Summary
L’hybridation multiplex in situ (ISH) a été utilisée pour visualiser simultanément les transcriptions de deux récepteurs couplés à la protéine G et d’un facteur de transcription dans l’ensemble du complexe ganglionnaire vagal de la souris adulte. Ce protocole pourrait être utilisé pour générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.
Abstract
Cette étude décrit un protocole pour l’hybridation multiplex in situ (ISH) des ganglions jugulaires-noduoses de souris, avec un accent particulier sur la détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les ganglions jugulaires-noduoses fixés au formol ont été traités avec la technologie RNAscope pour détecter simultanément l’expression de deux RCPG représentatifs (récepteurs de la cholécystokinine et de la ghréline) en combinaison avec un gène marqueur de nodose (homéobox appariée 2b, Phox2b) ou de neurones afférents jugulaires (protéine de doigt de zinc du domaine PR 12, Prdm12). Les ganglions marqués ont été imagés à l’aide de la microscopie confocale pour déterminer la distribution et les modèles d’expression des transcriptions susmentionnées. En bref, les neurones afférents de Phox2b ont été trouvés pour exprimer abondamment le récepteur de la cholécystokinine (Cck1r) mais pas le récepteur de la ghréline (Ghsr). Un petit sous-ensemble de neurones afférents Prdm12 a également été trouvé pour exprimer Ghsr et / ou Cck1r. Les mises en garde techniques potentielles dans la conception, le traitement et l’interprétation du multiplex ISH sont discutées. L’approche décrite dans cet article peut aider les scientifiques à générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.
Introduction
Les corps cellulaires des afférences vagales sont contenus dans les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses1,2,3. Leurs axones voyagent ensemble via plusieurs branches du nerf vague vers les territoires craniocervicaux, thoraciques et abdominaux4,5,6,7. À partir de leurs terminaisons viscérales, les afférences vagales peuvent répondre à un large éventail de stimuli physiologiques et nocifs8,9,10. Cependant, la distribution des molécules de signalisation et des récepteurs impliqués dans la détection vagale reste mal caractérisée. C’est en partie parce que les ganglions vagales, malgré leur petite taille, expriment un large spectre de récepteurs, y compris un grand nombre de RCPG8,11,12,13. De plus, les neurones afférents vagals sont intrinsèquement hétérogènes et présentent des profils moléculaires distincts14. Pour compliquer la question, les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses sont attachés dans la souris, formant ainsi une seule masse ganglionnaire. Enfin, chez un sous-ensemble d’animaux, le ganglion nodosé est attaché au ganglion cervical supérieur sympathique15.
Dans le passé, les chercheurs se sont tournés vers l’immunohistochimie pour étudier la composition neurochimique des neurones afférentsvagals 16,17,18. Bien que l’immunohistochimie utilisant des anticorps validés soit utile, les résultats des études immunohistochimiques doivent être interprétés avec prudence. Par exemple, de nombreux efforts pour identifier des anticorps spécifiques contre les RCPG ont échoué19,20,21,22,23,24,25, ce qui a conduit les chercheurs à conclure que la majorité des anticorps contre les RCPG ne sont pas fiables. Pour contourner ces problèmes, la PCR quantitative (qPCR) a été largement utilisée pour évaluer l’expression des gènes dans la masse ganglionnaire vagale du rongeur26,27,28,29. Cependant, l’examen de l’expression des gènes à l’aide de la qPCR se fait au prix d’une perte d’information spatiale. En particulier, il est impossible de prédire combien de cellules ou quel(s) type(s) cellulaire(s) expriment un gène particulier d’intérêt (p. ex., nodose vs cellules jugulaires). Les problèmes récurrents comprennent également la contamination par les tissus adjacents et l’inclusion de longueurs variables du nerf vague, des ganglions cervicaux supérieurs et jugulaires pendant la dissection15. En raison des difficultés ci-dessus, la controverse entoure l’expression et la distribution de plusieurs RCPG dans les neurones afférents vagals. Un exemple particulièrement déroutant concerne le récepteur de la ghréline (Ghsr). Alors que certaines études ont trouvé une expression répandue de ce récepteur dans les neurones afférents vagaux30,31,32, d’autres ont trouvé que l’ARNm Ghsr était presque indétectable dans le ganglion nodosé11,14. Une cartographie détaillée de l’ARNm Ghsr dans la masse ganglionnaire vagale est donc justifiée.
L’hybridation in situ (ISH) a également été utilisée pour évaluer les modèles d’expression génique dans la masse ganglionnaire vagale7,11,12,33,34,35. Parce que les techniques à base d’ARN restent plus fiables et spécifiques que les techniques à base d’anticorps dans la plupart des circonstances36,37, les études ISH se sont avérées précieuses pour une meilleure compréhension du codage neurochimique des neurones afférents vagal. Néanmoins, les techniques ISH traditionnelles elles-mêmes ne sont pas sans réserves. L’ISH radioactif est sensible mais génère un fond et reste encombrant38. L’ISH non radioactif est moins compliqué mais aussi moins sensible38. En revanche, la méthode RNAscope ISH récemment développée est très sensible et génère un arrière-plan minimal39. La présente étude a appliqué un ARN fluorescent multiplex à la détection de RCPG dans les neurones afférents vagaux de la souris. Nous nous sommes concentrés sur la cartographie de la distribution de Ghsr et avons comparé sa distribution à celle du récepteur de la cholécystokinine (Cck1r), un autre RCPG bien connu pour être exprimé dans le ganglion nodostique34. Enfin, les deux facteurs de transcription, l’homéobox 2b de type apparié (Phox2b) et la protéine de doigt de zinc du domaine PR 12 (Prdm12), ont été utilisés comme marqueurs sélectifs pour les neurones nodose et afférent jugulaire, respectivement14. Sans visualiser Phox2b ou Prdm12, il serait difficile d’identifier avec certitude les afférences jugulaires par rapport aux nodoses. Les pièges techniques potentiels sont également discutés tout au long de l’article.
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Protocol
REMARQUE: Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles de type sauvage sur un fond pur C57BL / 6J. Au total, 4 souris ont été utilisées pour le multiplex ISH. Toutes les souris avaient environ 8 semaines au moment du sacrifice. Une souris mâle (âgée d’environ un an) a également été utilisée pour démontrer une fluorescence endogène associée au vieillissement. Les animaux étaient logés dans des cages ventilées à l’intérieur d’une installation de barrière avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical UT Southwestern a examiné et approuvé les procédures décrites ci-dessous. Des détails sur les réactifs et les outils peuvent être trouvés dans le tableau des matériaux.
1. Prélèvement d’échantillons
- Le jour du sacrifice, administrer une surdose d’hydrate de chloral (500 mg / kg, i.p.) aux souris. Perfuser les souris profondément anesthésiées de manière transcardique à l’aide d’une pompe péristaltique avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de 50 mL de formol à 10% à température ambiante.
REMARQUE: Ceci est fait dans une hotte pour empêcher l’inhalation de formol. - Comme les ganglions nodoses, pétrosaux et jugulaires sont fusionnés pour former une seule masse ganglionnaire chez la souris15,collectez soigneusement toute la masse ganglionnaire vagale de chaque côté (gauche et droite) à l’aide d’une lunette de dissection et de fines ciseaux et pinces à ressort (voir le tableau des matériaux).
- Lorsque vous décapitez la souris avec une paire de gros ciseaux (voir la Table des matériaux),évitez d’écraser le tronc cérébral.
- Suite à une approche de dissection décrite précédemment chez le rat40,retirer les muscles sternohyoïdes et omohyoïdes latéralement à la trachée avec de petites pinces (Table des matériaux) pour exposer l’os occipital. Nettoyez toute la région du muscle, du tissu adipeux et du tissu conjonctif jusqu’à ce que l’artère carotide, le nerf vague, le nerf hypoglosse et le foramen magnum soient visibles. Couper tout le nerf hypoglosse avec de petits ciseaux à ressort (Table des matériaux).
- Recherchez le ganglion nodosé comme une masse translucide proche du foramen magnum15. À l’aide de petits ciseaux (Table des matériaux), cassez soigneusement l’os occipital pour exposer davantage le ganglion jugulaire. Recherchez les mélanocytes noirs à la surface de la jugulaire comme point de repère visuel.
- Couper les attaches nerveuses entre la masse ganglionnaire vagale et extraire toute la masse ganglionnaire en tirant doucement sur l’extrémité périphérique du nerf vague tout en coupant simultanément le ganglion jugulaire vers le tronc cérébral avec de petits ciseaux à ressort (Table des matériaux).
- Enlevez le tissu conjonctif et la graisse collant au nerf vague et à la masse ganglionnaire autant que possible.
- Comme il est facile de perdre un ganglion lors du transfert d’un tube à l’autre, gardez ~ 0,5 cm du nerf vague pour faciliter la manipulation et la localisation des échantillons.
- Placer les ganglions à l’aide de pinces fines dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et incuber à 4 °C dans du formol pendant 24 h et avec 30 % de saccharose pendant encore 24 h.
- Positionnez les ganglions à l’intérieur d’une petite goutte (~4 mm Ø) de température de coupe optimale (OCT) sur un morceau de papier d’aluminium. Ensuite, congelez l’échantillon sur un lit de glace carbonique.
- Découpez les échantillons avec un cryostat à -20 °C en sections de 14 μm d’épaisseur et collectez sur des lames de microscope en verre à 3 séries espacées de 42 μm.
REMARQUE : Évitez de placer des sections près des bords de la diapositive. Pour économiser les réactifs, gardez les sections de tissu aussi serrées que possible, mais sans chevauchement. - Conservez les échantillons dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires pour l’ISH pendant au moins 6 mois.
REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1 pour le dépannage de la fluorescence endogène.
2. Prétraitement et ISH
- Avant le jour des expériences, la verrerie de laboratoire en autoclave à utiliser pour l’ISH, y compris la coloration de la vaisselle et le lavage des pots tampons.
REMARQUE: Bien que travailler dans des conditions sans RNase ne soit pas critique, portez des gants en tout temps. Gardez les flacons de solution de décontamination de la RNase (Table des matériaux) à portée de main en cas de suspicion de contamination. - Le premier jour, amenez les toboggans à température ambiante sur un banc spécifiquement dédié à l’ISH. Rincez les lames dans 1x PBS et faites-les cuire pendant 30 minutes à 60 °C dans un four à pâtisserie(Table des matériaux).
- Post-fixer les lames dans du formol à 4% pendant 15 min à 4 °C.
- Amenez les réactifs dans le kit multiplex(Table des matériaux)à température ambiante.
- Déshydratez les lames en 50%, 70% et 100% d’éthanol pendant 5 min chacune. Appliquer la solution H2O2 sur les échantillons pendant 10 min, puis rincer à l’eau double distillée (ddH2O).
- Traiter les échantillons avec le réactif de récupération cible pendant 5 min, rincer dans du ddH2O suivi d’éthanol à 100 % et sécher à l’air. À l’aide d’un stylo hydrophobe, créez une barrière autour des échantillons.
REMARQUE: N’appliquez pas la barrière hydrophobe trop près des sections de tissu. - Appliquer la protéase pendant 30 min à 40 °C dans un four d’hybridation (Table des matériaux).
- En attendant, préchauffer les sondes à 40 °C et les refroidir à température ambiante avant utilisation. Incuber les lames avec la combinaison souhaitée de sondes cibles (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; ou Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) pendant 2 h à 40 °C dans un four d’hybridation.
- Incuber le tissu témoin négatif avec la sonde C1 cible de la dihydrodipicolinate réductase (DapB) pendant 2 h à 40 °C dans un four d’hybridation.
- Rincez les lames dans un tampon de lavage et conservez-les pendant la nuit dans 5x le citrate de sodium salin (SSC) à température ambiante. Pour plus de commodité, divisez l’expérience en deux jours. Le lendemain, rincez les lames avec un tampon de lavage et incuvrez-les avec des réactifs d’amplification énumérés ci-dessous (voir le manuel d’utilisation dans le tableau des matériaux).
- Appliquer AMP1 (30 min à 40 °C), AMP2 (30 min à 40 °C) et AMP 3 (15 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
- Dissoudre chaque colorant opale(Table des matériaux)dans du sulfoxyde de diméthyle et conserver les solutions à 4 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
- Pour le canal 1, incuber les lames avec HRP-C1 (15 min à 40 °C) et Opal 520 (couleur verte ; dilution 1/1 500 ; 30 minutes à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
- Pour le canal 2, incuber les lames avec HRP-C2 (15 min à 40 °C) et Opal 570 (couleur jaune ; dilution 1/1 500 ; pendant 30 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
- Pour le canal 3, incuber les lames avec HRP-C3 (15 min à 40 °C) et Opal 690 (couleur rouge foncé ; dilution 1/1 500 ; pendant 30 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
- Lavez les lames et exposez-les au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 30 s.
- Appliquez immédiatement le support de montage sur chaque lame et placez un couvercle sur la section de tissu.
- Gardez les tissus à l’horizontale dans un porte-lames à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
3. Microscopie et analyse de données
REMARQUE: Les données ISH multiplex peuvent être imagées avec une large gamme d’instruments avec les filtres appropriés. Cependant, une méthode d’imagerie préférée est la microscopie confocale avec des objectifs 20x et 63x (huile); se référer à la discussion pour les raisons. Reportez-vous à la Figure 2 pour déterminer le rapport signal/bruit optimal.
- Utilisez un microscope confocal équipé de lignes laser de 488, 561 et 633 nm. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants (voir tableau 1): Opale 690 (HeNe 633 nm, plage de détection 668-696 nm, puissance 2,0, gain 724) ; Opal 570 (laser DPSS 561 nm, plage de détection 579-627 nm, puissance < 15,0,
- Pour améliorer la qualité des images, acquérez avec une moyenne de ligne de 4 et une taille de pixel d’au moins 1024 x 1024.
REMARQUE: Les paramètres ci-dessus ne sont fournis qu’à titre d’exemple, et des modifications sont recommandées en fonction d’un instrument, du grossissement (20x ou 63x), des niveaux d’expression et des niveaux endogènes de fluorescence pour un tissu donné.- Une fois satisfait des paramètres d’acquisition, collectez les images en utilisant les mêmes paramètres. Attribuez de fausses couleurs à chaque canal pour faciliter la visualisation.
REMARQUE: Par exemple, rouge (Phox2b ou Prdm12), cyan (Cck1r), jaune (Ghsr) et gris (DAPI).- Effectuez le comptage cellulaire à l’aide des images numériques en identifiant le contour des profils RNAscope-positif avec un noyau légèrement coloré avec DAPI. Calculer le pourcentage de profils RNAscope-positifs exprimant chaque transcription [Figure 3A-C].
- Pour améliorer la rigueur et la précision des estimations, comptez au moins 2 000 profils neuronaux d’au moins 4 animaux différents. Effectuez le comptage des ganglions gauche et droit séparément.
- Entrez les données dans un graphique à secteurs avec le nombre total de profils comptés.
- Utilisez un logiciel d’imagerie pour acquérir des images et assembler des images 20x. Utilisez ImageJ-Fiji et un autre logiciel de photo et de conception pour générer les plaques finales. Appliquez des réglages de contraste et de luminosité uniformément à toutes les images.
- Pour améliorer la qualité des images, acquérez avec une moyenne de ligne de 4 et une taille de pixel d’au moins 1024 x 1024.
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Representative Results
Bien que RNAScope puisse être appliqué à des animaux de tout âge, sexe ou bagage génétique, il est conseillé de travailler avec de jeunes adultes (<3 mois). En effet, les artefacts fluorescents (par exemple, la lipofuscine) sont des résultats courants dans les neurones d’animaux plus âgés41. Les ganglions fixés au formol de souris plus âgées contiennent souvent une fluorescence endogène étonnamment intense qui peut facilement être confondue avec une véritable coloration(Figure 1A,B). Dans tous les cas, il est conseillé de vérifier les niveaux de fluorescence endogène dans le tissu avant le traitement.
Il est important de déterminer les paramètres d’acquisition optimaux et le rapport signal/bruit pour chaque laser et grossissement à l’aide de sections d’un tissu témoin négatif incubé avec la sonde négative DapB comme le montre la Figure 2A,B. Parce que DapB est un gène procaryote, les signaux de l’ARN doivent être complètement absents du tissu témoin négatif. Mis à part les débris et les cristaux occasionnels, une fluorescence négligeable est observée sur les images de tissus témoins négatifs, à condition que les paramètres d’acquisition utilisés soient appropriés. Cependant, au-dessus d’une certaine puissance et d’un certain gain laser, un arrière-plan indésirable et des points fluorescents aléatoires commencent à apparaître (Figure 2C). Un autre objectif de minimiser la puissance du laser est d’éviter la saturation des pixels et le photoblanchiment. Aucun problème majeur de blanchiment par fluorescence n’a été observé lors du travail avec les paramètres ci-dessus. Si un tel problème peut survenir, il est conseillé de couvrir le tissu avec un support de montage pour les cellules marquées par fluorescence (Table des matériaux) en plus de réduire autant que possible la puissance du laser (voir les paramètres recommandés dans le tableau 1).
La technique de l’ARN a été appliquée pour la détection de 3 gènes dans des coupes tissulaires de la masse ganglionnaire vagale de la souris (Figure 3 et Figure 4). Un profil a été considéré comme positif pour Ghsr et/ou Cck1r lorsque des points jaunes et/ou cyan, respectivement, ont été vus superposant un profil rempli de points rouges(Figure 3A-C). L’exemple donné à la figure 3 montre de nombreux profils contenant à la fois des transcriptions Phox2b et Cck1r (Figure 3D). Phox2b a été utilisé pour identifier les neurones afférents nodosés. Signaux Phox2b abondants accumulés dans les neurones du ganglion nodosé (Figure 4A, B). Des signaux Cck1r ont été détectés dans environ 52 % des cellules Phox2b(Figure 4C). Il convient de noter que les niveaux d’expression de Cck1r variaient considérablement d’une cellule à l’autre, allant d’un marquage modéré (~ 20 points par profil) à un marquage intense (cytoplasme rempli). En revanche, les signaux pour Ghsr étaient extrêmement clairsemés dans le ganglion nodosé(Figure 4A,B). On estime que seulement 0,65 % des cellules Phox2b positives étaient également positives pour les transcriptions Ghsr(Figure 4C). Les cellules exprimant Ghsr sont souvent co-exprimées en Cck1r. Une étude visuelle des tissus n’a pas révélé de différences évidentes entre les ganglions gauche et droit. Les signaux ISH étaient pratiquement absents des zones dépourvues de neurones (p. ex. épineurium et tractus fibreux).
Prdm12 a été utilisé pour identifier les neurones afférents jugulaires. Comme prévu, l’expression de Prdm12 a été fortement enrichie dans les neurones du ganglion jugulaire et quelques neurones infiltrant la partie rostrale du ganglion nodossé (Figure 5A-C). Fait intéressant, les signaux Cck1r ont été détectés dans un sous-ensemble de cellules Prdm12(Figure 5B,C). Un peu moins de 9 % des neurones Prdm12 positifs ont également exprimé Cck1r(Figure 5D). Cependant, le ganglion jugulaire ne contient que des cellules avec des niveaux modérés de Cck1r (<20 points par cellules) plutôt que les cellules fortement marquées Cck1r-positives que l’on trouve couramment dans le ganglion nodosé. Les cellules Ghsr-positives étaient significativement plus répandues dans la jugulaire que dans le nodose(Figure 5C). Environ 3 % des cellules Prdm12 étaient également Ghsr-positives(Figure 5D). Fait intéressant, 1% de tous les Prdm12 co-exprimés à la fois Ghsr et Cck1r. Les niveaux d’expression de Ghsr étaient toujours modérés (<20 points par cellule). Aucun signal ISH n’a pu être vu dans les zones dépourvues de neurones.
Figure 1: Dépannage des problèmes de fluorescence endogène. (A, B) Fluorescence endogène dans le ganglion nodose/jugulaire d’une souris vieillissante (~1 an). Les images numériques ont été acquises par microscopie confocale en utilisant les lignes laser indiquées dans les couleurs et les paramètres d’acquisition identiques à ceux utilisés pour le multiplex ISH avec des souris plus jeunes (voir plus loin). Il est important de noter que le tissu fixe n’a pas été traité autrement que par le stockage à -80 °C et l’exposition au DAPI. Comme le montre A, un niveau significatif de fluorescence indésirable est observé dans les cellules neuronales et non neuronales, en particulier lorsqu’elles sont exposées au laser 488 nm (vert). Il s’agit d’une découverte courante en histologie, qui justifie l’évaluation de la fluorescence endogène avant l’analyse histologique. (B) À un grossissement plus élevé, la fluorescence ressemblait à des pigments de lipofuscine qui s’accumulent souvent dans les cellules vieillissantes et pourraient facilement être confondus avec de véritables signaux d’immunoréactivité et / ou d’ARNScope. Barres d’échelle = 158 μm (A) et 15 μm (B). (B). Abréviations: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; NG = ganglion nodosé; ISH = hybridation in situ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Détermination du rapport signal/bruit optimal. (A, B) Contrôle négatif consistant en la détection RNAScope du gène procaryote DapB. Notez que la fluorescence endogène dans le ganglion nodosé d’une souris jeune adulte est minime et que l’incubation avec la sonde DapB n’a pas donné de signaux. Les paramètres d’acquisition étaient identiques à ceux utilisés pour le multiplex ISH. Cela montre que la procédure RNAScope elle-même ne produit pas de fond significatif si les paramètres d’acquisition sont choisis avec soin. (C) Images numériques du même tissu acquis à puissance croissante laser et gain avec le laser 488 nm. Notez comment un fond vert flou et des points occasionnels apparaissent au-dessus d’une certaine puissance et d’un certain gain laser. Ainsi, il est important de choisir soigneusement les paramètres d’acquisition pour chaque laser en fonction de la quantité de fluorescence non spécifique obtenue dans le tissu témoin négatif. Barres d’échelle = 158 μm (A) et 15 μm (B, C). Abréviations : DapB = dihydrodipicolinate réductase ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; NG = ganglion nodosé; ISH = hybridation in situ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Identification et comptage des profils positifs. (A) Image numérique représentative des profils marqués Phox2b (rouge) dans la partie rostrale du ganglion nodosé. Dans cet exemple, un total de 18 profils cellulaires (étiquetés comme 1 à 18) ont été identifiés. Notez que la coloration DAPI aide en outre à localiser les neurones, qui présentaient généralement un noyau grand et rond avec une légère coloration DAPI. En revanche, les noyaux des cellules non neuronales sont brillamment marqués, allongés et de plus petite taille. Dans l’ensemble, les signaux RNAScope étaient conformes à la distribution et à la forme des cellules neuronales plutôt que non neuronales. (B) Deux neurones Ghsr-positifs marqués (jaune) sont montrés (profils 19 et 20). Les signaux Ghsr étaient clairsemés et difficiles à voir. Par conséquent, la légèreté et la saturation des signaux jaunes ont été améliorées de manière sélective et uniforme dans les logiciels photo. (C) Au total, neuf profils marqués Cck1r (cyan) sont identifiés (étiquetés comme 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 et 19). Notez comment l’intensité des signaux Cck1r variait considérablement d’une cellule à l’autre. Par exemple, le profil 11 ne contient que quelques signaux positifs, alors que le profil 7 est presque rempli de signaux Cck1r. (D) Une vue fusionnée de tous les canaux a permis d’identifier des modèles de colocalisation. De nombreux profils Phox2b positifs ont également co-exprimé Cck1r (par exemple, les profils 2, 8 et 14), comme en témoignent les points RNAScope rouges et cyan dans le même profil cellulaire. En revanche, les profils Phox2b positifs n’exprimaient pas de transcriptions Ghsr (profils 19 et 20). Cependant, une cellule Ghsr-positive a également exprimé de faibles niveaux de Cck1r (profil 19). Les deux grands noyaux colorés par DAPI marqués d’un astérisque blanc correspondent vraisemblablement à l’emplacement des neurones afférents Phox2b négatif dépourvus de signaux RNAScope. Dans les résultats représentatifs décrits ci-dessous, au moins 2 000 profils neuronaux ont été comptés à partir des masses ganglionnaires gauche et droite de 4 animaux différents. Barres d’échelle = 24 μm. Abréviations : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; Phox2b = homéobox appariée 2b; Ghsr = récepteur de la ghréline; Cck1r = récepteur de la cholécystokinine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Résultats représentatifs de l’ISH multiplex dans les neurones afférents du nodose. Images numériques d’une masse ganglionnaire vagale représentative marquée avec un ARN multiplex pour Phox2b, Cck1r et Ghsr. Les images ont été acquises avec les objectifs 20x(A)et 63x(B, C)d’un microscope confocal (Zeiss LSM880). Dans A,20× plusieurs images ont été assemblées à l’aide du logiciel Zen et présentées sous forme de canaux non mélangés ou fusionnés. Signaux Phox2b (rouge) spécifiquement accumulés dans les neurones afférents situés dans le ganglion nodosé. Comme prévu, les signaux Cck1r (cyan) ont intensément marqué de nombreux neurones, mais pas tous, dans le ganglion nodosé. À faible grossissement, les cellules exprimant de faibles niveaux de Cck1r ou toute cellule avec des signaux Ghsr (jaune) ne pouvaient pas être observées facilement. DAPI (gris) a aidé à visualiser le tissu et à identifier les neurones afférents vagals avec un noyau grand et légèrement coloré. L’encart blanc de l’image fusionnée correspond aux emplacements de l’image incluse ci-dessous. (B) À fort grossissement, les profils Phox2b positifs (rouge) sont évidents. De nombreuses cellules ont également exprimé Cck1r mais à des niveaux variables, allant de modéré à très élevé. Le profil « 1 » est un exemple de cellule Phox2b négative pour Cck1r et Ghsr. Les profils « 2 » et « 3 » sont des cellules Phox2b avec des signaux Cck1r élevés et modérés, respectivement. Des signaux modérés pour Ghsr (jaune) ont parfois été observés dans le ganglion nodosé rostral, mais presque toujours dans les cellules négatives pour Phox2b, comme le montre le profil « 4 ». Fait intéressant, le profil « 4 » exprimait à la fois Ghsr et Cck1r. Comme le montre la figure suivante, Ghsr était plus abondant dans les cellules Prdm12. (C) Graphique circulaire résumant les estimations du pourcentage de cellules Phox2b (rouge) co-exprimant ghsr (jaune), Cck1r (cyan), ou les deux (gris). Le nombre total de profils comptés est indiqué à côté du graphique (n = 4 ganglions différents, à gauche et à droite combinés). Les résultats de chaque côté ont été regroupés parce qu’aucune différence n’a été remarquée. Barres d’échelle = 158 μm (A) et 15 μm (B). Abréviations : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; NG = ganglion nodosé; JG = ganglion jugulaire; ISH = hybridation in situ; Phox2b = homéobox appariée 2b; Ghsr = récepteur de la ghréline; Cck1r = récepteur de la cholécystokinine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Résultats représentatifs des neurones afférents jugulaires multiplex ISH. Images numériques d’une masse ganglionnaire vagale représentative marquée avec un multiplex RNAscope Prdm12, Cck1r et Ghsr. Les images ont été acquises avec les objectifs 20x(A)et 63x(B, C)d’un microscope confocal (Zeiss LSM880). Dans A,20× plusieurs images ont été assemblées à l’aide du logiciel Zen et présentées sous forme de canaux non mélangés ou fusionnés. Transcription Prdm12 (rouge) spécifiquement accumulée dans les neurones afférents situés dans le ganglion jugulaire et seulement quelques neurones infiltrant la partie rostrale du ganglion nodossé. Les signaux Cck1r (cyan) ont intensément marqué le ganglion nodosé. À faible grossissement, les cellules exprimant de faibles niveaux de Cck1r ou toute cellule avec des signaux Ghsr (jaune) ne pouvaient pas être vues facilement. DAPI (gris) a aidé à visualiser le tissu et à identifier les neurones afférents vagals avec un noyau grand et légèrement coloré. Les deux encarts blancs de l’image fusionnée correspondent aux emplacements des images incluses ci-dessous. (B, C) À fort grossissement, les profils cellulaires Prdm12 positifs (rouge) peuvent être délimités. Des signaux modérés pour Cck1r ont également été détectés dans les profils « 1 » et « 2 ». Le profil « 3 » est représentatif des cellules Prdm12 négatives pour Cck1r ou Ghsr. En C,les signaux Ghsr (jaune) sont vus dans le profil représentatif « 4 » mais pas dans « 5 ». (D) Graphique circulaire résumant les estimations du pourcentage de cellules Prdm12 (rouge) co-exprimant ghsr (jaune), Cck1r (cyan), ou les deux (gris). Le nombre total de profils comptés est indiqué à côté du graphique (n = 4 ganglions différents, à gauche et à droite combinés). Les résultats de chaque côté ont été regroupés parce qu’aucune différence n’a été remarquée. Barres d’échelle = 158 μm (A) et 15 μm (B, C). Abréviations : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; NG = ganglion nodosé; JG = ganglion jugulaire; ISH = hybridation in situ; Prdm12 = protéine de doigt de zinc du domaine PR 12; Phox2b = homéobox appariée 2b; Ghsr = récepteur de la ghréline; Cck1r = récepteur de la cholécystokinine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Opale | Ligne laser | Plage de détection | pouvoir | gagner | Moyenne des lignes | Taille des pixels |
| Opale 690 | HeNe 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opale 570 | Laser DPSS 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opale 520 | laser argon 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI | laser à diode 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
Tableau 1 : Paramètres d’acquisition. Abréviation : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole.
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Discussion
La technique de l’ISH a été inventée à la fin des années 196042. Cependant, ce n’est qu’au milieu des années 1980 qu’il a été appliqué pour la détection des ARNm dans les systèmes nerveux central et périphérique43,44. Compte tenu de l’hétérogénéité du système nerveux et des problèmes récurrents avec les anticorps, la localisation d’un transcrit particulier au niveau cellulaire reste un outil inestimable. Néanmoins, les méthodes ish traditionnelles sont restées laborieuses et sensibles de manière variable. Heureusement, cette étude a utilisé une procédure ISH très sensible appelée ARNscope, qui ne génère généralement aucun arrière-plan et permet la détection de plusieurs transcriptions exprimées à de faibles niveaux45,46. Plus précisément, le multiplex fluorescent RNAScope a été appliqué pour la détection simultanée des transcriptions Ghsr et Cck1r. Les facteurs de transcription, Phox2b et Prdm12, ont ensuite été utilisés comme marqueurs sélectifs pour différencier les neurones nodose et jugulaire afférents, respectivement. Sans visualiser Phox2b et Prdm12, il serait difficile d’identifier avec certitude les neurones afférents jugulaires vs nodose. Comme expliqué ci-dessus, une étape critique comprend une technique de dissection cohérente et appropriée. En outre, la vérification de la fluorescence endogène est également un facteur important car elle pourrait facilement être confondue avec les signaux RNAScope. En outre, le choix de paramètres d’acquisition appropriés en fonction du tissu témoin négatif est fortement conseillé. Comme mentionné précédemment, la microscopie confocale est la méthode d’imagerie préférée avec des objectifs de 20x et 63x (huile) car 1) les transcriptions exprimées à de faibles niveaux et / ou dans des cellules clairsemées peuvent n’être perceptibles qu’à fort grossissement. 2) La microscopie confocale permet la collecte d’un seul plan focal, ce qui est important étant donné que deux cellules l’une sur l’autre peuvent apparaître à tort comme une seule cellule lorsqu’elles sont imagées par épifluorescence. 3) La microscopie confocale permet également des paramètres d’acquisition plus sélectifs et flexibles. Les paramètres d’acquisition ci-dessus ne sont fournis qu’à titre d’exemple, et des modifications sont recommandées en fonction d’un instrument, d’un grossissement (20x ou 63x), des niveaux d’expression et des niveaux endogènes de fluorescence pour un tissu donné. La procédure de coloration elle-même est restée très proche de celle du protocole recommandé avec seulement de légers ajustements. De toute évidence, le protocole décrit ici peut être appliqué à la détection de toutes les transcriptions, pas seulement des RCPG. La procédure décrite ici est néanmoins particulièrement utile compte tenu des problèmes récurrents d’anticorps soulevés contre les RCPG24.
Comme discuté précédemment15, le ganglion nodosé de souris est parfois attaché au ganglion cervical supérieur par un pont cellulaire. L’inclusion de ce pont cellulaire peut conduire à des résultats déroutants, par exemple, la détection de marqueurs non vagals dans le ganglion nodosé. L’investigateur peut vouloir vérifier systématiquement si le ganglion nodosé est attaché au ganglion cervical supérieur pendant la dissection. Sinon, des compétences de dissection incohérentes entre les ganglions introduiront une variabilité expérimentale. Il est également important de noter que les neurones afférents pétrosaux et nodose expriment Phox2b47. Ainsi, ce que nous avons appelé les neurones afférents nodosés comprenait à la fois des neurones pétrosaux et nodoses. Enfin, lors de la comparaison de différentes études, il convient de garder à l’esprit que différentes méthodes d’euthanasie peuvent entraîner des changements dans l’expression des gènes48.
En théorie, les fluorophores utilisés pour la détection peuvent être attribués de manière interchangeable à n’importe quel canal. Cependant, Opal 690 s’est avéré émettre un faible niveau de fluorescence verte. Dans la plupart des cas, dans le cas de transcriptions très exprimées (p. ex., Prdm12), une fluorescence verte indésirable a été observée si l’intensité du laser était trop élevée. Opal 690 est donc recommandé pour les gènes à expression modérée/faible. Si vous ne travaillez qu’avec des gènes fortement exprimés, il est recommandé de diluer davantage Opal 690 (c’est-à-dire 1/3 000) et de ne pas capturer de fluorescence verte non spécifique lors de l’acquisition de l’image. Les signaux RNAscope sont des points séparés de couleurs différentes, même lorsque les transcriptions sont exprimées dans le même profil cellulaire. Cependant, pour les transcriptions hautement exprimées, il pourrait ne pas être possible de voir des points individuels, mais plutôt de la fluorescence remplissant le cytoplasme. Lorsque les points émettent une fluorescence de différentes couleurs, on pourrait envisager un problème de fluorescence non spécifique en raison, entre autres, de paramètres d’acquisition inadéquats et / ou de pigments endogènes. Enfin, Opal 570 et 620 ne doivent pas être utilisés simultanément car leurs spectres d’émission se chevauchent.
Si aucun signal d’ARN n’est observé pour un gène connu pour être exprimé dans le tissu d’intérêt, il est conseillé de vérifier l’intégrité du tissu en exécutant une sonde positive disponible (c.-à-d. peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B gène d’entretien ménager). La contre-coloration DAPI est également utile pour déterminer la qualité des tissus. Les noyaux marqués DAPI qui semblent déchiquetés peuvent indiquer une digestion excessive ou des tissus mal fixés.
En conséquence, Ghsr a été exprimé dans un petit sous-ensemble de neurones afférents jugulaires Prdm12 positifs. En revanche, et en accord avec une étude précédente11,l’ARNm Ghsr était pratiquement absent des neurones afférents nodosés. On en déduit que de faibles niveaux d’ARNm Ghsr précédemment détectés par qPCR et ISH étaient probablement dus aux neurones afférents jugulaires30,31,32. Une étude antérieure de signalisation du calcium a montré que 3% des neurones afférents vagals cultivés répondent à la ghréline49, un nombre remarquablement similaire au pourcentage de neurones afférents jugulaires exprimant Ghsr. Cck1r a été exprimé dans de nombreux neurones afférents de nodose Phox2b positif et, plus surprenant, dans un sous-ensemble de neurones afférents jugulaires Prdm12 positifs. En résumé, cet article démontre l’adaptation réussie des techniques ISH existantes pour évaluer la distribution cellulaire de certains RCPG dans la masse ganglionnaire jugulaire-nodose dans son intégralité.
En conclusion, l’ISH multiplex a été utilisé pour détecter et visualiser simultanément les transcriptions de deux RCPG (Cck1r et Ghsr) et d’un facteur de transcription (Phox2b ou Prdm12) dans l’ensemble du complexe ganglionnaire vagal de la souris adulte. Le protocole décrit ici peut être un outil complémentaire au séquençage de l’ARN, à la qPCR et à l’histologie traditionnelle. Cependant, ce protocole peut être appliqué à d’autres ganglions de taille similaire. Comme nous l’avons vu plus haut, les paramètres d’acquisition, l’âge des animaux et la consistance de la dissection sont des facteurs importants à prendre en compte lors de la conception expérimentale. Par conséquent, il peut offrir des informations uniques sur les modèles d’expression génique topographique dans un ganglion très hétérogène et petit. Ce protocole pourrait être utilisé pour déterminer les changements dans les profils transcriptionnels des neurones afférents jugulaires par rapport aux neurones nodus dans le contexte de diverses conditions physiologiques et physiopathologiques, y compris, mais sans s’y limiter, les changements dans l’état alimentaire. Il peut également être utilisé pour comparer la composition neurochimique des neurones afférents vagals chez les espèces animales couramment utilisées dans la recherche préclinique, y compris les primates et les porcs50,51.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financé par la subvention des NIH #5P01DK119130-02. Les auteurs tiennent à remercier l’UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (dirigé par le Dr Phelps) et son personnel (Abhijit Bugde et Marcel Mettlen), soutenus en partie par la subvention des NIH #1S10OD021684-01, une ressource partagée du Harold C. Simmons Cancer Center, soutenue en partie par une subvention de soutien du NCI Cancer Center, P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
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