Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الكشف عن G البروتين إلى جانب مستقبلات التعبير في الخلايا العصبية Vagal الماوس Afferent باستخدام Multix في الموقع التهجين

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62945
Automatic Translation
1, 1
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Summary

تم استخدام Multix في التهجين الموقعي (ISH) لتصور النصوص في وقت واحد لمستقبلين مقترنين بالبروتين G وعامل نسخ واحد في مجمع العقدة المبهم بأكمله من الماوس البالغ. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد خرائط دقيقة من ملامح النسخ من الخلايا العصبية المبهمة afferent.

Abstract

تصف هذه الدراسة بروتوكولا للتهجين المتعدد في الموقع (ISH) للجانجليا الوداجية العقيدة الماوسية ، مع التركيز بشكل خاص على الكشف عن التعبير عن مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs). تمت معالجة العقدة الوداجية العقيدات الثابتة بالفورمالين باستخدام تقنية RNAscope للكشف في وقت واحد عن تعبير اثنين من GPCRs التمثيلية (مستقبلات cholecystokinin و ghrelin) بالاشتراك مع جين علامة واحد إما من العقيدات (علبة منزل تشبه الزوج 2b ، Phox2b) أو الخلايا العصبية الأفرنت الوداجية (بروتين إصبع الزنك في مجال PR 12 ، Prdm12). تم تصوير العقدة المسماة باستخدام المجهر confocal لتحديد أنماط التوزيع والتعبير من النصوص المذكورة أعلاه. لفترة وجيزة، تم العثور على الخلايا العصبية Phox2b afferent للتعبير بوفرة مستقبلات cholecystokinin (Cck1r) ولكن ليس مستقبلات غريلين (غسر). تم العثور على مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية Prdm12 afferent أيضا للتعبير عن Ghsr و / أو Cck1r. تتم مناقشة المحاذير التقنية المحتملة في تصميم ومعالجة وتفسير ISH متعددة. النهج الموصوف في هذه المقالة قد يساعد العلماء في توليد خرائط دقيقة للملامح النسخية من الخلايا العصبية المبهمة.

Introduction

وترد جثث الخلايا من afferents المبهم في الوداجي، بتروسال، وggallia نودوز1،2،3. محاورهم السفر معا عبر عدة فروع من العصب المبهم إلى القحف والصدر والبطن الأراضي4،5،6،7. من النهايات الحشوية ، يمكن أن تستجيب الطحالب لمجموعة واسعة من المحفزات الفسيولوجية والمضرة8و9و10. ومع ذلك، فإن توزيع جزيئات الإشارات والمستقبلات المشاركة في الاستشعار عن المبهم لا يزال غير مميز. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن العقدة المبهمة ، على الرغم من صغر حجمها ، تعبر عن طيف واسع من المستقبلات ، بما في ذلك عدد كبير من GPCRs8،11،12،13. وعلاوة على ذلك، الخلايا العصبية المبهمة غير متجانسة بطبيعتها وعرض ملامح الجزيئية متميزة14. ولتعقيد الأمر، يتم إرفاق العقدة الوداجية والتروسالية والعقيدة في الماوس، وبالتالي تشكيل كتلة واحدة من العقد. وأخيرا ، في مجموعة فرعية من الحيوانات ، يتم إرفاق العقدة العقيدية إلى العقدة العنقية المتفوقة المتعاطفة15.

في الماضي، تحولت المحققين إلى الكيمياء المناعية لدراسة الماكياج الكيميائي العصبي من الخلايا العصبية المبهمة16،17،18. في حين أن الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة المعتمدة مفيدة ، يجب تفسير نتائج الدراسات الكيميائية المناعية بحذر. على سبيل المثال، فشلت العديد من الجهود لتحديد أجسام مضادة محددة ضد GPCRs19و20و21و22و23و24و25، مما دفع المحققين إلى استنتاج أن غالبية الأجسام المضادة ضد GPCRs لا يمكن الاعتماد عليها. للتحايل على هذه القضايا، وقد استخدمت على نطاق واسع PCR الكمية (qPCR) لتقييم التعبير الجيني في كتلة العصابات المبهم القوارض26،27،28،29. ومع ذلك، فإن فحص التعبير الجيني باستخدام qPCR يحدث على حساب فقدان المعلومات المكانية. ولا يمكن التنبؤ على وجه الخصوص بعدد الخلايا أو نوع الخلية (أنواعها) التي تعبر عن جين معين مهم (مثل الخلايا العقدية مقابل الخلايا الوداجية). وتشمل القضايا المتكررة أيضا التلوث مع الأنسجة المجاورة وإدراج أطوال متغيرة من العصب المبهم، عنق الرحم متفوقة، والغانجيليا الوداجية أثناء تشريح15. نتيجة للصعوبات المذكورة أعلاه، الجدل يحيط التعبير وتوزيع العديد من GPCRs في الخلايا العصبية المبهمة. أحد الأمثلة المحيرة بشكل خاص يتعلق بمستقبلات غريلين (Ghsr). في حين وجدت بعض الدراسات على نطاق واسع التعبير عن هذا المستقبل في الخلايا العصبية المبهمة30,31,32, وجدت دراسات أخرى أن GHSR مرنا أن تكون غير قابلة للكشف تقريبا في العقدة العقيدات11,14. ولذلك هناك ما يبرر رسم خرائط مفصلة ل Ghsr mRNA في الكتلة الغنغليونية المبهمة.

في الموقع التهجين (ISH) كما تم استخدامها لتقييم أنماط التعبير الجيني في كتلة ganglionic المبهم7،11،12،33،34،35. لأن التقنيات القائمة على الحمض النووي الريبي لا تزال أكثر موثوقية ومحددة من التقنيات القائمة على الأجسام المضادة في معظم الظروف36،37، أثبتت دراسات ISH قيمة لفهم أفضل للترميز الكيميائي العصبي للخلايا العصبية المبهمة. ومع ذلك، فإن تقنيات ISH التقليدية نفسها لا تخلو من المحاذير. المشعة ISH حساسة ولكن يولد الخلفية ويبقىمرهقة 38. ISH غير المشعة أقل تعقيدا ولكن أيضا أقلحساسية 38. في المقابل، فإن طريقة RNAscope ISH المطورة مؤخرا حساسة للغاية وتولد الحد الأدنى من الخلفية39. الدراسة الحالية تطبيق متعدد الفلورسنت RNAscope للكشف عن GPCRs في الخلايا العصبية المبهمة من الماوس. ركزنا على رسم خرائط لتوزيع Ghsr وقارنا توزيعه بمستقبلات المرارة (Cck1r) ، وهو GPCR آخر معروف جيدا ليتم التعبير عنه في العقدة العقيدية34. وأخيرا، تم استخدام اثنين من عوامل النسخ، وقران مثل homeobox 2b (Phox2b) وبروتين إصبع الزنك المجال العلاقات العامة 12 (Prdm12)، كعلامات انتقائية للخلايا العصبية العقيدة والوداجي afferent، على التوالي14. دون تصور Phox2b أو Prdm12 ، سيكون من الصعب تحديد الوداجي مقابل العقيدات مع اليقين. كما تناقش المزالق التقنية المحتملة في جميع أنحاء المقال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذه الدراسة كانت من النوع البري الذكور على خلفية C57BL/6J نقية. تم استخدام ما مجموعه 4 فئران لISH متعددة. وكان عمر جميع الفئران حوالي 8 أسابيع في وقت التضحية. كما استخدم فأر ذكر واحد (يبلغ من العمر عاما واحدا تقريبا) لإثبات الفلوروجيني المرتبط بالشيخوخة. تم إيواء الحيوانات في أقفاص التهوية داخل منشأة حاجز مع إمكانية الحصول على الغذاء والماء. استعرضت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في المركز الطبي لجنوب غرب الولايات المتحدة الإجراءات الموضحة أدناه ووافقت عليها. يمكن العثور على تفاصيل حول الكواشف والأدوات في جدول المواد.

1. جمع العينات

  1. في يوم التضحية ، قم بإعطاء جرعة زائدة من هيدرات الكلورال (500 ملغ / كجم ، أي p.) للفئران. Perfuse الفئران تخدير عميق عبر القلب باستخدام مضخة معج مع 5 مل من المالحة 1x الفوسفات العازلة (PBS) تليها 50 مل من 10٪ الفورمالين في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم ذلك في غطاء الدخان لمنع استنشاق الفورمالين.
  2. كما يتم تنصهر نودوز، بتروسال، والغنغلية الوداجية لتشكيل كتلة ganglionic واحد في الماوس15،وجمع بعناية كتلة ganglionic المبهم كامل من كل جانب (اليسار واليمين) مع مساعدة من نطاق تشريح ومقص الربيع غرامة والملقط (انظر جدول المواد).
  3. عند قطع رأس الماوس مع زوج من مقص كبير (انظر جدول المواد)،وتجنب سحق جذع الدماغ.
  4. بعد نهج تشريح وصفها من قبل في الفئران40، وإزالة العضلات sternohyoid وomohyoid الجانبية إلى القصبة الهوائية مع ملقط صغير (جدول المواد) لفضح العظام القذالي. مسح المنطقة بأكملها من العضلات والأنسجة الدهنية، والأنسجة الملتحمة حتى الشريان السباتي، العصب المبهم، العصب تحت القباني، وماغنوم foramen مرئية. قطع العصب تحت القباني كامل مع مقص الربيع الصغيرة (جدول المواد).
  5. ابحث عن العقدة العقيدة ككتلة شفافة قريبة من ماغنوم foramen15. باستخدام مقص صغير (جدول المواد)، كسر بعناية العظام القذالية لمزيد من فضح العقدة الوداجية. ابحث عن الخلايا الصباغية السوداء على سطح الوداجي كمعلم مرئي.
  6. قطع المرفقات العصبية بين كتلة ganglionic المبهم واستخراج الكتلة العقدية كله عن طريق سحب بلطف على الطرف المحيطي من العصب المبهم في حين قطع في وقت واحد العقدة الوداجي نحو جذع الدماغ مع مقص الربيع الصغيرة(جدول المواد).
  7. إزالة الأنسجة الملتحمة والدهون الشائكة إلى العصب المبهم والكتلة العقدية قدر الإمكان.
  8. كما أنه من السهل أن تفقد العقدة واحدة أثناء نقل من أنبوب واحد إلى آخر، والحفاظ على ~ 0.5 سم من العصب المبهم لتسهيل التعامل مع وتوطين العينات.
  9. وضع ganglia بمساعدة ملقط غرامة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل واحتضان في 4 درجة مئوية في الفورمالين لمدة 24 ساعة ومع 30٪ السكروز لمدة 24 ساعة أخرى.
  10. وضع ganglia داخل قطرة صغيرة (~ 4 ملم Ø) من درجة الحرارة خفض الأمثل (أكتوبر) المتوسطة على قطعة من رقائق الألومنيوم. بعد ذلك، تجميد العينة على سرير من الجليد الجاف.
  11. قطع العينات مع cryostat في -20 درجة مئوية إلى أقسام من سمك 14 ميكرومتر وجمع على الشرائح المجهر الزجاجي كما 3 سلسلة 42 ميكرومتر عن بعضها البعض.
    ملاحظة: تجنب وضع مقاطع قريبة من حواف الشريحة. لحفظ الكواشف، حافظ على أقسام الأنسجة معبأة بإحكام قدر الإمكان ولكن دون تداخل.
  12. تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية حتى الحاجة لISH لمدة 6 أشهر على الأقل.
    ملاحظة: راجع الشكل 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للفلورة الذاتية.

2. المعالجة المسبقة وISH

  1. قبل يوم التجارب، والأواني الزجاجية مختبر الأوتوكلاف لاستخدامها لISH، بما في ذلك تلطيخ الأطباق وجرار العازلة الغسيل.
    ملاحظة: أثناء العمل في ظل ظروف خالية من RNase ليست حرجة، وارتداء قفازات في جميع الأوقات. الحفاظ على زجاجات محلول إزالة التلوث RNase(جدول المواد)في متناول اليد في حالة الاشتباه في التلوث.
  2. في اليوم الأول، جلب الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء مخصصة خصيصا لISH. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1x وخبز لهم لمدة 30 دقيقة في 60 درجة مئوية في فرن الخبز (جدول المواد).
  3. بعد إصلاح الشرائح في 4٪ الفورماتين لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  4. جلب الكواشف في عدة multix(جدول المواد)إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. يجفف الشرائح في 50٪، 70٪، و 100٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما. تطبيق H2O2 حل للعينات لمدة 10 دقيقة ثم شطف في الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
  6. علاج العينات مع كاشف استرجاع الهدف لمدة 5 دقائق، وشطف في ddH2O تليها الإيثانول 100٪، والهواء الجاف. باستخدام قلم مسعور، قم بإنشاء حاجز حول العينات.
    ملاحظة: لا تقم بتطبيق الحاجز الكاره للماء بالقرب من أقسام الأنسجة.
  7. تطبيق بروتياز لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية في فرن التهجين(جدول المواد).
  8. في غضون ذلك، قبل الحرب المسابير في 40 درجة مئوية وتبريدها في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. احتضان الشرائح مع المزيج المطلوب من المسابير المستهدفة (Cck1r-C3، Ghsr-C1، Phox2b-C2؛ أو Cck1r-C3، Ghsr-C1، Prdm12-C2) لمدة 2 ساعة في 40 درجة مئوية في فرن التهجين.
  9. احتضان أنسجة التحكم السلبية مع اختزال ثنائي هيدروبيكولينات (DapB) الهدف C1 التحقيق لمدة 2 ساعة في 40 درجة مئوية في فرن التهجين.
  10. شطف الشرائح في عازلة غسل وتخزينها بين عشية وضحاها في سيترات الصوديوم المالحة 5x (SSC) في درجة حرارة الغرفة. للراحة، تقسيم التجربة إلى يومين. في اليوم التالي، شطف الشرائح مع غسل العازلة واحتضان لهم مع الكواشف تضخيم المذكورة أدناه (انظر دليل المستخدم في جدول المواد).
  11. تطبيق AMP1 (30 دقيقة في 40 درجة مئوية)، AMP2 (30 دقيقة في 40 درجة مئوية)، و AMP 3 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  12. حل كل صبغة أوبال(جدول المواد)في ثنائي ميثيل سلفوإكسيد وتخزين الحلول في 4 درجة مئوية حتى الحاجة.
  13. للقناة 1، احتضان الشرائح مع HRP-C1 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية) وأوبال 520 (اللون الأخضر؛ تخفيف 1/1500؛ 30 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  14. للقناة 2، احتضان الشرائح مع HRP-C2 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية) وأوبال 570 (اللون الأصفر؛ تخفيف 1/1،500؛ لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  15. للقناة 3، احتضان الشرائح مع HRP-C3 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية) وأوبال 690 (اللون الأحمر بكثير؛ تخفيف 1/1،500؛ لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  16. غسل الشرائح وتعريضها ل4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 30 ق.
  17. تطبيق على الفور تصاعد المتوسطة على كل شريحة ووضع غطاء فوق قسم الأنسجة.
  18. حافظ على الأنسجة أفقية في حامل الشريحة عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.

3. التحليل المجهري وتحليل البيانات

ملاحظة: يمكن تصوير بيانات Multix ISH مع مجموعة واسعة من الأدوات مع عوامل التصفية المناسبة. ومع ذلك، فإن طريقة التصوير المفضلة هي المجهر البؤري مع أهداف 20x و 63x (النفط). راجع المناقشة للأسباب. راجع الشكل 2 لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى.

  1. استخدم مجهرا كونفوجكال مجهزا بخطوط ليزر 488 و561 و633 نانومتر. استخدام معلمات الامتلاك التالية (انظر الجدول 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, نطاق الكشف 668-696 نانومتر, الطاقة 2.0, كسب 724); أوبال 570 (DPSS الليزر 561 نانومتر، نطاق الكشف 579-627 نانومتر، <قوة 15.0،
  2. لتحسين جودة الصور، احصل على خط متوسط 4 وحجم بكسل لا يقل عن 1024 × 1024.
    ملاحظة: يتم توفير المعلمات أعلاه كمثال فقط، ويوصى بالتعديلات اعتمادا على أداة واحدة، والتكبير (20x أو 63x)، ومستويات التعبير، ومستويات الإضاءة الذاتية لأي نسيج معين.
  3. بمجرد الرضا عن معلمات الاستحواذ ، اجمع الصور باستخدام نفس الإعدادات. سمة الألوان الزائفة إلى كل قناة لتسهيل التصور.
    ملاحظة: على سبيل المثال، أحمر (Phox2b أو Prdm12) ، سماوي (Cck1r) ، الأصفر (Ghsr) والرمادي (DAPI).
  4. قم بإجراء عد الخلايا باستخدام الصور الرقمية من خلال تحديد المخطط التفصيلي لملامح إيجابية ل RNAscope مع نواة واحدة ملطخة بخفة مع DAPI. حساب النسبة المئوية لملامح إيجابية RNAscope التعبير عن كل نسخة [الشكل 3A-C].
  5. لتحسين صرامة ودقة التقديرات، عد ما لا يقل عن 2000 ملامح الخلايا العصبية من ما لا يقل عن 4 مختلفة. إجراء العد من الجانجليا اليسار واليمين بشكل منفصل.
  6. إدخال البيانات في مخطط دائري مع العدد الإجمالي للملفات الجانبية التي تم عدها.
  7. استخدام برامج التصوير للحصول على الصور وغرزة معا 20x الصور. استخدام ImageJ فيجي وآخر الصور وتصميم البرمجيات لتوليد لوحات النهائي. تطبيق تعديلات على التباين والخفة بشكل موحد على جميع الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في حين يمكن تطبيق RNAScope على الحيوانات من أي عمر أو جنس أو خلفية وراثية ، فمن المستحسن العمل مع الشباب (<3 أشهر). وذلك لأن التحف الفلورية (على سبيل المثال، ليبوفوسين) هي النتائج الشائعة في الخلايا العصبية من الحيوانات القديمة41. غالبا ما تحتوي العقدة المثبتة بالفورماتين من الفئران القديمة على مضان داخلي مكثف بشكل مدهش يمكن أن يخطئ بسهولة في تلطيخ حقيقي(الشكل 1A، B). على أي حال ، من المستحسن التحقق من مستويات الفلورة الذاتية في الأنسجة قبل المعالجة.

من المهم تحديد معلمات الاستحواذ المثلى ونسبة الإشارة إلى الضوضاء لكل ليزر وتكبير باستخدام أقسام من أنسجة التحكم السلبية المحتضنة مع المسبار السلبي DapB كما هو موضح في الشكل 2A، B. لأن DapB هو جين prokaryotic ، يجب أن تكون إشارات RNAscope غائبة تماما عن أنسجة التحكم السلبية. وبصرف النظر عن الحطام والبلورات في بعض الأحيان ، وينظر إلى مضان لا يكاد يذكر في الصور من أنسجة التحكم السلبية ، شريطة أن يتم استخدام معلمات الاستحواذ المناسبة. ومع ذلك ، فوق قوة الليزر وكسب معينة ، خلفية غير مرغوب فيها والنقاط الفلورية عشوائية تبدأ في الظهور(الشكل 2C). وثمة غرض آخر لتقليل طاقة الليزر هو تجنب تشبع البكسل والbleaching. لم تلاحظ أي قضايا رئيسية للتبييض الفلوري عند العمل مع المعلمات المذكورة أعلاه. إذا قد تنشأ مثل هذه المشكلة، فمن المستحسن لتغطية الأنسجة مع تصاعد المتوسطة للخلايا المسمى fluorescently(جدول المواد)بالإضافة إلى خفض قوة الليزر قدر الإمكان (انظر المعلمات الموصى بها في الجدول 1).

تم تطبيق تقنية RNAscope للكشف عن 3 جينات في أقسام الأنسجة من الكتلة العقدية المبهمة للفأر(الشكل 3 والشكل 4). واعتبر ملف واحد إيجابي لGhsr و / أو Cck1r عندما الأصفر و / أو النقاط السماوي ، على التوالي ، شوهدت تراكب ملف شخصي واحد مليئة النقاط الحمراء(الشكل 3A-C). يظهر المثال المقدم في الشكل 3 العديد من الملفات الشخصية التي تحتوي على كل من نصوص Phox2b و Cck1r (الشكل 3D). تم استخدام Phox2b لتحديد الخلايا العصبية العقيدة afferent. وفرة Phox2b إشارات المتراكمة في الخلايا العصبية من العقدة العقيدات (الشكل 4A, ب). تم الكشف عن إشارات Cck1r في حوالي 52٪ من خلايا Phox2b(الشكل 4C). من الجدير بالذكر أن مستويات التعبير ل Cck1r تختلف بشكل كبير بين الخلايا ، بدءا من المعتدلة (~ 20 نقطة لكل ملف شخصي) إلى وضع العلامات المكثفة (ملء السيتوبلازم). في المقابل، كانت إشارات لغسر متناثرة للغاية في العقدة نودوز(الشكل 4A،B). فقط ما يقدر بنحو 0.65٪ من الخلايا Phox2b إيجابية كانت إيجابية أيضا لنصوص Ghsr(الشكل 4C). الخلايا المعبرة عن Ghsr غالبا ما تشارك في التعبير عن Cck1r. لم يكشف مسح مرئي للأنسجة عن اختلافات واضحة بين العقدة اليسرى واليمينية. كانت إشارات ISH غائبة تقريبا عن المناطق الخالية من الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، الإبينيوريوم والألياف).

تم استخدام Prdm12 لتحديد الخلايا العصبية الوداجية. كما هو متوقع، Prdm12 التعبير كان عالي الإثراء في الخلايا العصبية من العقدة الوداجية وعدد قليل من الخلايا العصبية التسلل الجزء الوردي من العقدة نودوز(الشكل 5A-C). ومن المثير للاهتمام، تم الكشف عن إشارات Cck1r في مجموعة فرعية من خلايا Prdm12 (الشكل 5B،C). أقل قليلا من 9٪ من الخلايا العصبية Prdm12 إيجابية أعرب أيضا Cck1r(الشكل 5D). ومع ذلك ، فإن العقدة الوداجية تحتوي فقط على خلايا ذات مستويات معتدلة من Cck1r (<20 نقطة لكل خلايا) بدلا من الخلايا الإيجابية Cck1r المسماة بقوة الموجودة عادة في العقدة العقيدية. وكانت الخلايا الإيجابية Ghsr أكثر انتشارا بشكل ملحوظ في الوداجي مما كانت عليه في العقيدات(الشكل 5C). وكان ما يقرب من 3 ٪ من خلايا Prdm12 أيضا Ghsr إيجابية(الشكل 5D). ومن المثير للاهتمام، 1٪ من جميع Prdm12 شارك في التعبير عن كل من Ghsr و Cck1r. مستويات التعبير لGhsr كانت دائما معتدلة (<20 نقطة لكل خلية). لا يمكن رؤية إشارات ISH في المناطق الخالية من الخلايا العصبية.

Figure 1
الشكل 1: استكشاف المشاكل من الفلورنسينس الذاتية. (A, B) مضان الذاتية في العقدة نودوز / الوداجي من فأر الشيخوخة واحد (~ 1 سنة). تم الحصول على الصور الرقمية عن طريق المجهر confocal باستخدام خطوط الليزر المشار إليها في الألوان والمعلمات الاستحواذ مماثلة لتلك المستخدمة لISH multix مع الفئران الأصغر سنا (انظر في وقت لاحق). والأهم من ذلك، لم تتم معالجة الأنسجة الثابتة بأي شكل من الأشكال غير تخزينها عند -80 درجة مئوية والتعرض ل DAPI. كما هو مبين في A، لوحظ مستوى كبير من الفلورسينس غير المرغوب فيها في الخلايا العصبية وغير العصبية ، خاصة عندما تتعرض لليزر 488 نانومتر (أخضر). هذه هي النتيجة الشائعة في علم الأنسجة ، والتي تبرر تقييم الفلورة الذاتية قبل التحليل النسيجي. (ب)في ارتفاع التكبير، تشبه الفلورسينس أصباغ ليبوفوسين التي غالبا ما تتراكم في الخلايا الشيخوخة ويمكن بسهولة أن يكون مخطئا لالخمول المناعي الحقيقي و / أو إشارات RNAScope. أشرطة المقياس = 158 ميكرومتر (A) و 15 ميكرومتر (B). (ب). اختصارات: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; NG = العقدة العقدية؛ ISH = التهجين في الموقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى. ( A ,B) التحكم السلبي الذي يتكون من الكشف عن RNAScope للجين prokaryotic DapB. لاحظ أن الفلورة الذاتية في العقدة العقيدية لفأر بالغ صغير ضئيلة ، وأن الحضانة مع مسبار DapB لم تسفر عن إشارات. وكانت معلمات الامتلاك مطابقة لتلك المستخدمة في ISH متعددة المضاعفات. وهذا يدل على أن الإجراء RNAScope نفسها لا تنتج أي خلفية هامة إذا تم اختيار المعلمات اقتناء بعناية. (ج) الصور الرقمية لنفس الأنسجة المكتسبة في زيادة ليزر السلطة وكسب مع الليزر 488 نانومتر. لاحظ كيف تنشأ بعض الخلفية الخضراء الضبابية والنقاط العرضية فوق قوة وكسب ليزر معين. وبالتالي، من المهم اختيار معلمات الاستحواذ بعناية لكل ليزر استنادا إلى مقدار الفلورسينس غير المحدد الذي تم الحصول عليه في أنسجة التحكم السلبية. أشرطة المقياس = 158 ميكرومتر (A) و 15 ميكرومتر (B, C). المختصرات: DapB = اختزال ديهيدروبيكولينات; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; NG = العقدة العقدية؛ ISH = التهجين في الموقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تحديد الملامح الإيجابية وحسابها. (أ) صورة رقمية تمثيلية لملامح Phox2b المسمى (أحمر) في الجزء الوردي من العقدة نودوز. في هذا المثال، تم تحديد ما مجموعه 18 ملفا خلويا (وصفت بأنها 1 إلى 18). لاحظ أن تلطيخ DAPI يساعد بشكل أكبر في توطين الخلايا العصبية ، والتي عادة ما تعرض نواة كبيرة ومستديرة مع بقعة DAPI خفيفة. في المقابل ، يتم تسمية نواة الخلايا غير العصبية بشكل مشرق ، ممدود ، وأصغر في الحجم. بشكل عام ، تتوافق إشارات RNAScope مع توزيع وشكل الخلايا العصبية بدلا من الخلايا غير العصبية. (ب)تظهر اثنين من الخلايا العصبية Ghsr إيجابية المسمى (الأصفر) (ملامح 19 و 20). كانت إشارات Ghsr متناثرة ويصعب رؤيتها. لذلك ، تم تعزيز خفة وتشبع الإشارات الصفراء بشكل انتقائي وموحد في برامج الصور. (ج)تم تحديد ما مجموعه تسعة ملفات تعريف تحمل علامة Cck1r (سماوي) (وصفت بأنها 2 و 5 و 8 و 11 و 14 و 17 و 18 و 19). لاحظ كيف تباينت كثافة إشارات Cck1r بشكل كبير بين الخلايا. على سبيل المثال، يحتوي الملف الشخصي 11 على بعض الإشارات الإيجابية فقط، في حين أن الملف الشخصي 7 مليء تقريبا بإشارات Cck1r. (D)عرض مدمج لكافة القنوات يسمح بتحديد أنماط التكون. العديد من الملفات الشخصية الإيجابية Phox2b أيضا أعرب Cck1r (على سبيل المثال، ملامح 2 و 8 و 14)، كما يتضح من النقاط RNAScope الأحمر والسماوي داخل نفس الملف الخلوي. وعلى النقيض من ذلك، لم تعبر الملفات الشخصية الإيجابية ل Phox2b عن نصوص Ghsr (الملفان الشخصيان 19 و20). ومع ذلك، أعربت خلية واحدة إيجابية Ghsr أيضا مستويات منخفضة من Cck1r (الملف الشخصي 19). اثنين من النوى الكبيرة الملطخة DAPI المسمى مع النجمة البيضاء يفترض أن تتوافق مع موقع الخلايا العصبية Phox2b السلبية afferent خالية من إشارات RNAScope. في النتائج التمثيلية المذكورة أدناه، تم حساب ما لا يقل عن 2000 ملف تعريف عصبي من الكتل الجانجليونية اليسرى واليمينية من 4 مختلفة. أشرطة المقياس = 24 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; Phox2b = يقترن مثل homeobox 2b; Ghsr = مستقبلات غريلين; Cck1r = مستقبلات المرارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية للISH متعددة في الخلايا العصبية العقيدات afferent. تم الحصول على الصور الرقمية لكتلة العصابات المبهمة التمثيلية المسماة بمنظار RNAscope المتعدد ل Phox2b و Cck1r و Ghsr. مع أهداف 20x (A) و 63x (B ، C) لمجهر confocal (Zeiss LSM880). في A, 20× تم خياطة العديد من الصور معا باستخدام برنامج Zen وقدمت إما كقنوات غير مطلقة أو مدمجة. إشارات Phox2b (أحمر) تراكمت على وجه التحديد في الخلايا العصبية afferent تقع في العقدة نودوز. كما هو متوقع، إشارات Cck1r (سماوي) وصفت بشكل مكثف العديد من، ولكن ليس كل، والخلايا العصبية في العقدة نودوز. عند التكبير المنخفض، لا يمكن ملاحظة الخلايا التي تعبر عن مستويات منخفضة من Cck1r أو أي خلايا مع إشارات Ghsr (صفراء) بسهولة. ساعد DAPI (رمادي) في تصور الأنسجة وتحديد الخلايا العصبية المبهمة ذات النواة الكبيرة والملطخة بخفة. تتوافق مجموعة المستندات البيضاء في الصورة المدمجة مع مواقع الصورة المضمنة أدناه. (ب) في التكبير عالية، لمحات Phox2b إيجابية (الأحمر) واضحة. وأعرب العديد من الخلايا أيضا Cck1r ولكن على مستويات مختلفة، تتراوح بين معتدلة إلى عالية جدا. الملف الشخصي "1" هو مثال على خلية Phox2b سلبية لCck1r وGhsr. ملامح "2" و "3" هي خلايا Phox2b مع إشارات Cck1r عالية ومعتدلة، على التوالي. إشارات معتدلة لGhsr (الأصفر) شوهدت في بعض الأحيان في العقدة العقدية الوردية ولكن دائما تقريبا في الخلايا السلبية لPhox2b، كما هو مبين مع الملف الشخصي "4". ومن المثير للاهتمام ، لمحة "4" وأعرب كل من Ghsr وCck1r. كما هو مبين في الشكل التالي، كان Ghsr أكثر وفرة في خلايا Prdm12. (C) مخطط دائري يلخص تقديرات النسبة المئوية لخلايا Phox2b (الحمراء) التي تشارك في التعبير عن أي من Ghsr (الأصفر) أو Cck1r (سماوي) أو كليهما (رمادي). يشار إلى العدد الإجمالي للملفات الجانبية التي تم عدها بجوار المخطط (n = 4 ganglia مختلفة ، اليسار واليمين مجتمعة). تم تجميع النتائج من كل جانب لأنه لم يتم ملاحظة أي اختلافات. أشرطة المقياس = 158 ميكرومتر (A) و 15 ميكرومتر (B). الاختصارات: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; NG = العقدة العقدية؛ JG = العقدة الوداجية; ISH = في التهجين في الموقع؛ Phox2b = يقترن مثل homeobox 2b; Ghsr = مستقبلات غريلين; Cck1r = مستقبلات المرارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:النتائج التمثيلية للخلايا العصبية الوداجي afferent متعددة ISH. تم الحصول على الصور الرقمية لكتلة ganglionic vagal ممثل المسمى مع multix RNAscope Prdm12، Cck1r، وGhsr. صور مع 20x (A) و 63x (B، C) أهداف المجهر confocal (زايس LSM880). في A, 20× تم خياطة العديد من الصور معا باستخدام برنامج Zen وقدمت إما كقنوات غير مطلقة أو مدمجة. Prdm12 نسخة (الأحمر) تراكمت على وجه التحديد في الخلايا العصبية afferent تقع في العقدة الوداجية وفقط عدد قليل من الخلايا العصبية التسلل إلى الجزء الوردي من العقدة نودوز. إشارات Cck1r (سماوي) وصفت بشكل مكثف العقدة العقيدات. في التكبير المنخفض، لا يمكن رؤية الخلايا التي تعبر عن مستويات منخفضة من Cck1r أو أي خلايا مع إشارات Ghsr (صفراء) بسهولة. ساعد DAPI (رمادي) في تصور الأنسجة وتحديد الخلايا العصبية المبهمة ذات النواة الكبيرة والملطخة بخفة. تتوافق المجموعتان الأبيضتان في الصورة المدمجة مع مواقع الصور المضمنة أدناه. (ب, ج) عند التكبير العالي، يمكن تحديد ملامح الخلية الموجبة Prdm12 (الحمراء). كما تم الكشف عن إشارات معتدلة لCck1r في ملامح "1" و "2". الملف الشخصي "3" هو ممثل خلايا Prdm12 سلبية لCck1r أو Ghsr. في C, وينظر إلى إشارات Ghsr (الأصفر) في التشكيل الجانبي التمثيلي "4" ولكن ليس في "5". (D) مخطط دائري يلخص تقديرات النسبة المئوية لخلايا Prdm12 (الحمراء) التي تشارك في التعبير عن أي من Ghsr (الأصفر) أو Cck1r (سماوي) أو كليهما (رمادي). يشار إلى العدد الإجمالي للملفات الجانبية التي تم عدها بجوار المخطط (n = 4 ganglia مختلفة ، اليسار واليمين مجتمعة). تم تجميع النتائج من كل جانب لأنه لم يتم ملاحظة أي اختلافات. أشرطة المقياس = 158 ميكرومتر (A) و 15 ميكرومتر (B, C). الاختصارات: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; NG = العقدة العقدية؛ JG = العقدة الوداجية; ISH = في التهجين في الموقع؛ Prdm12 = PR المجال الزنك الاصبع البروتين 12; Phox2b = يقترن مثل homeobox 2b; Ghsr = مستقبلات غريلين; Cck1r = مستقبلات المرارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العقيق خط ليزر نطاق الكشف قوة كسب متوسط الخط حجم البكسل
أوبال 690 HeNe 633 نانومتر 668-696 نانومتر 2 724 4 1024 × 1024
أوبال 570 DPSS ليزر 561 نانومتر 579-627 نانومتر 15 450 4 1024 × 1024
أوبال 520 أرجون ليزر 488 نانومتر 499-535 نانومتر 6 830 4 1024 × 1024
DAPI ليزر الصمام الثنائي 405 415-502 نانومتر 12 532 4 1024 × 1024

الجدول 1: بارامترات الامتلاك. اختصار: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اخترعت التقنية من ISH في أواخر 1960s42. ومع ذلك، فإنه ليس حتى منتصف 1980s أنه تم تطبيقه للكشف عن mRNAs في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي43،44. وبالنظر إلى عدم تجانس الجهاز العصبي والقضايا المتكررة مع الأجسام المضادة، وتوطين نسخة معينة على المستوى الخلوي لا يزال أداة لا تقدر بثمن. ومع ذلك، ظلت أساليب ISH التقليدية شاقة وحساسة بشكل متفاوت. لحسن الحظ، استخدمت هذه الدراسة إجراء ISH حساسة للغاية تسمى RNAscope، والتي عادة ما يولد أي خلفية ويسمح للكشف عن العديد من النصوص أعرب في مستويات منخفضة45،46. على وجه التحديد ، تم تطبيق RNAScope الفلوري المتعدد للكشف المتزامن عن نصوص Ghsr و Cck1r. تم استخدام عوامل النسخ ، Phox2b و Prdm12 ، كعلامات انتقائية للتمييز بين الخلايا العصبية العقيدة والوداجية ، على التوالي. دون تصور Phox2b وPrdm12، سيكون من الصعب تحديد الخلايا العصبية الوداجي مقابل العقيدات afferent مع اليقين. كما هو موضح أعلاه، تتضمن إحدى الخطوات الحرجة تقنية تشريح متسقة ومناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التحقق من الفلورة الذاتية هو أيضا عامل مهم لأنه يمكن بسهولة أن يكون مخطئا لإشارات RNAScope. وعلاوة على ذلك، ينصح بشدة اختيار معلمات الاستحواذ المناسبة على أساس أنسجة التحكم السلبية. كما ذكر سابقا، المجهر confocal هو طريقة التصوير المفضل مع 20x و 63x (النفط) الأهداف لأن 1) النصوص التي أعرب عنها في مستويات منخفضة و / أو في خلايا متناثرة قد تكون ملحوظة فقط في التكبير عالية. 2) يسمح المجهر Confocal جمع طائرة واحدة التنسيق، وهو أمر مهم بالنظر إلى أن خليتين فوق بعضها البعض قد تظهر خطأ كخلية واحدة عندما صورت من قبل epifluorescence. 3) يسمح أيضا المجهر Confocal معلمات اكتساب أكثر انتقائية ومرنة. يتم توفير معلمات الاستحواذ المذكورة أعلاه كمثال فقط ، ويوصى بالتعديلات اعتمادا على أداة واحدة ، والتكبير (20x أو 63x) ، ومستويات التعبير ، ومستويات الإضاءة الذاتية لأي نسيج معين. وظل إجراء التلطيخ نفسه قريبا جدا من إجراء البروتوكول الموصى به مع تعديلات طفيفة فقط. ومن الواضح أن البروتوكول الموصوف هنا يمكن تطبيقه على الكشف عن أي نصوص، وليس فقط على النصوص GPCRs. ومع ذلك فإن الإجراء الموصوف هنا مفيد بشكل خاص بالنظر إلى القضايا المتكررة المتعلقة بالأجسام المضادة التي أثيرت ضد GPCRs24.

كما سبق مناقشتها15، يتم إرفاق العقدة العقيدة الماوس في بعض الأحيان إلى العقدة عنق الرحم متفوقة من قبل جسر الخلية. قد يؤدي إدراج جسر الخلية هذا إلى نتائج مربكة ، على سبيل المثال ، يتم اكتشاف علامات غير مبهمة في العقدة العقيدية. قد يرغب المحقق في التحقق بشكل منهجي مما إذا كانت العقدة العقيدية مرتبطة بعصابة عنق الرحم المتفوقة أثناء التشريح. خلاف ذلك ، فإن مهارات التشريح غير المتسقة بين ganglia ستدخل التباين التجريبي. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن كلا من الخلايا العصبية بتروسال والعقيدات afferent التعبير Phox2b47. وهكذا، ما أشرنا إليه باسم الخلايا العصبية العقيدة afferent شملت كل من الخلايا العصبية بتروسال والعقيدة. وأخيرا، عند مقارنة دراسات مختلفة، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن أساليب مختلفة من القتل الرحيم يمكن أن يسبب تغييرات في التعبير الجيني48.

من الناحية النظرية، يمكن أن تعزى الفلوروفوريس المستخدمة للكشف بالتبادل إلى أي قناة. ومع ذلك، تم العثور على أوبال 690 لتنبعث منها مستوى منخفض من الفلورية الخضراء. في معظم الظروف، في حالة النصوص المعبر عنها بشكل كبير (على سبيل المثال، Prdm12)، شوهدت الفلورسينس الأخضر غير المرغوب فيه إذا كانت كثافة الليزر عالية جدا. لذلك ينصح أوبال 690 للجينات ذات التعبير المعتدل / منخفضة. إذا كان العمل فقط مع الجينات المعبر عنها للغاية، فمن المستحسن لتخفيف أوبال 690 كذلك (أي، 1/3،000) وعدم التقاط مضان أخضر غير محدد أثناء الحصول على الصورة. إشارات RNAscope هي نقاط منفصلة من ألوان مختلفة ، حتى عندما يتم التعبير عن النصوص داخل نفس ملف تعريف الخلية. ومع ذلك ، بالنسبة للنصوص المعبر عنها للغاية ، قد لا يكون من الممكن رؤية النقاط الفردية ولكن بدلا من ذلك الفلورسينس ملء السيتوبلازم. عندما تنبعث من النقاط مضان ألوان مختلفة، يمكن للمرء أن ينظر في مشكلة مضان غير محدد بسبب، من بين أمثلة أخرى، معلمات الاستحواذ غير كافية و / أو أصباغ داخلية. وأخيرا، يجب عدم استخدام أوبال 570 و 620 في وقت واحد لأن أطياف الانبعاثات تتداخل.

إذا لم تلاحظ إشارات RNAscope لجين معروف بأنه يعبر عنه في الأنسجة ذات الاهتمام ، ينصح بالتحقق من سلامة الأنسجة عن طريق تشغيل مسبار إيجابي متاح (أي بيبتيديل برولييل cis-trans isomerase B جين التدبير المنزلي). DAPI مضادة لاحتواء مفيد أيضا في تحديد جودة الأنسجة. قد تشير النوى المسماة DAPI التي تظهر ممزقة إلى الهضم المفرط أو الأنسجة الثابتة بشكل غير صحيح.

ونتيجة لذلك، تم التعبير عن Ghsr في مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية الوداجية الإيجابية Prdm12. في المقابل، وإلى جانب دراسة سابقة واحدة11،كان GHSR مرنا غائبة تقريبا من الخلايا العصبية العقيدات afferent. ومن المستدل عليه أن مستويات منخفضة من هرمون مرنا التي تم الكشف عنها سابقا من قبل qPCR وISH من المرجح أن يكون بسبب الخلايا العصبية الوداجي afferent30,31,32. أظهرت دراسة سابقة للإشارة إلى الكالسيوم أن 3٪ من الخلايا العصبية المبهمة المستزرعة تستجيب للغريلين49، وهو رقم مشابه بشكل ملحوظ للنسبة المئوية للخلايا العصبية الوداجية المعبرة عن Ghsr. وأعرب Cck1r في العديد من الخلايا العصبية فوكسي2b إيجابية العقيدات afferent و, أكثر إثارة للدهشة, في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الوداجي Prdm12 إيجابية afferent. وباختصار، تبين هذه الورقة نجاح تكييف تقنيات ISH القائمة لتقييم التوزيع الخلوي لغبرات مختارة في الكتلة العقدية الوداجية العقيدية في مجملها.

في الختام ، تم استخدام ISH متعددة للكشف عن وتصور في وقت واحد نصوص لاثنين من GPCRs (Cck1r وGhsr) وعامل نسخ واحد (Phox2b أو Prdm12) في مجمع العقدة المبهم بأكمله من الماوس البالغ. البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن يكون أداة تكميلية لتسلسل الحمض النووي الريبي ، qPCR ، وعلم الأنسجة التقليدي. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على العقد الأخرى ذات الحجم المماثل. كما هو موضح أعلاه، تعتبر معلمات الاستحواذ وعمر الحيوانات واتساق التشريح عوامل مهمة يجب أخذها في الاعتبار أثناء التصميم التجريبي. لذلك ، يمكن أن تقدم معلومات فريدة عن أنماط التعبير الجيني الطبوغرافي في العقدة غير المتجانسة للغاية والصغيرة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد التغيرات في الملامح النسخية للخلايا العصبية الوداجية مقابل الخلايا العصبية المزينة بالودودوز في سياق مختلف الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، التغيرات في حالة التغذية. ويمكن أيضا أن تستخدم لمقارنة الماكياج الكيميائي العصبي من الخلايا العصبية المبهمة في الأنواع الحيوانية المستخدمة عادة في البحوث قبل السريرية, بما في ذلك الرئيسيات والخنازير50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل التشريح العصبي / الأنسجة / الدماغ حقن الأساسية الممولة من منحة المعاهد القومية للصحة #5P01DK119130-02. الكتاب يود أن يعترف بمساعدة UT جنوب غرب مرفق تصوير الخلايا الحية (برئاسة الدكتور فيلبس) وموظفيها (Abhijit بوغدي ومارسيل Mettlen) ، بدعم جزئي من منحة NIH #1S10OD021684-01 ، وهو مورد مشترك لمركز هارولد سيمونز للسرطان ، بدعم جزئي من منحة دعم مركز السرطان NCI ، P30 CA142543.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
20x SSC Invitrogen AM9763
-80°C freezer PHCBI MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021 Adobe photo and design software
Baking oven Thermo Scientific Model:658
Confocal microscope Zeiss LSM880 Airyscan
Cover glass Brain Research Laboratories 2460-1.5D
Cryostat Leica CM 3050 S
Dumont #5 Forceps F.S.T. 11252-20
Ecomount Biocare Medical EM 897L mounting medium
HybEZ oven hybridization oven
Hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
ImageJ-Fiji NIH
Large scissors Henry Schein 100-7561
Micro centrifuge tubes VWR 20170-333
Minipump variable flow Fisher Scientific 13-876-1
Opal 520 Akoya biosciences FP1 1487001KT Fluorescent biomarker
Opal 570 Akoya biosciences FP1 1488001KT Fluorescent biomarker
Opal 690 Akoya biosciences FP1 1497001KT Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACD /Bio-Techne 323100 multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 ACD /Bio-Techne 313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB ACD /Bio-Techne 310043
RNAscope probe Mouse Ghsr ACD /Bio-Techne 426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 ACD /Bio-Techne 407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 ACD /Bio-Techne 524371-C2
RnaseZap Sigma R2020 Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors Millipore Sigma Z265977
Superfrost Plus slides Fisherbrand 1255015
Tissue Tek OCT medium Sakura 4583
User manual ACD 323100 USM
Vannas Spring Scissors Roboz RS 5620
ZEN Imaging Software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).

Tags

علم الأعصاب، العدد 175، استئصال الأعصاب، الإشارات، الأنسجة، النسخ، مستقبلات عبر الميمبران، الجهاز العصبي المحيطي، التشريح، المجهر الكونفولوجي، الفلوري
الكشف عن G البروتين إلى جانب مستقبلات التعبير في الخلايا العصبية Vagal الماوس Afferent باستخدام Multix <em>في الموقع</em> التهجين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bob-Manuel, J., Gautron, L.… More

Bob-Manuel, J., Gautron, L. Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (175), e62945, doi:10.3791/62945 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter