시투 혼성화(ISH)의 멀티플렉스는 성인 마우스의 전체 vagal ganglionic 복합체에서 2개의 G 단백질 결합 수용체 및 1개의 전사 인자에 대한 성적증명서를 동시에 시각화하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 vagal 포렌트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한 지도를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
이 연구는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 발현을 검출하는 데 특히 중점을 둔 마우스 경정맥 중형화(ISH)의 주악성화(ISH)에서 멀티플렉스에 대한 프로토콜을 설명합니다. 포르말린 고정 경정맥 신경리아는 RNAscope 기술로 처리되어 두 개의 대표적인 GPCRs(cholecystokinin 및 ghrelin 수용체)의 발현을 동시에 검출하여 nodose(쌍형 동종박스 2b, Phox2b) 또는 경정맥 성신경(PR도메인 아연+121)의 하나의 마커 유전자와 결합하여 동시에 검출하였다. 표지된 간리아는 앞서 언급한 성적증명서의 분포 및 발현 패턴을 결정하기 위해 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 간단히, Phox2b 포이퍼트 뉴런은 담낭스토키닌 수용체(Cck1r)를 풍부하게 표현하지만 그렐린 수용체(Ghsr)는 발현하는 것으로 나타났다. Prdm12 포퍼런트 뉴런의 작은 하위 집합은 또한 Ghsr 및/또는 Cck1r를 표현하는 것으로 나타났습니다. 이 문서에 설명 된 접근 방식은 vagal 포퍼런트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한지도를 생성하는 과학자를 도울 수 있습니다.
vagal afferents의 세포 체는 경정맥, 석유, 및 nodose ganglia1,2,3에포함된다. 그들의 축축은 두개골, 흉부 및 복부 영토4,5,6,7에미주 신경의 여러 가지를 통해 함께 여행한다. 그들의 내장 엔딩에서, vagal afferents는 생리적이고 유해한 자극의 넓은 범위에 반응할 수 있습니다8,9,10. 그러나, 바갈 감지에 관여하는 신호 분자 및 수용체의 분포는 제대로 특성화 남아 있습니다. 이는 부분적으로 그들의 작은 크기에도 불구하고, 많은 수의GPCRs8,11,12,13을포함하여 광범위한 수용체 스펙트럼을 표현하기 때문이다. 더욱이, vagal 발포성 뉴런은 본질적으로 이질적이며 뚜렷한 분자프로파일(14)을표시한다. 문제를 복잡하게 하기 위해 경정맥, 석유 및 노도스 신경리아가 마우스에 부착되어 단일 신경절 질량을 형성합니다. 마지막으로, 동물의 하위 집합에서, 노도스 신경절은 공감 우수한 자궁 경부신경절(15)에부착된다.
과거에, 조사자들은 vagal 포퍼트 뉴런의 신경화학적 구성을 연구하기 위해 면역히토화학으로 전환했다16,17,18. 검증된 항체를 이용한 면역히스트토화학이 유용하지만, 면역히스토케미칼 연구의 결과는 주의해서 해석되어야 한다. 예를 들어, GPCRs에 대한 특정 항체를 식별하는 수많은 노력은19,20,21,22, 23,24,25에실패했으며, 주요 연구자들은 GPCRs에 대한 항체의 대부분이 신뢰할 수 없다는 결론을 내렸다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 정량적 PCR(qPCR)은 설치류 혈관 신경절 질량26,27,28,29에서유전자 발현을 평가하는 데 널리 사용되어 왔다. 그러나, qPCR을 이용한 유전자 발현을 검사하는 것은 공간 정보의 손실의 희생으로 발생한다. 특히, 관심 있는 특정 유전자(예를 들어, 노도스 대 경정맥 세포)를 발현하는 세포 또는 셀 유형(들)의 수를 예측할 수 없다. 되풀이되는 문제점은 또한 인접한 조직으로 오염및 해부15도중 미주 신경의 가변 길이, 우수한 자궁 경부 및 경정맥 의 포함을 포함합니다. 위의 어려움의 결과로, 논쟁은 vagal 포성 뉴런에서 여러 GPCRs의 표현과 분포를 둘러싸고 있습니다. 한 특히 수수께끼 예는 ghrelin 수용 체에 관한 (Ghsr). 일부 연구는 vagal afferent뉴런30,31,32에서이수용체의 광범위한 표현을 발견하는 반면, 다른 사람은 Ghsr mRNA가 nodose 신경절11,14에서거의 감지 할 수없는 것으로 나타났습니다. 따라서 vagal ganglionic 질량에 있는 Ghsr mRNA의 상세한 매핑은 그러므로 보증됩니다.
시투 혼성화(ISH)에서도 vagal ganglionic 질량7,11,12,33,34,35에서유전자 발현 패턴을 평가하는 데 사용되었습니다. RNA 기반 기술은 대부분의 상황에서 항체 기반 기술보다 더 신뢰할 수 있고 특이적으로 남아 있기 때문에36,37,ISH 연구는 vagal 포성 뉴런의 신경 화학 코딩을 더 잘 이해하는 데 가치가 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 전통적인 ISH 기술 자체는 주의없이하지 않습니다. 방사성 이스는 민감하지만 배경을 생성하고 성가신38남아있다. 비 방사성 ISH는 덜 복잡하지만 덜민감하지 도 38. 대조적으로, 최근에 개발된 RNAscope ISH 방법은 매우 민감하고 최소한의배경(39)을생성한다. 현재 연구는 마우스의 vagal 포성 뉴런에서 GPCRs의 검출에 멀티플렉스 형광 RNAscope를 적용. 우리는 Ghsr의 분포를 매핑에 초점을 맞추고 cholecystokinin 수용체 (Cck1r)의 분포를 비교, 또 다른 GPCR잘 노도스 신경절에서 발현 될 것으로 알려진(34). 마지막으로, 쌍과 같은 동종박스 2b(Phox2b) 및 PR 도메인 아연 핑거 단백질 12(Prdm12)는 각각14개의노도스와 경정맥 성신경에 대한 선택적 마커로 사용되었다. Phox2b 또는 Prdm12를 시각화하지 않으면 경정맥 대 노도스 포렌티를 확실하게 식별하는 것이 어려울 것입니다. 잠재적인 기술적 함정은 또한 기사 전반에 걸쳐 논의됩니다.
ISH의 기술은 1960 년대 후반42에발명되었다. 그러나, 1980년대 중반까지는 중추 및 말초 신경계에서 mRNA검출을 위해 적용된 것이아니다(43·44). 신경계의 이질성과 항체에 대한 반복되는 문제를 고려할 때, 세포 수준에서 특정 성적증명서를 국소화하는 것은 여전히 귀중한 도구로 남아 있다. 그럼에도 불구하고 전통적인 ISH 방법은 힘들고 …
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH 교부금 #5P01DK119130-02에 의해 투자된 신경 해부학/히스토로지/뇌 주입 코어에 의해 지원되었습니다. 저자는 UT 남서부 라이브 세포 이미징 시설 (펠프스 박사가 이끄는)과 그 직원 (Abhijit Bugde 및 마르셀 Mettlen)의 도움을 인정하고 싶습니다, NIH 그랜트 #1S10OD021684-01에 의해 부분적으로 지원, 해롤드 C. 시몬스 암 센터의 공유 자원, NCI 암 센터 지원 보조금에 의해 부분적으로 지원, P30 CA142543.
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
-80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
HybEZ oven | hybridization oven | ||
Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
ImageJ-Fiji | NIH | ||
Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
User manual | ACD | 323100 USM | |
Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
ZEN Imaging Software | Zeiss |