Multipleks in situ hibridizasyon (ISH), yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki G protein bağlantılı reseptör ve bir transkripsiyon faktörü için transkriptleri aynı anda görselleştirmek için kullanıldı. Bu protokol, vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.
Bu çalışmada, fare juguler-nodose gangliyonunun multipleks in situ hibridizasyonu (ISH) için bir protokol açıklanmaktadır ve özellikle G protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) ekspresyonunu tespit etmeye vurgulanmaktadır. Formalin-sabit juguler-nodose gangliyonları, iki temsili GPCR’nin (kolesistokin ve ghrelin reseptörleri) ifadesini nodose (eşleştirilmiş homeobox 2b, Phox2b) veya juguler afferent nöronların (PR etki alanı çinko parmak proteini 12, Prdm12) bir işaret geni ile birlikte aynı anda tespit etmek için RNAscope teknolojisi ile işlendi. Etiketli gangliyonlar, yukarıda belirtilen transkriptlerin dağılım ve ifade kalıplarını belirlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Kısaca, Phox2b afferent nöronların kolesistokinin reseptörü (Cck1r) bolca ifade edildiği, ancak ghrelin reseptörü (Ghsr) ifade etmediği bulunmuştur. Prdm12 afferent nöronlarının küçük bir alt kümesinin de Ghsr ve/veya Cck1r’i ifade ettiği bulunmuştur. Bu makalede açıklanan yaklaşım, bilim adamlarının vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmalarına yardımcı olabilir.
Vagal afferentlerin hücre gövdeleri juguler, petrosal ve nodose gangliyon1,2,3‘te bulunur. Aksonları vagus sinirinin birkaç dalı aracılığıyla kraniyoserikal, torasik ve abdominal bölgelere birlikte seyahat eder4,5,6,7. İçsel uçlarından, vagal afferentler çok çeşitli fizyolojik ve zararlı uyaranlara yanıt verebilir8,9,10. Bununla birlikte, vagal algılamada yer alan sinyal moleküllerinin ve reseptörlerin dağılımı kötü karakterize olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni kısmen vagal gangliyonların, küçük boyutlarına rağmen, çok sayıda GPCR 8 , 11 , 12,13dahil olmak üzere geniş bir reseptör spektrumunu ifade etmeleridir. Ayrıca, vagal afferent nöronlar doğası gereği heterojendir ve farklı moleküler profiller görüntüler14. Konuyu karmaşıklaştırmak için, juguler, petrosal ve nodose gangliyonları fareye bağlanır ve böylece tek bir gangliyonik kütle oluşturur. Son olarak, hayvanların bir alt kümesinde, nodose ganglionu sempatik üstün servikal ganglion15‘e bağlanır.
Geçmişte, araştırmacılar vagal afferent nöronların nörokimyasal makyajını incelemek için immünhistokimyaya başvurdular16,17,18. Doğrulanmış antikorların kullanılması immünostokimya yararlı olmakla birlikte, immünohistokimyasal çalışmaların sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. Örneğin, GPCR’lere karşı spesifik antikorları tanımlamaya yönelik çok sayıda çaba başarısız oldu19,20,21 , 22,23,24,25, araştırmacıların GPCR’lere karşı antikorların çoğunluğunun güvenilmez olduğu sonucuna varmasına yol açtı. Bu sorunları atlatmak için, kemirgen vagal gangliyonik kütle26 , 27 , 28,29gen ekspresyonini değerlendirmek için nicel PCR (qPCR) yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, qPCR kullanılarak gen ekspresyonunun incelenmesi, mekansal bilgi kaybı pahasına gerçekleşir. Özellikle, kaç hücrenin veya hangi hücre tiplerinin belirli bir ilgi genini (örneğin, nodose ve juguler hücreler) ifade ettiği tahmin edilemez. Tekrarlayan sorunlar ayrıca bitişik dokularla kontaminasyon ve diseksiyon sırasında vagus sinirinin değişken uzunluklarının, üstün servikal ve juguler gangliyonların dahil edilmesini içerir15. Yukarıdaki zorlukların bir sonucu olarak, tartışmalar vagal afferent nöronlarda birkaç GPCR’nin ekspresyon ve dağılımını çevreler. Özellikle şaşırtıcı bir örnek ghrelin reseptörü (Ghsr) ile ilgilidir. Bazı çalışmalar vagal afferent nöronlarda bu reseptörün yaygın ekspresyonunun30,31,32, diğerleri Ghsr mRNA’nın nodose ganglion 11,14’teneredeyse tespit edilemediğini bulmuşlardır. Bu nedenle vagal gangliyonik kütlede Ghsr mRNA’nın ayrıntılı haritalandırılması garanti edilir.
In situ hibridizasyon (ISH) vagal gangliyonik kütle7, 11 ,12,33,34,35gen ekspresyon kalıplarını değerlendirmek için de kullanılmıştır. RNA tabanlı teknikler çoğu durumda antikor bazlı tekniklerden daha güvenilir ve spesifik kaldığından36,37, ISH çalışmaları vagal afferent nöronların nörokimyasal kodlamasının daha iyi anlaşılması için değerli olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, geleneksel ISH tekniklerinin kendileri uyarı olmadan değildir. Radyoaktif ISH hassastır, ancak arka plan oluşturur ve hantalkalır 38. Radyoaktif olmayan ISH daha az karmaşık ama aynı zamanda daha az hassas38. Buna karşılık, son zamanlarda geliştirilen RNAscope ISH yöntemi son derece hassastır ve en az arka planoluşturur 39. Mevcut çalışma, farenin vagal afferent nöronlarında GPCR’lerin tespitine multipleks floresan RNAscope uyguladı. Ghsr’nin dağılımını haritalamaya odaklandık ve dağıtımını nodose ganglion34’teifade edildiği bilinen başka bir GPCR olan kolesistokinin reseptörü (Cck1r) ile karşılaştırdık. Son olarak, eşleştirilmiş homeobox 2b (Phox2b) ve PR etki alanı çinko parmak proteini 12 (Prdm12) olmak üzere iki transkripsiyon faktörü, nodose ve juguler afferent nöronlar için seçici belirteçler olarak kullanılmıştır, sırasıyla14. Phox2b veya Prdm12’yi görselleştirmeden, jugular vs. nodose afferentlerini kesin olarak tanımlamak zor olacaktır. Makale boyunca potansiyel teknik tuzaklar da tartışılmaktadır.
ISH tekniği 1960’ların sonunda icat edildi42. Ancak, 1980’lerin ortalarına kadar merkezi ve periferik sinir sistemlerinde mRNA’ların tespiti için uygulanmadı43,44. Sinir sisteminin heterojenliği ve antikorlarla ilgili tekrarlayan sorunlar göz önüne alındığında, belirli bir transkriptin hücresel düzeyde lokalize edilmesi paha biçilmez bir araç olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, geleneksel ISH yöntemleri zahmetli v…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH grant #5P01DK119130-02 tarafından finanse edilen Nöroanatomi/Histoloji/Beyin Enjeksiyon Çekirdeği tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi tarafından desteklenen Harold C. Simmons Kanser Merkezi’nin Ortak Kaynağı olan NIH Grant #1S10OD021684-01 tarafından desteklenen UT Southwestern Canlı Hücre Görüntüleme Tesisi (Dr. Phelps başkanlığındaki) ve personelinin (Abhijit Bugde ve Marcel Mettlen) yardımını kabul etmek istiyor. P30 CA142543.
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
-80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
HybEZ oven | hybridization oven | ||
Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
ImageJ-Fiji | NIH | ||
Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
User manual | ACD | 323100 USM | |
Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
ZEN Imaging Software | Zeiss |