רמות נמוכות של Cck1r או כל תאים עם אותות Ghsr (צהוב) לא ניתן היה לראות בקלות. DAPI (אפור) עזר לדמיין את הרקמה ולזהות נוירונים עבים ווגל עם גרעין גדול ומוכתם קלות. שני ההסתה הלבנה בתמונה הממוזגת תואמות למיקומים של התמונות הכלולות להלן. (B, ג) בהגדלה גבוהה, ניתן לתווג פרופילי תאים חיוביים Prdm12 (אדום). אותות מתונים עבור Cck1r זוהו גם בפרופילים "1" ו "2". פרופיל "3" מייצג את תאי Prdm12 שלילי עבור Cck1r או Ghsr. ב- C, אותות Ghsr (צהוב) נראים בפרופיל הייצוגי "4" אך לא ב- "5". (D)תרשים עוגה המסכם את ההערכות של אחוז תאי Prdm12 (אדום) המבטאים במשותף את Ghsr (צהוב), Cck1r (ציאן) או את שניהם (אפור). המספר הכולל של הפרופילים שנספרו מצוין לצד התרשים (n = 4 גרעינים שונים, שמאל וימין משולבים). התוצאות מכל צד אוגדו מכיוון שלא הבחינו בהבדלים. סרגלי קנה מידה = 158 מיקרומטר(A)ו- 15 מיקרומטר (B, C). קיצורים: DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; NG = גנגליון הנוי; JG = גנגליון וריד; ISH = בהכלאה במקום; Prdm12 = חלבון אצבע אבץ 12 דומיין יחסי ציבור; Phox2b = תיבת הומיאוbox 2b דמוית זיווג; Ghsr = קולטן גרלין; Cck1r = קולטן כולציסטוקינין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אופל קו לייזר טווח זיהוי כח לקבל ממוצע שורה גודל פיקסל
אופל 690 HeNe 633 ננומטר 668-696 ננומטר 2 724 4 1024 x 1024
אופל 570 לייזר DPSS 561 ננומטר 579-627 ננומטר 15 450 4 1024 x 1024
אופל 520 לייזר ארגון 488 ננומטר 499-535 ננומטר 6 830 4 1024 x 1024
DAPI דיודה לייזר 405 415-502 ננומטר 12 532 4 1024 x 1024

טבלה 1: פרמטרי רכישה. קיצור: DAPI = 4′,6-דימידינו-2-פנילינדול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה של ISH הומצאה בסוף שנות ה -6042. עם זאת, זה לא עד אמצע שנות השמונים כי זה הוחל על גילוי mRNAs במערכות העצבים המרכזיות והיקפות43,44. בהתחשב בהטרוגניות של מערכת העצבים ובעיות חוזרות ונשנות בנוגדנים, לוקליזציה של תעתיק מסוים ברמה התאית נותרה כלי שלא יסולא בפז. עם זאת, שיטות ISH המסורתיות נותרו מייגעות ורגישות במידה ניכרת. למרבה המזל, מחקר זה השתמש בהליך ISH רגיש מאוד בשם RNAscope, אשר בדרך כלל אינו מייצר רקע ומאפשר זיהוי של מספר תמלילים לידי ביטוי ברמות נמוכות45,46. באופן ספציפי, מולטיפלקס פלואורסצנטי RNAScope הוחל על זיהוי בו זמנית של תמלילי Ghsr ו- Cck1r. גורמי התמלול, Phox2b ו- Prdm12, שימשו עוד יותר כסמנים סלקטיביים להבחנה בין נוירונים נודים וריד הצוואר, בהתאמה. מבלי לדמיין Phox2b ו- Prdm12, יהיה מאתגר לזהות נוירונים ורידיים לעומת לולאה בוודאות. כפי שהוסבר לעיל, צעד קריטי אחד כולל טכניקת ניתוח עקבית ונכונה. בנוסף, אימות של פלואורסצנטיות אנדוגני הוא גם גורם חשוב כפי שהוא יכול בקלות להיות בטעות עבור אותות RNAScope. יתר על כן, הבחירה של פרמטרי רכישה מתאימים המבוססים על רקמת שליטה שלילית מומלץ מאוד. כפי שהוזכר קודם לכן, מיקרוסקופיה קונפוקלית היא שיטת ההדמיה המועדפת עם מטרות 20x ו 63x (שמן) כי 1) תמלילים לידי ביטוי ברמות נמוכות ו / או בתאים דלילים עשויים להיות מורגשים רק בהגדלה גבוהה. 2) מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת איסוף של מישור מוקד יחיד, וזה חשוב בהתחשב בכך ששני תאים זה על גבי זה עשויים להופיע בטעות כתא אחד כאשר הם התמונה על ידי אפיפלואורסצנטיות. 3) מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת גם פרמטרי רכישה סלקטיביים וגמישים יותר. פרמטרי הרכישה לעיל מסופקים רק כדוגמה, ושינויים מומלצים בהתאם למכשיר אחד, הגדלה (20x או 63x), רמות ביטוי ורמות אנדוגניות של פלואורסצנטיות עבור כל רקמה נתונה. הליך ההכתמה עצמו נשאר קרוב מאוד לזה של הפרוטוקול המומלץ עם התאמות קלות בלבד. ברור, הפרוטוקול המתואר כאן עשוי להיות מיושם על זיהוי של כל תמלילים, לא רק GPCRs. ההליך המתואר כאן הוא בכל זאת שימושי במיוחד בהתחשב בבעיות חוזרות ונשנות עם נוגדנים שהועלו נגד GPCRs24.

כפי שנדון בעבר15, גנגליון לולאת העכבר מחובר לפעמים גנגליון צוואר הרחם מעולה על ידי גשר תא. הכללתו של גשר תא זה עלולה להוביל לתוצאות מבלבלות, למשל, סמנים שאינם vagal להיות מזוהה גנגליון הנודים. החוקר עשוי לרצות לוודא באופן שיטתי אם גנגליון הנוד מחובר לגנגליון צוואר הרחם העליון במהלך הניתוח. אחרת, כישורי ניתוח לא עקביים בין גרעינים יציגו שונות ניסיונית. חשוב גם לציין כי הן נוירונים פטרוסאליים והן נוירונים נודים מבטאים Phox2b47. לכן, מה שאנו מכנים נוירונים afferent לולאה כללו הן נוירונים פטרוסלי ונודים. לבסוף, כאשר משווים מחקרים שונים, יש לזכור כי שיטות שונות של המתת חסד יכול לגרום לשינויים ביטויגנים 48.

בתיאוריה, הפלורופורים המשמשים לזיהוי יכולים להיות מיוחסים לסירוגין לכל ערוץ. עם זאת, אופל 690 נמצאה פולטת רמה נמוכה של פלואורסצנטיות ירוקה. ברוב הנסיבות, במקרה של תמלילים מבוטאים מאוד (למשל, Prdm12), פלואורסצנטיות ירוקה לא רצויה נראתה אם עוצמת הלייזר הייתה גבוהה מדי. אופל 690 מומלץ אפוא לגנים בעלי ביטוי מתון/נמוך. אם רק עובד עם גנים מבוטאים מאוד, מומלץ לדלל אופל 690 עוד יותר (כלומר, 1/3,000) ולא ללכוד פלואורסצנטיות ירוקה לא מוגדרת במהלך רכישת תמונה. אותות RNAscope הם נקודות נפרדות של צבעים שונים, גם כאשר תעתיקים באים לידי ביטוי באותו פרופיל תא. עם זאת, עבור תמלילים מבוטאים מאוד, ייתכן שלא ניתן יהיה לראות נקודות בודדות אלא פלואורסצנטיות הממלאת את הציטופלסמה. כאשר נקודות פולטת פלואורסצנטיות של צבעים שונים, אפשר לשקול בעיה של פלואורסצנטיות לא מוגדרת בשל, בין היתר, פרמטרי רכישה לקויים ו/או פיגמנטים אנדוגניים. לבסוף, אופל 570 ו 620 לא חייב לשמש בו זמנית כי ספקטרום הפליטה שלהם חופף.

אם לא נצפים אותות RNAscope עבור גן ידוע לבוא לידי ביטוי ברקמת העניין, מומלץ לאמת את שלמות הרקמה על ידי הפעלת בדיקה חיובית זמינה (כלומר, פפטידיל-פרוליל cis-טרנס איזומראז B גן משק בית). הנגד DAPI מסייע גם בקביעת איכות הרקמה. גרעינים המסומנים על ידי DAPI שנראים מגוררים עשויים להצביע על עיכול מוגזם או רקמה קבועה שלא כהלכה.

כתוצאה מכך, Ghsr בא לידי ביטוי בתת קבוצה קטנה של נוירונים וריד חיובי Prdm12 חיובי. לעומת זאת, ובהסכמה עם מחקר קודם אחד11, Ghsr mRNA נעדר כמעט מתאי עצב נודים. הוא הסיק כי רמות נמוכות של mRNA Ghsr זוהה בעבר על ידי qPCR ו ISH היו ככל הנראה בשל נוירונים afferent הצוואר30,31,32. מחקר קודם של איתות סידן הראה כי 3% מתאי העצב האגרנטיים הוואגליים המתורבתים מגיבים לגרלין49, מספר הדומה להפליא לאחוז הנוירונים האהיריים של גסר. Cck1r התבטאה בנוירונים רבים חיוביים לחבלות, ובאופן מפתיע יותר, בתת-קבוצה של נוירונים חיוביים ורידיים. לסיכום, מאמר זה מדגים את ההתאמה המוצלחת של טכניקות ISH קיימות להערכת ההתפלגות התאית של GPCRs נבחרים במסה הגנגליונית של וריד הצוואר-לולאה בשלמותה.

לסיכום, מולטיפלקס ISH שימש כדי לזהות בו זמנית לדמיין את התמלילים עבור שני GPCRs (Cck1r ו Ghsr) וגורם תמלול אחד (Phox2b או Prdm12) בכל הקומפלקס הגנגלי של העכבר הבוגר. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות כלי משלים לרצף RNA, qPCR וההטולוגיה המסורתית. עם זאת, פרוטוקול זה עשוי לחול על גרעינים אחרים בגודל דומה. כפי שנדון לעיל, פרמטרי רכישה, גיל בעלי חיים, ועקביות של ביתור הם גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון במהלך תכנון ניסיוני. לכן, הוא יכול להציע מידע ייחודי על דפוסי ביטוי הגן הטופוגרפי בגנגליון הטרוגני וקטן מאוד. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע שינויים בפרופילי התמלול של נוירונים וריד לעומת לולאה afferent בהקשר של תנאים פיזיולוגיים ופתופיציולוגיים שונים, כולל, אך לא רק, שינויים במצב האכלה. זה עשוי לשמש גם כדי להשוות את האיפור הנוירוכימי של נוירונים afferent vagal במינים של בעלי חיים נפוץ במחקר פרה-אקליני, כולל פרימטים וחזירים50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי נוירואנטומיה / היסתולוגיה / הליבה הזרקת המוח במימון מענק NIH #5P01DK119130-02. המחברים רוצים להכיר בסיוע של UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (בראשות ד"ר פלפס) וצוותו (אבהיג'יט באגדה ומרסל מאטלן), הנתמכים בחלקם על ידי מענק NIH #1S10OD021684-01, משאב משותף של מרכז הסרטן הרולד סי סימונס, הנתמך בחלקו על ידי מענק תמיכה במרכז הסרטן של NCI, P30 CA142543.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
20x SSC Invitrogen AM9763
-80°C freezer PHCBI MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021 Adobe photo and design software
Baking oven Thermo Scientific Model:658
Confocal microscope Zeiss LSM880 Airyscan
Cover glass Brain Research Laboratories 2460-1.5D
Cryostat Leica CM 3050 S
Dumont #5 Forceps F.S.T. 11252-20
Ecomount Biocare Medical EM 897L mounting medium
HybEZ oven hybridization oven
Hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
ImageJ-Fiji NIH
Large scissors Henry Schein 100-7561
Micro centrifuge tubes VWR 20170-333
Minipump variable flow Fisher Scientific 13-876-1
Opal 520 Akoya biosciences FP1 1487001KT Fluorescent biomarker
Opal 570 Akoya biosciences FP1 1488001KT Fluorescent biomarker
Opal 690 Akoya biosciences FP1 1497001KT Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACD /Bio-Techne 323100 multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 ACD /Bio-Techne 313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB ACD /Bio-Techne 310043
RNAscope probe Mouse Ghsr ACD /Bio-Techne 426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 ACD /Bio-Techne 407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 ACD /Bio-Techne 524371-C2
RnaseZap Sigma R2020 Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors Millipore Sigma Z265977
Superfrost Plus slides Fisherbrand 1255015
Tissue Tek OCT medium Sakura 4583
User manual ACD 323100 USM
Vannas Spring Scissors Roboz RS 5620
ZEN Imaging Software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).

Tags

מדעי המוח גיליון 175 נוירואנטומיה איתות היסטולוגיה שעתוק קולטני טרנסממברן מערכת העצבים ההיקפית ניתוח מיקרוסקופיה קונגוקלית פלואורסצנטיות
זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס <em>בהכלאה במקום</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bob-Manuel, J., Gautron, L.… More

Bob-Manuel, J., Gautron, L. Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (175), e62945, doi:10.3791/62945 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter