Summary
L'ibridazione multiplex in situ (ISH) è stata impiegata per visualizzare simultaneamente i trascritti per due recettori accoppiati a proteine G e un fattore di trascrizione nell'intero complesso gangliare vagale del topo adulto. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.
Abstract
Questo studio descrive un protocollo per l'ibridazione multiplex in situ (ISH) dei gangli giugulare-nodosi del topo, con particolare attenzione alla rilevazione dell'espressione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). I gangli giugulare-nodosi fissati in formalina sono stati elaborati con la tecnologia RNAscope per rilevare contemporaneamente l'espressione di due GPCR rappresentativi (colecistochinina e recettori della grelina) in combinazione con un gene marcatore di nodosi (omeobox 2b accoppiato, Phox2b) o neuroni afferenti giugulari (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). I gangli etichettati sono stati ripresi utilizzando la microscopia confocale per determinare i modelli di distribuzione ed espressione dei suddetti trascritti. In breve, i neuroni afferenti Phox2b sono stati trovati per esprimere abbondantemente il recettore colecistochinina (Cck1r) ma non il recettore della grelina (Ghsr). È stato anche scoperto che un piccolo sottoinsieme di neuroni afferenti Prdm12 esprime Ghsr e / o Cck1r. Vengono discussi potenziali avvertimenti tecnici nella progettazione, nell'elaborazione e nell'interpretazione dell'ISH multiplex. L'approccio descritto in questo articolo può aiutare gli scienziati a generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.
Introduction
I corpi cellulari delle afferenze vagali sono contenuti nei gangli giugulari, petrosali e nodosi1,2,3. I loro assoni viaggiano insieme attraverso diversi rami del nervo vago ai territori craniocervicale, toracico e addominale4,5,6,7. Dalle loro terminazioni viscerali, le afferenze vagali possono rispondere a una vasta gamma di stimoli fisiologici e nocivi8,9,10. Tuttavia, la distribuzione delle molecole di segnalazione e dei recettori coinvolti nel rilevamento vagale rimane scarsamente caratterizzata. Ciò è in parte dovuto al fatto che i gangli vagali, nonostante le loro piccole dimensioni, esprimono un ampio spettro di recettori, tra cui un gran numero di GPCR8,11,12,13. Inoltre, i neuroni afferenti vagali sono intrinsecamente eterogenei e mostrano profili molecolari distinti14. A complicare la questione, i gangli giugulari, petrosali e nodosi sono attaccati al topo, formando così una singola massa gangliare. Infine, in un sottogruppo di animali, il ganglio nodoso è attaccato al ganglio cervicale superiore simpatico15.
In passato, i ricercatori si sono rivolti all'immunoistochimica per studiare la composizione neurochimica dei neuroni afferenti vagali16,17,18. Mentre l'immunoistochimica che utilizza anticorpi convalidati è utile, i risultati degli studi immunoistochimici devono essere interpretati con cautela. Ad esempio, numerosi sforzi per identificare anticorpi specifici contro i GPCR hanno fallito19,20,21,22,23,24,25,portando gli investigatori a concludere che la maggior parte degli anticorpi contro i GPCR sono inaffidabili. Per aggirare questi problemi, la PCR quantitativa (qPCR) è stata ampiamente utilizzata per valutare l'espressione genica nel roditore vagale di massa gangliare26,27,28,29. Tuttavia, l'esame dell'espressione genica utilizzando la qPCR avviene al costo di una perdita di informazioni spaziali. In particolare, non è possibile prevedere quante cellule o quali tipi di cellule esprimono un particolare gene di interesse (ad esempio, nodosi vs cellule giugulari). I problemi ricorrenti includono anche la contaminazione con i tessuti adiacenti e l'inclusione di lunghezze variabili del nervo vago, gangli cervicali e giugulari superiori durante la dissezione15. Come risultato delle difficoltà di cui sopra, la controversia circonda l'espressione e la distribuzione di diversi GPCR nei neuroni afferenti vagali. Un esempio particolarmente sconcertante riguarda il recettore della grelina (Ghsr). Mentre alcuni studi hanno trovato un'espressione diffusa di questo recettore nei neuroni afferenti vagali30,31,32,altri hanno trovato l'mRNA di Ghsr quasi non rilevabile nel ganglio nodoso11,14. È quindi necessaria una mappatura dettagliata dell'mRNA di Ghsr nella massa gangliare vagale.
L'ibridazione in situ (ISH) è stata utilizzata anche per valutare i modelli di espressione genica nella massa gangliare vagale7,11, 12,33,34,35. Poiché le tecniche basate sull'RNA rimangono più affidabili e specifiche rispetto alle tecniche basate sugli anticorpi nella maggior parte delle circostanze36,37,gli studi ISH si sono dimostrati preziosi per una migliore comprensione della codifica neurochimica dei neuroni afferenti vagali. Tuttavia, le stesse tecniche ISH tradizionali non sono prive di avvertimenti. L'ISH radioattivo è sensibile ma genera sfondo e rimane ingombrante38. L'ISH non radioattivo è meno complicato ma anche meno sensibile38. Al contrario, il metodo RNAscope ISH recentemente sviluppato è altamente sensibile e genera uno sfondo minimo39. L'attuale studio ha applicato l'RNAscopio fluorescente multiplex al rilevamento di GPCR nei neuroni afferenti vagali del topo. Ci siamo concentrati sulla mappatura della distribuzione di Ghsr e abbiamo confrontato la sua distribuzione con quella del recettore colecistochinina (Cck1r), un altro GPCR ben noto per essere espresso nel ganglio nodoso34. Infine, i due fattori di trascrizione, l'omeobox 2b accoppiato (Phox2b) e la proteina 12 del dito di zinco del dominio PR (Prdm12), sono stati utilizzati come marcatori selettivi per i neuroni afferenti nodosi e giugulari, rispettivamente14. Senza visualizzare Phox2b o Prdm12, sarebbe difficile identificare con certezza le afferenze giugulari vs nodosi. Potenziali insidie tecniche sono anche discusse in tutto l'articolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: I topi utilizzati in questo studio erano maschi selvatici su uno sfondo C57BL / 6J puro. Un totale di 4 topi sono stati utilizzati per multiplex ISH. Tutti i topi avevano circa 8 settimane al momento del sacrificio. Un topo maschio (di circa un anno) è stato anche usato per dimostrare la fluorescenza endogena associata all'invecchiamento. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie ventilate all'interno di una struttura di barriera con accesso ad libitum a cibo e acqua. L'UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee ha esaminato e approvato le procedure descritte di seguito. I dettagli sui reagenti e gli strumenti sono disponibili nella Tabella dei materiali.
1. Raccolta dei campioni
- Il giorno del sacrificio, somministrare un sovradosaggio di idrato di cloralio (500 mg / kg, i.p.) ai topi. Perfondere i topi profondamente anestetizzati transcardialmente utilizzando una pompa peristaltica con 5 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) seguita da 50 ml di formalina al 10% a temperatura ambiente.
NOTA: Questo viene fatto in una cappa aspirante per prevenire l'inalazione di formalina. - Poiché i gangli nodosi, petrosali e giugulari sono fusi per formare un'unica massa gangliare nel topo15, raccogliere con cura l'intera massa ganglionica vagale da ciascun lato (sinistra e destra) con l'aiuto di un cannocchiale sezionante e forbici e pinze a molla fine (vedi la Tabella dei materiali).
- Quando si decapita il topo con un paio di grandi forbici (vedi la Tabella dei materiali),evitare di schiacciare il tronco cerebrale.
- Seguendo un approccio di dissezione descritto in precedenza nel ratto40,rimuovere i muscoli sternoioidi e omoioidi laterali alla trachea con piccole pinze(Tabella dei materiali)per esporre l'osso occipitale. Liberare l'intera regione di muscolo, tessuto adiposo e tessuto congiuntivo fino a quando l'arteria carotide, il nervo vago, il nervo ipoglosso e il forame magno sono visibili. Tagliare l'intero nervo ipoglosso con piccole forbici a molla (Tabella dei materiali).
- Cerca il ganglio nodoso come massa traslucida vicino al forame magnum15. Usando piccole forbici(Tabella dei materiali),rompere con cura l'osso occipitale per esporre ulteriormente il ganglio giugulare. Cerca i melanociti neri sulla superficie della giugulare come punto di riferimento visivo.
- Tagliare gli attacchi nervosi tra la massa gangliare vagale ed estrarre l'intera massa gangliare tirando delicatamente l'estremità periferica del nervo vago mentre contemporaneamente si taglia il ganglio giugulare verso il tronco cerebrale con piccole forbici a molla (Tabella dei materiali).
- Rimuovere il tessuto congiuntivo e il grasso che si attaccano il più possibile al nervo vago e alla massa gangliare.
- Poiché è facile perdere un ganglio durante il trasferimento da un tubo all'altro, mantenere ~ 0,5 cm del nervo vago per facilitare la manipolazione e la localizzazione dei campioni.
- Posizionare i gangli con l'aiuto di pinze fini in tubi microcentrifuga da 1,5 ml e incubare a 4 °C in formalina per 24 ore e con il 30% di saccarosio per altre 24 ore.
- Posizionare i gangli all'interno di una piccola goccia (~4 mm Ø) del mezzo a temperatura di taglio ottimale (OCT) su un pezzo di foglio di alluminio. Quindi, congelare il campione su un letto di ghiaccio secco.
- Tagliare i campioni con un criostato a -20 °C in sezioni di spessore 14 μm e raccoglierli su vetrini per microscopio in vetro come 3 serie a 42 μm di distanza.
NOTA: evitare di posizionare sezioni vicino ai bordi della diapositiva. Per risparmiare i reagenti, mantenere le sezioni di tessuto il più strettamente imballate possibile ma senza sovrapposizioni. - Conservare i campioni in un congelatore a -80 °C fino a quando non sarà necessario per ISH per almeno 6 mesi.
NOTA: fare riferimento alla Figura 1 per la risoluzione dei problemi relativi alla fluorescenza endogena.
2. Pretrattamento e ISH
- Prima del giorno degli esperimenti, vetreria da laboratorio in autoclave da utilizzare per ISH, compresi i piatti di colorazione e i barattoli tampone di lavaggio.
NOTA: mentre lavorare in condizioni di assenza di RNasi non è critico, indossare i guanti in ogni momento. Tenere le bottiglie di soluzionedidecontaminazione RNase ( Table of Materials ) a portata di mano nel caso in cui si sospetti una contaminazione. - Il primo giorno, portare le diapositive a temperatura ambiente su una panca appositamente dedicata all'ISH. Risciacquare i vetrini in 1x PBS e cuocerli per 30 minuti a 60 °C in un forno da forno (Tabella dei materiali).
- Post-fissare i vetrini in formalina al 4% per 15 minuti a 4 °C.
- Portare i reagenti nel kit multiplex (Table of Materials) a temperatura ambiente.
- Disidratare i vetrini in etanolo al 50%, 70% e 100% per 5 minuti ciascuno. Applicare lasoluzioneH 2 O2 sui campioni per 10 minuti e quindi risciacquare in acqua a doppia distillazione (ddH2O).
- Trattare i campioni con il reagente di recupero target per 5 minuti, risciacquare in ddH2O seguito da etanolo al 100% e asciugare all'aria. Usando una penna idrofoba, crea una barriera attorno ai campioni.
NOTA: Non applicare la barriera idrofobica troppo vicino alle sezioni di tessuto. - Applicare la proteasi per 30 min a 40 °C in un forno di ibridazione (Tabella dei materiali).
- Nel frattempo, preriscaldare le sonde a 40 °C e raffreddarle a temperatura ambiente prima dell'uso. Incubare i vetrini con la combinazione desiderata di sonde bersaglio (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; o Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) per 2 ore a 40 °C in un forno di ibridazione.
- Incubare il tessuto di controllo negativo con la sonda C1 bersaglio della diidrodipicolinato reduttasi (DapB) per 2 ore a 40 °C in un forno di ibridazione.
- Risciacquare i vetrini nel tampone di lavaggio e conservare durante la notte in 5x citrato salino di sodio (SSC) a temperatura ambiente. Per comodità, dividi l'esperimento in due giorni. Il giorno seguente, sciacquare i vetrini con tampone di lavaggio e incubarli con i reagenti di amplificazione elencati di seguito (vedere il manuale d'uso in Tabella dei materiali).
- Applicare AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) e AMP 3 (15 min a 40 °C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
- Sciogliere ogni colorante opale (Tabella dei materiali) in dimetilsolfossido e conservare le soluzioni a 4 °C fino a quando necessario.
- Per il canale 1, incubare i vetrini con HRP-C1 (15 min a 40 °C) e Opal 520 (colore verde; diluizione 1/1.500; 30 minuti a 40°C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
- Per il canale 2, incubare i vetrini con HRP-C2 (15 min a 40 °C) e Opal 570 (colore giallo; diluizione 1/1.500; per 30 min a 40 °C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
- Per il canale 3, incubare i vetrini con HRP-C3 (15 min a 40 °C) e Opal 690 (colore rosso lontano; diluizione 1/1.500; per 30 min a 40 °C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
- Lavare i vetrini ed esporli a 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 30 s.
- Applicare immediatamente il mezzo di montaggio su ogni diapositiva e posizionare una copertura sulla sezione del tessuto.
- Tenere i tessuti orizzontali in un supporto per vetrini a 4 °C fino all'imaging.
3. Microscopia e analisi dei dati
NOTA: i dati ISH multiplex possono essere ripresi con una vasta gamma di strumenti con i filtri appropriati. Tuttavia, un metodo di imaging preferito è la microscopia confocale con obiettivi 20x e 63x (olio); fare riferimento alla discussione per i motivi. Fare riferimento alla Figura 2 per la determinazione del rapporto segnale-rumore ottimale.
- Utilizzare un microscopio confocale dotato di linee laser 488, 561 e 633 nm. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione (vedi Tabella 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, campo di rilevamento 668-696 nm, potenza 2.0, guadagno 724); Opal 570 (laser DPSS 561 nm, campo di rilevamento 579-627 nm,
- Per migliorare la qualità delle immagini, acquisire con una linea media di 4 e una dimensione in pixel di almeno 1024 x 1024.
NOTA: i parametri di cui sopra sono forniti solo a titolo esemplificativo e le modifiche sono consigliate a seconda di uno strumento, ingrandimento (20x o 63x), livelli di espressione e livelli endogeni di fluorescenza per un dato tessuto.- Una volta soddisfatti dei parametri di acquisizione, raccogliere le immagini utilizzando le stesse impostazioni. Attribuire falsi colori a ciascun canale per facilitare la visualizzazione.
NOTA: ad esempio, rosso (Phox2b o Prdm12), ciano (Cck1r), giallo (Ghsr) e grigio (DAPI).- Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando le immagini digitali identificando il contorno dei profili positivi dell'RNAscopio con un nucleo leggermente macchiato con DAPI. Calcolare la percentuale di profili RNAscope-positivi che esprimono ogni trascrizione [Figura 3A-C].
- Per migliorare il rigore e l'accuratezza delle stime, contare almeno 2.000 profili neuronali di almeno 4 animali diversi. Eseguire il conteggio dai gangli sinistro e destro separatamente.
- Inserisci i dati in un grafico a torta con il numero totale di profili contati.
- Utilizza il software di imaging per acquisire immagini e cucire insieme immagini 20x. Usa ImageJ-Fiji e un altro software di foto e design per generare le lastre finali. Applica regolazioni uniformi al contrasto e alla luminosità a tutte le immagini.
- Per migliorare la qualità delle immagini, acquisire con una linea media di 4 e una dimensione in pixel di almeno 1024 x 1024.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mentre RNAScope può essere applicato ad animali di qualsiasi età, sesso o background genetico, è consigliabile lavorare con giovani adulti (<3 mesi). Questo perché gli artefatti fluorescenti (ad esempio, lipofuscina) sono risultati comuni nei neuroni di animali più anziani41. I gangli fissati in formalina dei topi più anziani contengono spesso una fluorescenza endogena sorprendentemente intensa che può essere facilmente scambiata per una colorazione genuina (Figura 1A,B). In ogni caso, è consigliabile verificare i livelli di fluorescenza endogena nel tessuto prima della lavorazione.
È importante determinare i parametri di acquisizione ottimali e il rapporto segnale-rumore per ogni laser e ingrandimento utilizzando sezioni di un tessuto di controllo negativo incubato con la sonda negativa DapB come mostrato in Figura 2A,B. Poiché DapB è un gene procariotico, i segnali dell'RNAscopio dovrebbero essere completamente assenti dal tessuto di controllo negativo. A parte detriti e cristalli occasionali, la fluorescenza trascurabile è vista nelle immagini provenienti da tessuti di controllo negativi, a condizione che i parametri di acquisizione utilizzati siano appropriati. Tuttavia, al di sopra di una certa potenza e guadagno laser, iniziano ad apparire sfondi indesiderati e punti fluorescenti casuali (Figura 2C). Un altro scopo per ridurre al minimo la potenza del laser è quello di evitare la saturazione dei pixel e il fotosbiancamento. Non sono stati osservati problemi importanti di sbiancamento a fluorescenza quando si lavora con i parametri di cui sopra. Se può sorgere un tale problema, è consigliabile coprire il tessuto con un mezzo di montaggio per celle marcate fluorescentemente (Tabella dei materiali) oltre ad abbassare il più possibile la potenza del laser (vedere i parametri raccomandati nella Tabella 1).
La tecnica RNAscope è stata applicata per la rilevazione di 3 geni in sezioni tissutali della massa gangliare vagale del topo (Figura 3 e Figura 4). Un profilo è stato considerato positivo per Ghsr e / o Cck1r quando i punti gialli e / o ciano, rispettivamente, sono stati visti sovrapporsi a un profilo pieno di punti rossi (Figura 3A-C). L'esempio fornito nella Figura 3 mostra molti profili contenenti trascrizioni Phox2b e Cck1r (Figura 3D). Phox2b è stato utilizzato per identificare i neuroni afferenti nodosi. Abbondanti segnali Phox2b accumulati nei neuroni del ganglio nodoso (Figura 4A,B). I segnali Cck1r sono stati rilevati in circa il 52% delle cellule Phox2b (Figura 4C). Da notare, i livelli di espressione per Cck1r variavano notevolmente tra le cellule, che andavano da moderata (~ 20 punti per profilo) a un'etichettatura intensa (riempita di citoplasma). Al contrario, i segnali per Ghsr erano estremamente scarsi nel ganglio nodoso (Figura 4A,B). Solo lo 0,65% stimato delle cellule Phox2b-positive erano positive anche per i trascritti di Ghsr (Figura 4C). Le cellule che esprimono Ghsr spesso co-esprimono Cck1r. Un'indagine visiva dei tessuti non ha rivelato evidenti differenze tra i gangli sinistro e destro. I segnali ISH erano praticamente assenti dalle aree prive di neuroni (ad esempio, epineurio e tratto di fibre).
Prdm12 è stato utilizzato per identificare i neuroni afferenti giugulari. Come previsto, l'espressione di Prdm12 è stata altamente arricchita nei neuroni del ganglio giugulare e in alcuni neuroni che si sono infiltrati nella porzione rostrale del ganglio nodoso (Figura 5A-C). È interessante notare che i segnali Cck1r sono stati rilevati in un sottoinsieme di celle Prdm12 (Figura 5B, C). Poco meno del 9% dei neuroni Prdm12-positivi ha anche espresso Cck1r (Figura 5D). Tuttavia, il ganglio giugulare contiene solo cellule con livelli moderati di Cck1r (<20 punti per cellula) piuttosto che le cellule Cck1r-positive fortemente etichettate che si trovano comunemente nel ganglio nodoso. Le cellule Ghsr-positive erano significativamente più prevalenti nella giugulare che nella nodosa (Figura 5C). Circa il 3% delle cellule Prdm12 erano anche Ghsr-positive (Figura 5D). È interessante notare che l'1% di tutti i Prdm12 ha co-espresso sia Ghsr che Cck1r. I livelli di espressione per Ghsr erano sempre moderati (<20 punti per cellula). Nessun segnale ISH potrebbe essere visto in aree prive di neuroni.
Figura 1: Risoluzione dei problemi di fluorescenza endogena. (A, B) Fluorescenza endogena nel ganglio nodoso/giugulare di un topo anziano (~1 anno). Le immagini digitali sono state acquisite al microscopio confocale utilizzando le linee laser indicate in colori e parametri di acquisizione identici a quelli utilizzati per l'ISH multiplex con topi più giovani (vedi più avanti). È importante sottolineare che il tessuto fisso non è stato elaborato in alcun modo se non quello di essere conservato a -80 °C ed esposto a DAPI. Come mostrato in A, un livello significativo di fluorescenza indesiderata si osserva nelle cellule neuronali e non neuronali, specialmente se esposte al laser a 488 nm (verde). Questo è un risultato comune in istologia, che giustifica la valutazione della fluorescenza endogena prima dell'analisi istologica. (B)A un ingrandimento più elevato, la fluorescenza assomigliava ai pigmenti di lipofuscina che spesso si accumulano nelle cellule che invecchiano e potrebbero essere facilmente scambiati per autentici segnali di immunoreattività e / o RNAScope. Barre di scala = 158 μm (A) e 15 μm (B). (B). Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; NG = ganglio nodoso; ISH = ibridazione in situ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Determinazione del rapporto segnale-rumore ottimale. (A, B) Controllo negativo costituito dal rilevamento dell'RNAScope per il gene procariotico DapB. Si noti che la fluorescenza endogena nel ganglio nodoso di un topo giovane adulto è minima e che l'incubazione con la sonda DapB non ha provocato segnali. I parametri di acquisizione erano identici a quelli utilizzati per l'ISH multiplex. Ciò dimostra che la procedura RNAScope stessa non produce alcun background significativo se i parametri di acquisizione vengono scelti con attenzione. (C) Immagini digitali dello stesso tessuto acquisite ad aumentare la potenza laser e guadagno con il laser a 488 nm. Nota come alcuni sfondi verdi sfocati e punti occasionali sorgono sopra una certa potenza e guadagno laser. Pertanto, è importante scegliere attentamente i parametri di acquisizione per ciascun laser in base alla quantità di fluorescenza non specifica ottenuta nel tessuto di controllo negativo. Barre di scala = 158 μm (A) e 15 μm (B, C). Abbreviazioni: DapB = diidrodipicolinato reduttasi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; NG = ganglio nodoso; ISH = ibridazione in situ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione e conteggio dei profili positivi. (A) Immagine digitale rappresentativa di profili marcati con Phox2b (rosso) nella parte rostrale del ganglio nodoso. In questo esempio, sono stati identificati un totale di 18 profili cellulari (etichettati da 1 a 18). Si noti che la colorazione DAPI aiuta ulteriormente a localizzare i neuroni, che in genere mostravano un nucleo grande e rotondo con una leggera macchia DAPI. Al contrario, i nuclei delle cellule non neuronali sono marcati in modo brillante, allungati e di dimensioni più piccole. Nel complesso, i segnali RNAScope si conformavano alla distribuzione e alla forma delle cellule neuronali piuttosto che non neuronali. (B) Vengono mostrati due neuroni Ghsr-positivi marcati (giallo) (profili 19 e 20). I segnali Ghsr erano scarsi e difficili da vedere. Pertanto, la leggerezza e la saturazione dei segnali gialli sono state migliorate in modo selettivo e uniforme nel software fotografico. (C) Sono identificati un totale di nove profili con etichetta Cck1r (ciano) (etichettati come 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 e 19). Si noti come l'intensità dei segnali Cck1r variasse notevolmente tra le cellule. Ad esempio, il profilo 11 contiene solo alcuni segnali positivi, mentre il profilo 7 è quasi pieno di segnali Cck1r. (D) Una vista unita di tutti i canali ha permesso l'identificazione dei modelli di colocalizzazione. Molti profili Phox2b-positivi hanno anche co-espresso Cck1r (ad esempio, i profili 2, 8 e 14), come evidenziato dai punti RNAScope rossi e ciano all'interno dello stesso profilo cellulare. Al contrario, i profili Phox2b-positivi non esprimevano trascrizioni Ghsr (profili 19 e 20). Tuttavia, una cellula Ghsr-positiva ha anche espresso bassi livelli di Cck1r (profilo 19). I due grandi nuclei colorati di DAPI etichettati con un asterisco bianco corrispondono presumibilmente alla posizione dei neuroni afferenti Phox2b-negativi privi di segnali RNAScope. Nei risultati rappresentativi descritti di seguito, almeno 2.000 profili neuronali sono stati contati da masse gangliari sinistra e destra di 4 animali diversi. Barre di scala = 24 μm. Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; Phox2b = omeobox 2b accoppiato; Ghsr = recettore della grelina; Cck1r = recettore della colecistochinina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi dell'ISH multiplex nei neuroni afferenti nodosi. Immagini digitali di una massa gangliare vagale rappresentativa etichettata con RNAscopio multiplex per Phox2b, Cck1r e Ghsr. Le immagini sono state acquisite con gli obiettivi 20x(A)e 63x(B, C)di un microscopio confocale (Zeiss LSM880). In A, 20× diverse immagini sono state cucite insieme utilizzando il software Zen e presentate come canali non mixati o unite. Segnali Phox2b (rosso) specificamente accumulati nei neuroni afferenti situati nel ganglio nodoso. Come previsto, i segnali Cck1r (ciano) hanno intensamente etichettato molti, ma non tutti, i neuroni nel ganglio nodoso. A basso ingrandimento, le cellule che esprimono bassi livelli di Cck1r o qualsiasi cellula con segnali Ghsr (giallo) non possono essere osservate facilmente. DAPI (grigio) ha aiutato a visualizzare il tessuto e identificare i neuroni afferenti vagali con un nucleo grande e leggermente macchiato. L'inserto bianco nell'immagine unita corrisponde alle posizioni dell'immagine incluse di seguito. (B) Ad alto ingrandimento, i profili Phox2b-positivi (rosso) sono evidenti. Molte cellule hanno anche espresso Cck1r ma a vari livelli, che vanno da moderati a molto alti. Il profilo "1" è un esempio di cellula Phox2b negativa per Cck1r e Ghsr. I profili "2" e "3" sono cellule Phox2b con segnali Cck1r alti e moderati, rispettivamente. Segnali moderati per Ghsr (giallo) sono stati occasionalmente osservati nel ganglio nodoso rostrale ma quasi sempre in cellule negative per Phox2b, come mostrato con il profilo "4". È interessante notare che il profilo "4" esprimeva sia Ghsr che Cck1r. Come mostrato nella figura successiva, Ghsr era più abbondante nelle cellule Prdm12. (C) Grafico a torta che riassume le stime della percentuale di cellule Phox2b (rosse) che co-esprimono Ghsr (giallo), Cck1r (ciano) o entrambi (grigio). Il numero totale di profili contati è indicato accanto al grafico (n = 4 diversi gangli, sinistra e destra combinati). I risultati di ciascuna parte sono stati raggruppati perché non sono state notate differenze. Barre di scala = 158 μm (A) e 15 μm (B). Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; NG = ganglio nodoso; JG = ganglio giugulare; ISH = ibridazione in situ; Phox2b = omeobox 2b accoppiato; Ghsr = recettore della grelina; Cck1r = recettore della colecistochinina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi dei neuroni afferenti giugulari multiplex ISH. Immagini digitali di una massa gangliare vagale rappresentativa etichettata con RNAscopio multiplex Prdm12, Cck1r e Ghsr. Le immagini sono state acquisite con gli obiettivi 20x(A)e 63x(B, C)di un microscopio confocale (Zeiss LSM880). In A, 20× diverse immagini sono state cucite insieme utilizzando il software Zen e presentate come canali non mixati o unite. Trascrizione prdm12 (rosso) specificamente accumulata nei neuroni afferenti situati nel ganglio giugulare e solo pochi neuroni che si infiltrano nella parte rostrale del ganglio nodoso. I segnali Cck1r (ciano) intensamente etichettati come il ganglio nodoso. A basso ingrandimento, le cellule che esprimono bassi livelli di Cck1r o qualsiasi cellula con segnali Ghsr (giallo) non potevano essere viste facilmente. DAPI (grigio) ha aiutato a visualizzare il tessuto e identificare i neuroni afferenti vagali con un nucleo grande e leggermente macchiato. I due inserti bianchi nell'immagine unita corrispondono alle posizioni delle immagini incluse di seguito. (B, C) Ad alto ingrandimento, i profili cellulari Prdm12-positivi (rosso) possono essere delineati. Segnali moderati per Cck1r sono stati rilevati anche nei profili "1" e "2". Il profilo "3" è rappresentativo delle cellule Prdm12 negative per Cck1r o Ghsr. In C, i segnali Ghsr (giallo) sono visti nel profilo rappresentativo "4" ma non in "5". (D) Grafico a torta che riassume le stime della percentuale di cellule Prdm12 (rosse) che co-esprimono Ghsr (giallo), Cck1r (ciano) o entrambi (grigio). Il numero totale di profili contati è indicato accanto al grafico (n = 4 diversi gangli, sinistra e destra combinati). I risultati di ciascuna parte sono stati raggruppati perché non sono state notate differenze. Barre di scala = 158 μm (A) e 15 μm (B, C). Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; NG = ganglio nodoso; JG = ganglio giugulare; ISH = ibridazione in situ; Prdm12 = PR dominio zinco proteina del dito 12; Phox2b = omeobox 2b accoppiato; Ghsr = recettore della grelina; Cck1r = recettore della colecistochinina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Opale | Linea laser | Campo di rilevamento | potenza | guadagnare | Media linea | Dimensione dei pixel |
| Opale 690 | HeNe 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opale 570 | Laser DPSS 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opale 520 | argon laser 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI · | laser a diodi 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
Tabella 1: Parametri di acquisizione. Abbreviazione: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La tecnica di ISH è stata inventata alla fine del 196042. Tuttavia, non è fino alla metà degli anni 1980 che è stato applicato per il rilevamento di mRNA nel sistema nervoso centrale e periferico43,44. Considerando l'eterogeneità del sistema nervoso e i problemi ricorrenti con gli anticorpi, localizzare un particolare trascritto a livello cellulare rimane uno strumento inestimabile. Tuttavia, i metodi ISH tradizionali sono rimasti laboriosi e variabilmente sensibili. Fortunatamente, questo studio ha impiegato una procedura ISH altamente sensibile chiamata RNAscope, che di solito non genera alcun background e consente la rilevazione di diversi trascritti espressi a bassi livelli45,46. In particolare, è stato applicato RNAScope fluorescente multiplex per il rilevamento simultaneo dei trascritti Ghsr e Cck1r. I fattori di trascrizione, Phox2b e Prdm12, sono stati ulteriormente utilizzati come marcatori selettivi per differenziare rispettivamente i neuroni afferenti nodosi e giugulari. Senza visualizzare Phox2b e Prdm12, sarebbe difficile identificare con certezza i neuroni afferenti giugulari vs nodosi. Come spiegato sopra, un passaggio critico include una tecnica di dissezione coerente e corretta. Inoltre, anche la verifica della fluorescenza endogena è un fattore importante in quanto potrebbe essere facilmente scambiata per segnali RNAScope. Inoltre, è fortemente consigliata la scelta di parametri di acquisizione appropriati basati sul tessuto di controllo negativo. Come accennato in precedenza, la microscopia confocale è il metodo di imaging preferito con obiettivi 20x e 63x (olio) perché 1) i trascritti espressi a bassi livelli e / o in cellule sparse possono essere evidenti solo ad alto ingrandimento. 2) La microscopia confocale consente la raccolta di un singolo piano focale, il che è importante considerando che due cellule una sopra l'altra possono erroneamente apparire come una cellula quando vengono visualizzate dall'epifluorescenza. 3) La microscopia confocale consente anche parametri di acquisizione più selettivi e flessibili. I parametri di acquisizione di cui sopra sono forniti solo a titolo di esempio e le modifiche sono raccomandate a seconda di uno strumento, ingrandimento (20x o 63x), livelli di espressione e livelli endogeni di fluorescenza per un dato tessuto. La stessa procedura di colorazione è rimasta molto vicina a quella del protocollo raccomandato con solo lievi aggiustamenti. Ovviamente, il protocollo qui descritto può essere applicato al rilevamento di eventuali trascrizioni, non solo GPCR. La procedura qui descritta è tuttavia particolarmente utile considerando i problemi ricorrenti con gli anticorpi sollevati contro i GPCR24.
Come discusso in precedenza15, il ganglio nodoso del topo è talvolta attaccato al ganglio cervicale superiore da un ponte cellulare. L'inclusione di questo ponte cellulare può portare a risultati confusi, ad esempio, marcatori non vagali rilevati nel ganglio nodoso. L'investigatore potrebbe voler verificare sistematicamente se il ganglio nodoso è attaccato al ganglio cervicale superiore durante la dissezione. Altrimenti, le abilità di dissezione incoerenti tra i gangli introdurranno variabilità sperimentale. È anche importante notare che sia i neuroni afferenti petrosali che nodosi esprimono Phox2b47. Quindi, quelli che abbiamo definito neuroni afferenti nodosi includevano sia neuroni petrosali che nodosi. Infine, quando si confrontano diversi studi, si dovrebbe tenere presente che diversi metodi di eutanasia possono causare cambiamenti nell'espressionegenica 48.
In teoria, i fluorofori utilizzati per il rilevamento possono essere attribuiti in modo intercambiabile a qualsiasi canale. Tuttavia, Opal 690 è stato trovato per emettere un basso livello di fluorescenza verde. Nella maggior parte dei casi, nel caso di trascrizioni altamente espresse (ad esempio, Prdm12), la fluorescenza verde indesiderata è stata osservata se l'intensità del laser era troppo alta. Opal 690 è quindi raccomandato per geni con espressione moderata/bassa. Se si lavora solo con geni altamente espressi, si raccomanda di diluire ulteriormente Opal 690 (cioè 1/3.000) e non catturare la fluorescenza verde non specifica durante l'acquisizione dell'immagine. I segnali dell'RNAscopio sono punti separati di colori diversi, anche quando i trascritti sono espressi all'interno dello stesso profilo cellulare. Tuttavia, per i trascritti altamente espressi, potrebbe non essere possibile vedere singoli punti ma piuttosto la fluorescenza che riempie il citoplasma. Quando i punti emettono fluorescenza di colori diversi, si potrebbe considerare un problema di fluorescenza non specifica a causa, tra gli altri esempi, di parametri di acquisizione inadeguati e / o pigmenti endogeni. Infine, Opal 570 e 620 non devono essere utilizzati contemporaneamente perché i loro spettri di emissione si sovrappongono.
Se non si osservano segnali RNAscope per un gene noto per essere espresso nel tessuto di interesse, si consiglia di verificare l'integrità del tessuto eseguendo una sonda positiva disponibile (cioè il gene di pulizia della peptidil-prolil cis-trans isomerasi B). La controcolorazione DAPI è anche utile per determinare la qualità dei tessuti. I nuclei marcati con DAPI che appaiono triturati possono indicare una digestione eccessiva o un tessuto fissato in modo improprio.
Di conseguenza, Ghsr è stato espresso in un piccolo sottogruppo di neuroni afferenti giugulari Prdm12-positivi. Al contrario, e in accordo con uno studio precedente11, l'mRNA di Ghsr era praticamente assente dai neuroni afferenti nodosi. Si deduce che bassi livelli di mRNA Ghsr precedentemente rilevati da qPCR e ISH erano probabilmente dovuti ai neuroni afferenti giugulari30,31,32. Un precedente studio di segnalazione del calcio ha dimostrato che il 3% dei neuroni afferenti vagali in coltura risponde alla grelina49, un numero che è notevolmente simile alla percentuale di neuroni afferenti giugulari che esprimono Ghsr. Cck1r è stato espresso in molti neuroni afferenti nodosi Phox2b-positivi e, più sorprendentemente, in un sottogruppo di neuroni afferenti giugulari Prdm12-positivi. In sintesi, questo documento dimostra il successo dell'adattamento delle tecniche ISH esistenti per valutare la distribuzione cellulare di GPCR selezionati nella massa gangliare giugulare-nodosa nella sua interezza.
In conclusione, il multiplex ISH è stato impiegato per rilevare e visualizzare simultaneamente i trascritti per due GPCR (Cck1r e Ghsr) e un fattore di trascrizione (Phox2b o Prdm12) nell'intero complesso ganglionico vagale del topo adulto. Il protocollo qui descritto può essere uno strumento complementare al sequenziamento dell'RNA, alla qPCR e all'istologia tradizionale. Tuttavia, questo protocollo può essere applicato ad altri gangli di dimensioni simili. Come discusso in precedenza, i parametri di acquisizione, l'età degli animali e la coerenza della dissezione sono fattori importanti da considerare durante la progettazione sperimentale. Pertanto, può offrire informazioni uniche sui modelli di espressione genica topografica in un ganglio altamente eterogeneo e piccolo. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per determinare i cambiamenti nei profili trascrizionali dei neuroni afferenti giugulari vs nodosi nel contesto di varie condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, inclusi, ma non limitati a, cambiamenti nello stato di alimentazione. Può anche essere usato per confrontare la composizione neurochimica dei neuroni afferenti vagali in specie animali comunemente usate nella ricerca preclinica, tra cui primati e maiali50,51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core finanziato dalla sovvenzione NIH #5P01DK119130-02. Gli autori desiderano riconoscere l'assistenza della UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (guidata dal Dr. Phelps) e del suo staff (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), supportati in parte dal NIH Grant #1S10OD021684-01, una risorsa condivisa dell'Harold C. Simmons Cancer Center, supportata in parte da una sovvenzione di supporto ncI Cancer Center, P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
