Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

Published: August 5, 2022 doi: 10.3791/62949
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

Summary

ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي هي أهداف محتملة لأدوية السرطان. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتقييم الجزيئات الصغيرة لتثبيط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يستخدم هذا الفحص نوكلياز داخلي لإقران مثيلة الحمض النووي بتوليد التألق ويسمح بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي.

Abstract

مثيلة الحمض النووي ، وهي شكل من أشكال تنظيم الجينات اللاجينية ، مهمة للوظيفة الخلوية الطبيعية. في الخلايا ، تنشئ البروتينات التي تسمى DNA methyltransferases (DNMTs) نمط مثيلة الحمض النووي وتحافظ عليه. ترتبط التغييرات في نمط مثيلة الحمض النووي الطبيعي بتطور السرطان وتطوره ، مما يجعل DNMTs أهدافا محتملة لأدوية السرطان. وبالتالي ، فإن تحديد وتوصيف مثبطات الجزيئات الصغيرة الجديدة لهذه الإنزيمات له أهمية كبيرة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يمكن استخدامه للكشف عن مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يسمح اختبار الحركية المقترنة المستمرة بتحديد السرعات الأولية لمثيلة الحمض النووي في وجود وغياب مثبطات الجزيئات الصغيرة المحتملة. يستخدم الفحص نوكلياز Gla I الحساس للميثيل لإقران مثيلة ركيزة الحمض النووي hemimethylated لتوليد مضان.

يسمح هذا الفحص المستمر بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي. إجراء الفحص بكميات صغيرة في ألواح المعايرة الدقيقة يقلل من تكلفة الكواشف. باستخدام هذا الفحص ، تم إجراء شاشة مثال صغير لمثبطات DNMT1 ، وهو إيزوزيم DNMT الأكثر وفرة في البشر. المنتج الطبيعي للأنثراكينون عالي الاستبدال ، حمض اللاكايك A ، هو مثبط قوي ومنافس للحمض النووي ل DNMT1. هنا ، نفحص ثلاثة مثبطات جزيئات صغيرة محتملة - أنثراكينون أو جزيئات شبيهة بالأنثراكينون مع واحد إلى ثلاثة بدائل - بتركيزين لوصف بروتوكول الفحص. تستخدم السرعات الأولية لحساب النسبة المئوية للنشاط الملاحظ في وجود كل جزيء. يظهر أحد المركبات الثلاثة التي تم فحصها تثبيطا يعتمد على التركيز لنشاط DNMT1 ، مما يشير إلى أنه مثبط محتمل ل DNMT1.

Introduction

مثيلة الحمض النووي هي علامة جينية مهمة تنظم التعبير الجيني وبنية الكروماتين. يحدث المثيلة في الغالب في ثنائي النوكليوتيدات CpG - السيتوزين يليه جوانوزين. تضاف مجموعة الميثيل إلى موضع 5 من السيتوزين. هناك حاجة إلى أنماط مثيلة الحمض النووي الصحيحة ، وبالتالي التعبير الجيني المناسب ، من أجل التطور والوظيفة الخلوية المناسبة. ارتبطت العديد من حالات المرض بالتغيرات في نمط المثيلة الطبيعي1،2،3. على سبيل المثال ، هناك صلة بين بدء السرطان وتقدمه والتعديلات في نمط مثيلة الحمض النووي. عادة ، تظهر الخلايا السرطانية مستويات إجمالية أقل من ميثيل سيتوزين ، مما يساهم في عدم استقرار الجينوم. في الوقت نفسه ، يتركز ميثيل السيتوزين الموجود في الجينوم في المناطق المروجة للجينات المثبطة للورم ، مما يؤدي إلى إسكات الجينات لهذه البروتينات المهمة. والجدير بالذكر أن التغيرات اللاجينية ديناميكية وقابلة للعكس ، على عكس طفرات الحمض النووي المرتبطة بتكوين الأورام. وقد جعل هذا البروتينات المشاركة في تنظيم الجينات اللاجينية أهدافا دوائية مثيرة للاهتمام 2,4.

ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMTs) هي البروتينات المسؤولة عن توليد والحفاظ على أنماط مثيلة الحمض النووي. توجد ثلاثة إيزوزيمات نشطة تحفيزيا ، DNMT1 و DNMT3a و DNMT3b ، في البشر. أثناء التطوير والتمايز ، تنشئ دي نوفو ميثيل ترانسفيراز ، DNMT3a و DNMT3b ، أنماط مثيلة. يمكن لكلا الإنزيمين ربط بروتين DNMT3L غير النشط تحفيزيا لتشكيل مجمعات تظهر نشاطا متزايدا 1,5. بعد انقسام الخلايا ، تحتوي الخلايا البنوية على الحمض النووي نصف الميثيل - الحمض النووي الذي يحتوي على ميثيل السيتوزين في شريط واحد فقط من الازدواج - لأن الحمض النووي المركب حديثا يخلو من علامات المثيلة. تتمثل الوظيفة الرئيسية ل DNMT1 في ميثيل هذا الحمض النووي نصف الميثيل ، وبالتالي إعادة إنشاء نمط المثيلة الكامل 1,5.

الروابط بين نشاط DNMT والسرطان راسخة. الإفراط في التعبير عن DNMT1 ، إما عن طريق آليات النسخ أو ما بعد الترجمة ، هو نتيجة للعديد من مسارات الأورام الشائعة6،7،8،9. تؤدي الأساليب الجينية لخفض نشاط DNMT1 باستخدام الأليلات ناقصة الشكل إلى انخفاض تكوين الورم في الفئران Apc (Min) 10. oligonucleotides المضادة للحساسية التي تمنع DNMT1 الأورام في زراعة الخلايا ونماذج ورم الفأر11,12. وبالتالي ، فإن تثبيط نشاط DNMT1 يبدو وكأنه نهج واعد لعلاج السرطان. ومع ذلك ، فإن الأدوار التي تلعبها إيزوزيمات DNMT3 ليست بهذه البساطة. تم العثور على طفرات DNMT3a في سرطان الدم النخاعي الحاد13 ومتلازمة خلل التنسج النقوي14. ثبت أن طفرة واحدة على الأقل من الطفرات المحددة تقلل من نشاط مثيلة الحمض النووي للإنزيم15. ومع ذلك ، يتم التعبير عن DNMT3b بشكل مفرط في سرطان الثدي16 وسرطان القولون والمستقيم17. مع لعب إيزوزيمات DNMT المختلفة أدوارا مختلفة في التسرطن ، فإن تحديد مثبطات الإيزوزيم الخاصة سيكون أمرا بالغ الأهمية. لن تكون هذه المركبات مفيدة فقط لتطوير العلاجات ، ولكن مثبطات الإيزوزيم الخاصة ستكون أيضا أداة لا تقدر بثمن لتشريح دور كل إيزوزيم DNMT في مسببات السرطان.

تم الإبلاغ عن العديد من مثبطات DNMT في الأدبيات. يمكن تقسيم مثبطات DNMT المعروفة إلى فئتين: النوكليوزيد وغير النيوكليوسيد. مثبطات النيوكليوزيد هي عادة نظائر السيتيدين. يتم دمج هذه المركبات في الحمض النووي وتحبس DNMTs تساهميا. تمت الموافقة على 5-azacytidine و 5-aza-2'-deoxycytidine لعلاج متلازمة خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد4،18. تمثل السمية العالية والتوافر البيولوجي المنخفض وعدم الاستقرار الكيميائي لهذه المركبات مشاكل. العمل الجاري هو دراسة فعالية الجيل القادم من مثبطات النيوكليوسيد. SGI-110 ، المشتق من 5-aza-2'-deoxycytidine ، هو أحد الأمثلة19,20. مثبطات النيوكليوزيد ليست خاصة بالإيزوزيم وستعطل أي إيزوزيم DNMT تمت مواجهته. لذلك ، يؤدي العلاج بعامل إزالة الميثيل من النوكليوزيد إلى استنفاد جميع إيزوزيمات DNMT 4,18. لا يلزم دمج مثبطات غير النوكليوزيد في الحمض النووي لممارسة آثارها المثبطة. بدلا من ذلك ، ترتبط هذه الجزيئات مباشرة ب DNMTs ، مما يوفر إمكانية تثبيط خاص بالإيزوزيم. تم اكتشاف العديد من مثبطات غير النوكليوزيد حتى الآن ، بما في ذلك SGI-1027 21 ، و hydralazine 22 ، و procainamide 23 ، و RG108 ومشتقاته24 ، والمنتجات الطبيعية ، (-) -epigallocatechin 3-gallate (EGCG) 25 وحمض اللاكايكA 26,27. معظم مثبطات غير النوكليوزيد المكتشفة حتى الآن ليست انتقائية للأيزوزيم أو تظهر تفضيلات ضعيفة لإيزوزيم DNMT واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تحسين فاعلية هذه الجزيئات ، خاصة في الخلايا 4,18. وبالتالي ، هناك حاجة لاكتشاف أو تطوير مثبطات DNMT أكثر قوة وانتقائية للأيزوزيم.

تتمثل إحدى العقبات التي تحول دون اكتشاف مثبطات جزيئات صغيرة جديدة ل DNMTs في المقايسات الشاقة المستخدمة تقليديا لفحص نشاط DNMT28. عادة ما تكون المقايسات متقطعة بخطوات متعددة. لا يزال النشاط الأنزيمي ل DNMTs يتم فحصه بشكل روتيني باستخدام ميثيونين S-adenosyl المشع (SAM) 29،30،31،32،33،34. كما تم تطوير مقايسات غير مشعة لمثيلة الحمض النووي. على سبيل المثال ، تم وصف المقايسات التي تستخدم نوكلياز تقييد حساسية للميثيل والرحلان الكهربائي لفصل منتجات الهضم35,36. هذه الأنواع من المقايسات المتقطعة متعددة الخطوات ليست قابلة بسهولة لاكتشاف الأدوية. منذ منتصف عام 2000 ، تم تطوير العديد من فحوصات مثيلة الحمض النووي ذات الإنتاجية الأعلى28. تم استخدام اختبار القرب التلألؤ للكشف عن مثبطات DNMT137. تم استخدام اختبار آخر يستخدم نوكلياز تقييد حساسية للميثيل للكشف عن مثبطات DNMT3a25,38. في حين أن كلا الاختبارين يسمحان بإنتاجية أعلى من مقايسات مثيلة الحمض النووي التقليدية ، فإن المقايسات تتطلب خطوات متعددة ولا تسمح بمراقبة نشاط المثيلة في الوقت الفعلي. في الآونة الأخيرة ، تم وصف مقايسة حركية مستمرة تجمع بين تكوين S-adenosylhomocysteine (SAH) ، وهو أحد منتجات تفاعل المثيلة ، والتغير الطيفي عند 340 نانومتر المرتبط بأكسدة NADPH39. يستخدم هذا الفحص ثلاثة إنزيمات اقتران لتوليد إشارة طيفية.

لقد طورنا مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بنوكلياز داخلية قائمة على التألق والتي تستخدم إنزيم اقتران واحد متاح تجاريا ويمكنها توليد البيانات في الوقت الفعلي (الشكل 1). يستخدم قليل النوكليوتيد الذي يحتوي على ثلاثة ميثيل سيتوزين كركيزة. يحتوي الحمض النووي للركيزة على فلوروفور في الطرف 5 'ومطفئ في الطرف 3'. تولد مثيلة موقع CpG نصف الميثيل موقع الانقسام للنوكلياز الداخلي Gla I - GCGC الميثيلي بالكامل. Gla I انشقاق المنتج قليل النوكليوتيد يطلق الفلوروفور من المروي ويولد مضان في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام الفحص لفحص نشاط أي شكل متساوي من DNMT ؛ ومع ذلك ، لوحظ نشاط أعلى مع DNMT1 حيث أن هذا الإيزوزيم يثيل بشكل تفضيلي الحمض النووينصف الميثيل 1,5. ويلاحظ نشاط أكثر قوة إذا تمت إزالة مجال تسلسل استهداف بؤر النسخ المتماثل (RFTS) المثبط ذاتيا من DNMT1. يرتبط هذا المجال ، الموجود في المنطقة التنظيمية N-terminal ، بالموقع الحفاز ويمنع ارتباط الحمض النووي. تؤدي إزالة أول ~ 600 من الأحماض الأمينية إلى إنزيم مقطوع أكثر نشاطا بشكل ملحوظ من الإنزيم كامل الطول (~ زيادة 640 ضعفا في kcat / Km) 40. يسمح هذا الشكل المنشط من الإنزيم ، المشار إليه باسم DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS (الأحماض الأمينية 621-1616) ، بتحديد أسهل للمثبطات بسبب قوته التحفيزية المتزايدة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لاستخدام DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في المقايسات لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة المحتملة. باستخدام الفحص المستمر المقترن بالنوكلياز الداخلي ، يتم تحديد السرعة الأولية في وجود وغياب عدد قليل من الجزيئات الصغيرة. يتم فحص كل مثبط محتمل بتركيزين للبحث عن تثبيط DNMT1 المعتمد على التركيز. تم حساب النسبة المئوية للنشاط الذي لوحظ في وجود الجزيئات الصغيرة في كل حالة.

Figure 1
الشكل 1: مقايسة مثيلة الحمض النووي. يتم استخدام الحمض النووي لدبوس الشعر hemimethylated مع فلوروفور في نهاية 5 'ومطفأ على نهاية 3' كركيزة. يحفز DNMT1 نقل مجموعة الميثيل من S-adenosylmethionine إلى موقع CpG غير الميثيل ، مما يولد S-adenosylhomocysteine والحمض النووي الميثيلي بالكامل. يحتوي منتج الحمض النووي على موقع الانقسام للنوكلياز الداخلي Gla I ، الذي يشق مواقع GCGC الميثلية بالكامل. يؤدي انشقاق الحمض النووي للمنتج إلى إطلاق الفلوروفور 5 بوصات من مخوي 3 بوصات ، مما يولد مضان. الاختصارات: Fl = فلوروفور. س = مروي. DNMT1 = الحمض النووي ميثيل ترانسفيراز 1 ؛ SAM = S-أدينوسيل ميثيونين. SAH = S-أدينوسيل هوموسيستين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد حلول الفحص للشاشة

ملاحظة: يمكن تكييف تركيزات الركائز المستخدمة في هذا الفحص. بالنسبة إلى DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS ، فإن قيم Km المحددة تجريبيا لركيزة الحمض النووي لدبوس الشعر و SAM هي 1-2 نانومتر و 2 ميكرومتر ، على التوالي26,40.

  1. قم بإعداد 600 ميكرولتر من كل حالة فحص يتم اختبارها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد.
    ملاحظة: يعتمد الحجم الإجمالي لحل الفحص المطلوب على عدد النسخ المتماثلة التي يتم إجراؤها. تم تشغيل كل حالة فحص في ثلاث نسخ لهذا البروتوكول.
    1. أضف ddH 2O و 5x methylation buffer (250 mM Tris pH 7.5 ، 5 mM MgCl2 ، 500 mM غلوتامات البوتاسيوم ، 5 mM dithiothreitol (DTT) ، 25٪ جلسرين) إلى كل أنبوب لتحقيق تركيز نهائي قدره 1x عازلة. بالنسبة للمقايسات التي تحتوي على مركب 20 ميكرومتر ، أضف 472 ميكرولتر من ddH2O و 120 ميكرولتر 5x عازلة. بالنسبة للمقايسات التي تحتوي على مركب 50 ميكرومتر ، أضف 470 ميكرولتر من ddH2O و 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x.
    2. أضف 3.15 ميكرولتر من 20 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى كل عينة.
    3. أضف 2 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي 3.15 ميكرومتر و 1.33 ميكرولتر من 4.75 مللي مول SAM إلى كل عينة.
      ملاحظة: تركيز الركائز في خليط محلول الفحص هو 1.05x التركيزات النهائية المطلوبة.
    4. أضف المانع إلى تركيز نهائي قدره 21 ميكرومتر (1.26 ميكرولتر من 10 مللي مول) أو 52.5 ميكرومتر (3.15 ميكرولتر من 10 مللي مول) إلى العينات المناسبة. أضف كمية مكافئة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى عينة التحكم.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف تركيز المانع المستخدم في الشاشة. يجب أن يكون الحد الأقصى لتركيز DMSO النهائي ≤5٪ (v / v). تركيزات DMSO حتى 5٪ (v / v) ليس لها أي تأثير على النشاط الملاحظ في الفحص26.
  2. امزج المحاليل عن طريق الدوامة (3000 دورة في الدقيقة) لمدة 3 ثوان. قم بتدوير العينات لبضع ثوان في جهاز طرد مركزي صغير منضدية (1200 × جم) لضمان جمع المحلول في قاع الأنبوب.
  3. حصة 95 ميكرولتر من كل محلول فحص في 6 آبار متتالية في لوحة سوداء نصف مساحة 96 بئر (الشكل 2).
    ملاحظة: تم إجراء فحوصات الفحص هذه على دفعتين. أولا ، تم فحص 20 عينة مثبطة ميكرومتر (4 ظروف إجمالية) ، تليها عينات مثبطات 50 ميكرومتر (4 ظروف إجمالية).

Figure 2
الشكل 2: إعداد لوحة الفحص. يتم اقتباس كل محلول فحص في ستة آبار في لوحة 96 بئر سوداء: تحكم DMSO (أزرق) ، مركب 1 (أخضر) ، مركب 2 (أحمر) ، ومركب 3 (أصفر). ستتم إضافة كل من DNMT1 و Gla I اللذين يفتقران إلى RFTS إلى ثلاثة آبار. كعنصر تحكم ، ستتم إضافة Gla I وحدها إلى الآبار الثلاثة الأخرى. الاختصارات: RFTS = تسلسل استهداف بؤر النسخ المتماثل ؛ DNMT1 = الحمض النووي ميثيل ترانسفيراز 1 ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تحضير محاليل الإنزيم للشاشة

ملاحظة: يمكن التعبير عن DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في الإشريكية القولونية وتنقيته إلى التجانس. تم وصف إجراءات التعبير والتنقية ل DNMT1 التي تفتقر إلى RFTS سابقا41. يعتمد حجم الإنزيم المطلوب على عدد المقايسات التي يتم إجراؤها. هنا ، يتم إجراء أربعة مقايسات مختلفة في كل مجموعة. يتم الانتهاء من كل فحص في ثلاث نسخ.

  1. تحضير 75 ميكرولتر من كل محلول إنزيم في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد.
    ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى محلولين إنزيميين. سيحتوي أحد الحلول على DNMT1 و Gla I ؛ الآخر سيحتوي فقط على Gla I.
    1. أضف ddH 2O و 5x methylation buffer (250 mM Tris pH 7.5 ، 5 mM MgCl2 ، 500 mM غلوتامات البوتاسيوم ، 5 mM DTT ، 25٪ جلسرين) إلى كل أنبوب لتحقيق تركيز نهائي قدره 1x عازلة. بالنسبة لمحلول إنزيم Gla I ، أضف 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x و 58.8 ميكرولتر ddH2O. بالنسبة لمحلول الإنزيم DNMT1 + Gla I ، أضف 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x و 58.2 ميكرولتر ddH2O.
    2. أضف 1.2 ميكرولتر من 10 U / μL Gla I إلى كل محلول للحصول على تركيز نهائي قدره 0.16 وحدة / ميكرولتر.
    3. أضف 0.6 ميكرولتر من DNMT1 الذي يفتقر إلى 5 ميكرومتر RFTS للحصول على تركيز نهائي قدره 40 نانومتر إلى محلول DNMT1 + Gla I.
  2. اضغط برفق لخلط الحلول. قم بتدوير العينات لبضع ثوان في جهاز طرد مركزي صغير منضدية (1200 × جم) لضمان جمع المحلول في قاع الأنبوب.
  3. حاصل 12 ميكرولتر من كل محلول إنزيم في 6 آبار في صفيحة مخروطية القاع مكونة من 96 بئرا (الشكل 3).

Figure 3
الشكل 3: إعداد لوحة الإنزيم. يتم اقتباس كل من حلول Gla I (الرمادية) و DNMT1 + Gla I (الزرقاء) في ستة آبار في لوحة 96 بئر. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، يمكن إضافة الإنزيم إلى صف من محاليل الفحص في وقت واحد. لكل حالة فحص (ستة آبار) ، ستتلقى ثلاثة آبار DNMT1 + Gla I ، وستتلقى ثلاثة آبار Gla I وحدها. اختصار: DNMT1 = DNA methyltransferase 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. قم بتشغيل الفحص وتحليل البيانات.

  1. سخني قارئ الأطباق إلى 37 درجة مئوية. أدخل اللوحة السوداء التي تحتوي على محاليل الفحص. هز اللوحة (مدار مزدوج عند 425 نسخة في الدقيقة لمدة 5 ثوان) واقرأ التألق بطول موجة إثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 528 نانومتر. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام المرشحات ذات القطع المناسبة للطول الموجي لقراءات التألق.
  2. قم بإزالة لوحة الفحص. أضف 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم إلى كل بئر واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: استخدم ماصات متعددة القنوات بحيث يمكن بدء صف من العينات في وقت واحد.
  3. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة. سجل مضان كل 53 ثانية لمدة 30 دقيقة. هز اللوحة (مدار مزدوج عند 425 نسخة في الدقيقة لمدة 4 ثوان) قبل كل قراءة.
  4. متوسط ثلاثة أضعاف Gla I التحكم في المقايسات لكل حالة. اطرح متوسط تتبع تفاعل التحكم المحتوي على Gla I من الآثار الثلاثية التي تم الحصول عليها في وجود DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS. تحديد متوسط والخطأ المعياري للمتوسط للنسخ المكررة المصححة.
  5. ارسم متوسط تتبع التفاعل المصحح وقم بتركيب الجزء الخطي الأولي مع خط لتحديد السرعة الابتدائية.
  6. أوجد النسبة المئوية للنشاط بقسمة السرعة المرصودة في وجود مركب على السرعة التي لوحظت في تفاعل التحكم المحتوي على DMSO وضربها في 100.

4. تحكم إضافي في الفحص - إضافة متسلسلة للإنزيمات

  1. تحضير 550 ميكرولتر من محلول الفحص في أنبوب طرد مركزي دقيق على الجليد. أضف 110 ميكرولتر من 5x عازلة مثيلة ، 3.88 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي 3.15 ميكرومتر دبوس الشعر ، 6.43 ميكرولتر من 47.5 مللي متر سام ، 3.06 ميكرولتر من 20 مجم / مل BSA ، و 426.6 ميكرولتر من ddH2O.
  2. امزج المحلول عن طريق الدوامة (3000 دورة في الدقيقة) لمدة 3 ثوان. قم بتدوير العينات لبضع ثوان في جهاز طرد مركزي صغير منضدية (1200 × جم) لضمان جمع المحلول في قاع الأنبوب.
  3. حصة 90 ميكرولتر من محلول الفحص في 6 آبار متتالية في لوحة سوداء نصف مساحة 96 بئر.
  4. تحضير محاليل إنزيم DNMT1 على الجليد. أضف 4 ميكرولتر من محلول مثيلة 5x ، و 0.76 ميكرولتر من 5 ميكرومتر RFTS تفتقر إلى DNMT1 ، و 15.24 ميكرولتر من ddH2O إلى أنبوب واحد. أضف 4 ميكرولتر من محلول مثيلة 5x و 16 ميكرولتر من ddH2O إلى أنبوب آخر.
  5. اضغط برفق لخلط الحلول. قم بتدوير العينات لبضع ثوان في جهاز طرد مركزي صغير منضدية (1200 × جم) لضمان جمع المحلول في قاع الأنبوب.
  6. أضف 5 ميكرولتر من المحلول المحتوي على DNMT1 إلى ثلاثة آبار في لوحة نصف المساحة السوداء المكونة من 96 بئرا. أضف 5 ميكرولتر من محلول التحكم في المخزن المؤقت إلى الآبار الثلاثة الأخرى.
  7. ضع لوحة المعايرة الدقيقة في قارئ الألواح المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. هز اللوحة (مدار مزدوج عند 425 نسخة في الدقيقة لمدة 3 ثوان) واقرأ التألق بطول موجة إثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 528 نانومتر. كرر الهز واقرأ كل 60 ثانية لمدة 30 دقيقة.
  8. أثناء وجود لوحة الفحص في قارئ اللوحة ، قم بإعداد محلول Gla I على الجليد. أضف 8 ميكرولتر من محلول مثيلة 5x ، و 0.64 ميكرولتر من 10 U / μL Gla I ، و 31.4 ميكرولتر من ddH2O إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. اضغط برفق لخلط المحلول. قم بتدوير العينة لبضع ثوان في جهاز طرد مركزي صغير منضدية (1200 × جم) لضمان جمع المحلول في قاع الأنبوب.
  9. حاصل 6 ميكرولتر من محلول Gla I في 6 آبار في صفيحة مخروطية القاع مكونة من 96 بئرا.
  10. بعد القراءة الأولية لمدة 30 دقيقة ، قم بإزالة اللوحة السوداء من قارئ اللوحة. أضف 5 ميكرولتر من محلول Gla I إلى جميع الآبار ال 6 واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: استخدم ماصة متعددة القنوات بحيث يمكن بدء تشغيل جميع الآبار في وقت واحد.
  11. ضع اللوحة السوداء مرة أخرى في قارئ اللوحة. سجل مضان كل 35 ثانية لمدة 35 دقيقة. هز اللوحة (مدار مزدوج عند 425 نسخة في الدقيقة لمدة 3 ثوان) قبل كل قراءة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNMT1 النشط هو شرط أساسي لهذا التحليل. تم التعبير عن DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في E.coli وتم تنقيته إلى التجانس باتباع الإجراءات المنشورة مسبقا41. للتأكد من أن الإنزيم المنقى كان نشطا ، تم استخدام مقايسة متقطعة مقترنة بالنوكلياز الداخلي لفحص نشاط مثيلة الحمض النووي36. يستخدم هذا الفحص الحمض النووي المزدوج المكون من 32 زوجا من القواعد مع CpG أحادي الميثيل موضوعة في موقع انقسام Sau3A1. Sau3A1 يمكن أن يشق الحمض النووي للركيزة hemimethylated ؛ ومع ذلك ، يتم حظر الانقسام عندما يكون الحمض النووي ميثيل بالكامل. تمت إضافة DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS إلى المقايسات التي تحتوي على 1 ميكرومتر من الحمض النووي و 0.5 مللي متر من SAM ، وتمت إزالة القسمة وتجميدها على مدار 30 دقيقة. تم هضم العينات لاحقا باستخدام Sau3A1 ، وتم فصل المنتجات عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي. كما هو موضح في الشكل 4 ، فإن الحمض النووي محمي من الانقسام مع زيادة وقت التفاعل ، مما يشير إلى أن DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS هو مثيلة الحمض النووي نصف الميثيل. تم تحويل معظم الحمض النووي للركيزة 1 ميكرومتر الموجود أصلا في الفحص إلى منتج على مدار 30 دقيقة.

يسمح الفحص المقترن بالنوكلياز الداخلي الموصوف في هذه الورقة بمراقبة نشاط مثيلة الحمض النووي في الوقت الفعلي كزيادة في التألق. مفتاح نجاح هذا الفحص هو حساسية الميثيل للنوكلياز الداخلي Gla I. Gla I لا يشق الحمض النووي للركيزة hemimethylated بكفاءة ولكنه سيشق الحمض النووي للمنتج الميثيلي بالكامل (الشكل 1). مطلوب انشقاق الحمض النووي لدبوس الشعر لإطلاق الفلوروفور من المخمد وتوليد زيادة في مضان. لإثبات أن الإنزيمات تعمل كما هو متوقع ، تم إجراء تفاعل تحكم تمت فيه إضافة الإنزيمات ، DNMT1 و Gla I التي تفتقر إلى RFTS ، بالتتابع وليس بشكل متزامن. إذا كان الفحص المقترن يعمل بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تؤثر إضافة DNMT1 على التألق ، حيث لا يتوقع أن تؤثر مثيلة ركيزة الحمض النووي على مضان الخلفية للحمض النووي المروي داخليا. ومع ذلك ، فإن الإضافة اللاحقة ل Gla I إلى المقايسات التي تحتوي على ميثيل ترانسفيراز يجب أن تؤدي إلى توليد مضان بسبب انشقاق الحمض النووي لدبوس الشعر الميثيلي بالكامل. تحتوي ركيزة الحمض النووي لدبوس الشعر النصفي نفسها على مضان في الخلفية (الشكل 5) ؛ احتوت هذه المقايسات على 20 نانومتر من الحمض النووي لدبوس الشعر و 500 ميكرومتر من SAM. تمت إضافة DNMT1 أو المخزن المؤقت الذي يفتقر إلى RFTS إلى المقايسات ، وتم اتباع التألق لمدة 30 دقيقة.

كما هو موضح في الشكل 5 ، لا يتأثر التألق ب DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في غياب إنزيم الاقتران (تحتوي الظلال الزرقاء على 10 نانومتر من RFTS تفتقر إلى DNMT1 بينما الظلال الحمراء هي التحكم في المخزن المؤقت). وبالتالي ، فإن مثيلة موقع CpG نصف الميثيل بواسطة DNMT1 لا تغير بشكل ملحوظ إشارة التألق. ومع ذلك ، عندما تمت إضافة Gla I إلى جميع الآبار ، لوحظ توليد مضان قوي فقط في المقايسات التي تحتوي على DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS (الشكل 5). هذا يدل على أن مثيلة الحمض النووي للركيزة hemimethylated بواسطة DNMT1 مطلوبة لانقسام Gla I وتوليد التألق. وتجدر الإشارة إلى أن الزيادة في التألق التي لوحظت في مقايسة التحكم هذه تعكس نشاط Gla I حيث تمت إضافة الإنزيمات بالتتابع. بدلا من ذلك ، يمكن هضم مخاليط التفاعل هذه باستخدام Gla I ، ويمكن فصل قليل النيوكليوتيدات الناتج عن طريق الرحلان الكهربائي لتصور الانقسام والتأكد من أن الإنزيمات تعمل كما هو متوقع.

لاستخدام هذا الفحص المقترن لتحديد السرعات الأولية ل DNMT1 مباشرة ، يجب إضافة كلا الإنزيمين ، DNMT1 و Gla I اللذين يفتقران إلى RFTS ، في وقت واحد. طالما أن معدل انشقاق Gla I للحمض النووي للمنتج أسرع من معدل مثيلة الحمض النووي بواسطة DNMT1 ، فإن إشارة التألق المتولدة ستعكس نشاط مثيلة الحمض النووي. للتأكد من أن نشاط DNMT1 محدود المعدل ، يمكن تغيير تركيز DNMT1 مع الحفاظ على جميع شروط الفحص الأخرى ثابتة. يجب أن يكون معدل توليد التألق متناسبا مع تركيز DNMT1. وقد تم عرض هذا سابقا ل DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في ظل الظروف المستخدمة هنا40. عند استخدام هذا الفحص المزدوج لفحص نشاط DNMT ، يتم إجراء تفاعل تحكم يحتوي على Gla I بالإضافة إلى التفاعل الذي يحتوي على كل من DNMT1 و Gla I (الشكل 6 أ). يحتوي عنصر التحكم Gla I على العديد من الوظائف. يسمح طرح تتبع تفاعل التحكم Gla I من تتبع التفاعل المحتوي على DNMT بحساب كل من الانقسام البطيء لركيزة الحمض النووي hemimethylated ومضان الخلفية. تعكس آثار التفاعل المصححة المتولدة نشاط مثيلة الحمض النووي ل DNMT1. يسمح تركيب الجزء الخطي الأولي من تتبع التفاعل المصحح بتحديد السرعة الأولية (الشكل 6 ب). مع ركيزة الحمض النووي 10 نانومتر و 10 ميكرومتر SAM ، تم الحصول على سرعة أولية من 113 ± 2 RFU / دقيقة.

وقد ثبت سابقا أن الأنثراكينونات المستبدلة تمنع نشاط DNMT1. المنتج الطبيعي ، حمض اللاكايك A ، وهو أنثراكينون عالي الاستبدال ، هو مثبط قوي ومنافس للحمض النووي ل DNMT127. كما ثبت أن عددا قليلا من المركبات ذات الهياكل الأبسط ، واحد أو اثنين من البدائل على قلب الأنثراكينون ، مع كون أحدهما بديلا عطريا ضخما ، يثبط DNMT1 بطريقة تنافسية للحمض النووي41. هنا ، تم فحص قدرة ثلاثة أنثراكينونات بديلة أو جزيئات شبيهة بالأنثراكينون على تثبيط نشاط DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في مقايسة Gla I المقترنة كمثال على كيفية إجراء فحوصات الفحص هذه. احتوت هذه المركبات على واحد إلى ثلاثة بدائل ، وكلها على جانب واحد من قلب الأنثراكينون (الجدول 1). تركيزات الركيزة (10 نانومتر DNA و 10 ميكرومتر SAM) المستخدمة في هذه المقايسات ~ 5x أعلى من Km لكل ركيزة. تأتي الإشارة المتولدة في الفحص مباشرة من الحمض النووي للركيزة. لهذا السبب ، من الصعب الفحص بتركيزات قريبة أو أقل من Km ؛ ببساطة لا توجد إشارة كافية لاكتشافها. تم اختيار تركيزات الركيزة هذه لأن النشاط القوي يظهر في ظل هذه الظروف في غياب المثبطات (الشكل 6 ب). يمكن استخدام تركيزات الركيزة الأخرى في فحوصات الفحص. على سبيل المثال ، يمكن استخدام إجراء فحص بتركيزات SAM المشبعة كاستراتيجية لتحيز البحث ضد مثبطات SAM المنافسة.

احتوى كل فحص على ركيزة الحمض النووي لدبوس الشعر ، والعامل المساعد SAM المتبرع بالميثيل ، ومثبط محتمل أو DMSO كعنصر تحكم للشاشة. نقوم بشكل روتيني بتوليد محاليل 10 mM لمركبات الفحص في DMSO لاستخدامها في المقايسات. تظهر الأنثراكينونات مثل تلك التي تم فحصها هنا قابلية ذوبان ضعيفة في المحاليل المائية. وبالتالي ، لتوليد مخزونات مركزة ، يتم استخدام DMSO كمذيب. لا تؤثر إضافة DMSO حتى 5٪ (v / v) على النشاط في الفحص26. ومع ذلك ، عند التعامل مع المركبات ذات الذوبان المنخفض في المحلول المائي ، يجب توخي الحذر لضمان أن المركب قابل للذوبان عند تركيز (تركيزات) الغربلة النهائية المختارة.

لكل حالة يتم فحصها في الشاشة ، يتم إجراء اختبار تحكم يحتوي على Gla I. بالإضافة إلى حساب مضان الخلفية والانقسام البطيء للحمض النووي لدبوس شعر الركيزة ، يسمح هذا التحكم بتحديد ما إذا كان المانع المحتمل يتداخل مع الإشارة الطيفية (على سبيل المثال ، هو الفلورسنت). بعد بدء التفاعل بإضافة الإنزيمات، تم قياس التألق لمدة 30 دقيقة بفاصل زمني قدره 53 ثانية في بيانات الفرز. هذا هو أسرع فاصل زمني متاح على قارئ الألواح في هذا المختبر عند قراءة لوحة كاملة من 96 بئرا. يمكن استخدام فترات زمنية أخرى لتوليد آثار التفاعل. يعتمد الفاصل الزمني المناسب على الأداة المستخدمة وعدد الآبار التي تتم قراءتها. لضمان التكاثر ، يتم إجراء كل اختبار في ثلاث نسخ. يتم طرح متوسط تتبع التحكم المحتوي على Gla I من آثار التفاعل التي لوحظت في وجود DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS. يمكن تحديد السرعة الابتدائية للتفاعل عن طريق تركيب الجزء الخطي الأولي من آثار التفاعل المصححة.

في البداية ، تم فحص تأثير ثلاثة مثبطات محتملة على توليد التألق بتركيز نهائي قدره 20 ميكرومتر. تم اختيار تركيزات أعلى من المثبطات المحتملة للفحص لسببين. أولا ، تركيزات الركيزة في الفحص أعلى من قيم Km الخاصة بكل منها. هذا يمكن أن يجعل من الصعب اكتشاف التثبيط في مقايسات الحركية ، خاصة إذا كانت المثبطات تنافسية. ثانيا ، المركبات الشبيهة بالأنثراكينون المستخدمة في هذه الشاشة أبسط بكثير في التركيب من المثبط المعروف ، حمض اللاكايك A. نظرا لأن هذه الجزيئات تحتوي على عدد قليل من البدائل حول البنية الأساسية ، فقد توقعنا تفاعلات أضعف. في مقايسة التحكم المحتوية على DMSO ، تم الحصول على سرعة أولية من 111 ± 5 RFU / دقيقة (الشكل 7A). لاحظ أن هذا مشابه جدا للمعدل المبلغ عنه سابقا في غياب DMSO ويؤكد أن إضافة كميات منخفضة من DMSO لا يؤثر على النشاط المرصود. أدت إضافة مركبين إلى تقليل السرعة الابتدائية المرصودة ، بينما لم يكن لإضافة المركب الثالث أي تأثير على النشاط. تم استخدام السرعات الابتدائية لتحديد النسبة المئوية للنشاط الملاحظ في وجود كل مركب. عند 20 ميكرومتر ، أدت إضافة المركبين 1 و 2 إلى نشاط بنسبة ~ 80٪ ، بينما لوحظ نشاط بنسبة 100٪ في وجود المركب 3 ، مما يشير إلى أن هذا الجزيء لا يثبط الإنزيم (الجدول 1).

من المتوقع أن تظهر المثبطات تثبيطا يعتمد على التركيز. بعد ذلك ، أعيد فحص هذه الجزيئات بتركيز أعلى يبلغ 50 ميكرومتر. بالنسبة لهذه المجموعة من المقايسات ، كان لمقايسة التحكم المحتوية على DMSO سرعة أولية تبلغ 125 ± 7 RFU / دقيقة (الشكل 7B). هذه السرعة أعلى قليلا من المعدلات المحددة مسبقا ؛ ومع ذلك ، فإن هذه السرعات كلها قريبة نسبيا من الخطأ. مرة أخرى ، كان للمركب 3 تأثير ضئيل على السرعة الابتدائية ، في حين أن إضافة المركبات 1 و 2 قللت من السرعة الابتدائية المرصودة. كما هو متوقع ، عند التركيز الأعلى ، كان للمركب 1 تأثير أكبر على النشاط. عند 50 ميكرومتر ، أدت إضافة المركب 1 إلى نشاط بنسبة ~ 60٪ (الجدول 1). ومع ذلك ، فإن إضافة تركيز أعلى من المركب 2 لم يؤد إلى تثبيط أكثر قوة. كانت النسبة المئوية للنشاط التي لوحظت في وجود 50 ميكرومتر من المركب 2 مرة أخرى بالقرب من 80٪.

كما يتضح من البيانات المقدمة ، يمكن استخدام مقايسة مثيلة الحمض النووي القائمة على التألق الداخلي لفحص مثبطات DNMT المحتملة. تشير البيانات إلى أن المركب 1 والمركب 2 مثبطان محتملان ، في حين أن المركب 3 ليس كذلك. هناك حاجة إلى دراسات إضافية للتحقق من صحة المثبطات المحتملة كمثبطات DNMT1 حقيقية.

Figure 4
الشكل 4: التحكم في نشاط DNMT1. يحمي مثيلة الحمض النووي المزدوجة ذات الهيميثيل من انقسام Sau3A1. تمت إضافة DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS إلى مخاليط الفحص التي تحتوي على 1 ميكرومتر من الحمض النووي و 500 ميكرومتر من SAM. تم جمع العينات في النقاط الزمنية المحددة خلال حضانة مدتها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وتم هضمها باستخدام Sau3A1 ، وتم حلها عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي في 18٪ PAGE. هنا ، يتم عرض عينات 5 و 10 و 15 و 30 دقيقة. الممر الأول هو عنصر تحكم يفتقر إلى DNMT1. الاختصارات: DNMT1 = DNA methyltransferase 1 ؛ RFTS = تسلسل استهداف بؤر النسخ المتماثل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: التحكم في الفحص القائم على التألق. تمت إضافة DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS (تركيز نهائي 10 نانومتر) و Gla I (0.8 U) بالتتابع إلى المقايسات الثلاثية التي تحتوي على ركيزة DNA 20 نانومتر و 500 ميكرومتر SAM. لم يكن لإضافة DNMT1 (الدوائر الزرقاء) أو المخزن المؤقت (الدوائر الحمراء) وحدها أي تأثير على مضان الخلفية. تؤدي إضافة Gla I إلى جميع المقايسات إلى توليد مضان في المقايسات التي تحتوي على DNMT1 ، ولكن ليس في المقايسات التي لا تحتوي عليها. الاختصارات: DNMT1 = DNA methyltransferase 1 ؛ RFTS = تسلسل استهداف بؤر النسخ المتماثل ؛ RFU = وحدات مضان نسبية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: آثار تفاعل التألق. احتوت المقايسات الثلاثية على ركيزة DNA 10 نانومتر و 10 ميكرومتر SAM. (أ) تمت إضافة DNMT1 (2 نانومتر) و Gla I (0.8 U) التي تفتقر إلى RFTS إلى ثلاثة مقايسات (زرقاء) ، وأضيفت Gla I (0.8 U) وحدها إلى ثلاثة مقايسات (حمراء). لوحظ توليد مضان قوي فقط في المقايسات التي تحتوي على كلا الإنزيمين. (ب) تم طرح متوسط تتبع تفاعل Gla I من آثار تفاعل DNMT1 + Gla I. يتم عرض متوسط الخطأ المعياري لمتوسط البيانات الثلاثية. يعطي تركيب الجزء الخطي من التتبع سرعة أولية تبلغ 113 ± 2 RFU / دقيقة. الاختصارات: DNMT1 = DNA methyltransferase 1 ؛ RFTS = تسلسل استهداف بؤر النسخ المتماثل ؛ RFU = وحدات مضان نسبي ؛ SAM = S-أدينوسيل ميثيونين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: نشاط مثيلة الحمض النووي في وجود مثبطات محتملة. تم فحص نشاط مثيلة الحمض النووي ل DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في وجود DMSO (أسود) أو المركب 1 (أحمر) أو المركب 2 (أزرق) أو المركب 3 (أخضر). كانت آثار التفاعل المصححة عند مركب 20 ميكرومتر (A) ومركب 50 μM (B) مناسبة لتحديد السرعة الابتدائية. أدت إضافة المركبين 1 و 2 إلى تقليل السرعة المرصودة ، بينما كان للمركب 3 تأثير ضئيل على النشاط. يتم عرض متوسط الخطأ المعياري لمتوسط المقايسات الثلاثية. الاختصارات: DNMT1 = DNA methyltransferase 1 ؛ RFTS = تسلسل استهداف بؤر النسخ المتماثل ؛ RFU = وحدات مضان نسبي ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: السرعات الأولية والنسبة المئوية للأنشطة التي لوحظت في وجود مثبطات جزيئات صغيرة محتملة. تم تحديد السرعة الابتدائية عن طريق تركيب الجزء الخطي الأولي من آثار التفاعل المصححة على خط. يتم الإبلاغ عن الخطأ المرتبط ب FIT. تم تحديد النسبة المئوية للنشاط بقسمة المعدل المحدد في وجود المركب على المعدل المحدد في تفاعل التحكم DMSO وضربه في 100 ؛ تم نشر الخطأ المرتبط. الاختصارات: Cmpd = مركب; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ RFU = وحدات مضان نسبية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتحديد وتوصيف مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي ، يجب قياس نشاط الإنزيم. توجد عدة طرق لفحص نشاط ميثيل ترانسفيراز DNA. عادة ما يتم رصد النشاط باستخدام النشاط الإشعاعي. يمكن قياس نقل مجموعة الميثيل الموسومة من SAM29،30،31،32،33،34. كما تم وصف المقايسات القائمة على الهلام التي تستخدم نوكلياز داخلية حساسة للميثيل35,36. عادة ما تكون هذه الفحوصات متقطعة وتتطلب خطوات متعددة لفحص النشاط. هنا ، يتم وصف مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بنوكلياز الداخلي للكشف عن مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي المحتملة. هذه التقنية لها العديد من المزايا. الفحص بسيط نسبيا. لا يتطلب تقنيات فصل (على سبيل المثال ، الكهربائي ، ربط المرشح) للحصول على إشارة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفحص مستمر ، مما يسمح بجمع البيانات في الوقت الفعلي. تم مؤخرا وصف مقايسة حركية مستمرة مختلفة لنشاط المثيلة39. ومع ذلك ، يتطلب هذا الفحص ثلاثة إنزيمات اقتران لتوليد إشارة طيفية. يتطلب الفحص الموصوف هنا إنزيم اقتران واحد.

يتم إجراء فحوصات نشاط DNMT هذه عن طريق إنشاء محلول فحص يحتوي أولا على جميع مكونات الفحص باستثناء الإنزيمات. تحتوي محاليل الفحص على الركائز والحمض النووي لدبوس الشعر و SAM. يتم أيضا تضمين 0.1 مجم / مل BSA بشكل روتيني في المقايسات. مع التركيزات المنخفضة للغاية (في النطاق النانوي) للحمض النووي و DNMT1 المستخدمة في الفحص ، يزيد BSA من تركيز البروتين العام للمساعدة في منع الالتصاق بأطراف الماصات والأنابيب وألواح المعايرة الدقيقة والإهانات البيئية التي قد تؤثر على نشاط الإنزيم. ثم يبدأ التفاعل بإضافة إنزيمات إلى محاليل الفحص. يجب مراعاة هذه التخفيفات عند تحديد التركيزات النهائية لجميع مكونات الفحص. تبدأ التفاعلات بإضافة 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم إلى 95 ميكرولتر من محلول الفحص. لذلك ، فإن تركيزات DNA و SAM و BSA في محاليل الفحص هي 1.05x التركيز النهائي المطلوب. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك حاجة إلى 10 نانومتر من الحمض النووي ، يتم إنشاء محاليل الفحص باستخدام 10.5 نانومتر من الحمض النووي. تركيز DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في محلول الإنزيم هو 20x التركيز النهائي المطلوب. هنا ، تم استخدام DNMT1 الذي يفتقر إلى 40 نانومتر RFTS في محلول الإنزيم بحيث كان التركيز النهائي ل DNMT1 في كل فحص 2 نانومتر.

نظرا لأن Gla I هو إنزيم متاح تجاريا ، فإن كميته تعطى بالوحدات (U) كما هو منصوص عليه من قبل الشركة المصنعة. تحتوي محاليل الإنزيم المتولدة على 0.16 وحدة / ميكرولتر Gla I بحيث يتم إضافة إجمالي 0.8 وحدة من Gla I إلى كل بئر. لتوفير تكاليف الكاشف ، يتم تحضير كميات صغيرة من محاليل الإنزيم المناسبة ، ثم يتم نقل هذه المحاليل إلى ألواح مخروطية القاع مكونة من 96 بئرا. باستخدام ماصات متعددة القنوات ، يتم نقل 5 ميكرولتر من محاليل الإنزيم من الصفيحة ذات القاع المخروطي إلى محاليل الفحص في لوحة نصف المنطقة السوداء المكونة من 96 بئرا. تسمح هذه العملية ببدء صف من المقايسات في وقت واحد. بدلا من ذلك ، مع إعداد لوحة فحص مختلفة ، يمكن وضع محاليل الإنزيم في خزانات الكاشف ، ومن ثم يمكن استخدام ماصات متعددة القنوات لإضافة إنزيم إلى محاليل الفحص. ومع ذلك ، سيتطلب هذا النهج كميات أكبر من محلول الإنزيم بسبب نفايات استرداد السوائل في الخزانات. نقوم بإجراء المقايسات في 96 لوحة نصف مساحة البئر ؛ يسمح حجم البئر الأصغر في هذه الألواح بحجم فحص إجمالي أصغر (100 ميكرولتر) من الألواح التقليدية المكونة من 96 بئرا ، مما يوفر مرة أخرى تكاليف الكاشف.

تتطلب مقايسة مثيلة الحمض النووي الموصوفة هنا الحمض النووي للركيزة hemimethylated بسبب خصوصية اقتران endonuclease Gla I. هذا يجعل الفحص جيدا بشكل خاص لفحص نشاط DNMT1 ، حيث أن هذا الإيزوزيم يثيل الحمض النووي1 بشكل تفضيلي. لا تظهر إيزوزيمات DNMT3 تفضيلا بين الحمض النووي غير الميثيل والحمض النووي نصف الميثيل1. وبالتالي ، يمكن استخدام هذا الفحص لفحص نشاط إيزوزيمات DNMT3 أيضا. في الواقع ، تم تقييم تثبيط DNMT3a بواسطة جزيئات صغيرة باستخدام هذا الفحص26،27،41. تعني متطلبات الحمض النووي للركيزة نصف الميثيل أنه لا يمكن استخدام هذا الفحص لفحص خصوصية الركيزة أو التفضيل بين مواقع CpG غير الميثيل و hemimethylated.

يعتمد هذا الفحص على إشارة طيفية: الزيادة في التألق عندما يتم فصل الفلوروفور والمطفأ. وبالتالي ، يمكن للجزيئات الصغيرة التي تتألق أو تطفئ مضان أن تتداخل مع الفحص. أحد أسباب إجراء التحكم المحتوي على Gla I لكل حالة فحص هو التحقق من هذا الاحتمال. يمكن حساب الخصائص الطيفية للجزيء الصغير ببساطة باستخدام بيانات التحكم Gla I (على سبيل المثال ، إذا كان للجزيء إشارة مضان ضعيفة). ومع ذلك ، إذا كان الجزيء فلورسنت بقوة أو مخمد قوي ، فلا يمكن استخدام هذا الاختبار للكشف عن نشاط مثيلة الحمض النووي.

الشاشة الموضحة هنا هي اختبار أولي للكشف عن مثبطات DNMT المحتملة. يجب التحقق من صحة المركبات التي هي "ضربات" في الشاشة الأولية في المقايسات الثانوية للتأكد من أنها مثبطات DNMT حقيقية. نظرا لأن هذا الفحص عبارة عن مقايسة حركية مقترنة ، فإن مجرد ملاحظة انخفاض في توليد التألق في وجود جزيء صغير معين لا يعني بالضرورة أن المركب يثبط ميثيل ترانسفيراز. جزيء صغير قادر على تثبيط إنزيم اقتران Gla I سيؤدي أيضا إلى انخفاض ملحوظ في توليد مضان. تتضمن الشاشة الثانوية البسيطة تحديد نشاط Gla I في وجود وغياب المثبطات المحتملة. لهذا الفحص ، يتم استخدام الحمض النووي لدبوس الشعر المروي داخليا بالكامل كركيزة26,41. يمكن أيضا استخدام المقايسات الإضافية المصممة لفحص التثبيط المعتمد على التجميع وإقحام الحمض النووي كمقايسات ثانوية لمزيد من التحقق من صحة المثبطات المحتملة26,41. في البيانات المقدمة هنا ، تم تحديد المركب 1 والمركب 2 كمثبطات DNMT1 محتملة. باستخدام مجموعة متنوعة من المقايسات الثانوية ، تم التحقق من صحة المركب 1 كمثبط مباشر ل DNMT141. أظهر هذا العمل المنشور سابقا أن المركبات التي تحتوي على بدائل ضخمة في موضع C2 لنواة الأنثراكينون تبدو مثبطات أكثر فعالية ل DNMT1. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم المحددات الهيكلية لتثبيط DNMT1 بشكل كامل.

الفحص المقترن الموصوف هنا له العديد من الاستخدامات المحتملة. يمكن استخدام الفحص لتجارب حركية الحالة المستقرة. نظرا لأن الفحص مستمر ، فإن تحديد السرعات الابتدائية أمر بسيط. تم استخدام هذا الفحص سابقا لفحص معلمات الحركية العيانية (أي Km و Vmax و kcat) لمختلف بروتينات DNMT1 المقطوعة40. تم استخدام الفحص لفحص مجموعة صغيرة من الجزيئات لتثبيط DNMT1 41 وتقييم خصوصية الإيزوزيم للمثبطات المحددة من خلال فحص تأثيرها على نشاط DNMT3a26،27،41. كما تم استخدام الفحص لتوصيف المثبطات. تم تحديد آلية التثبيط والفعالية (على سبيل المثال ، Ki ، IC50) لكل من مجالات البروتين المثبط36,40 والجزيئات الصغيرة الجديدة27,41 باستخدام مقايسة الحركية المقترنة. كما تم تكييف الفحص للاستخدام في حملة هيئة تحرير الشام. في هذه الحالة ، تم تصغير الفحص إلى تنسيق 384 بئرا واستخدامه كاختبار نقطة نهاية للشاشة الأولية26. وبالتالي ، فإن مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق الموصوفة هنا هي مقايسة متعددة الاستخدامات يمكن استخدامها لفحص نشاط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي وتسمح بتحديد وتوصيف مثبطات الجزيئات الصغيرة لهذه المعدلات اللاجينية المهمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون جامعة باكنيل وقسم الكيمياء على دعمهم لهذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates ThermoFisher 249570
Bovine Serum Albumin NEB B9000S
compound 1 ChemBridge 5812086 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2 ChemBridge 6722175 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3 ChemBridge 5249376 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol Sigma D0632
Gla I SibEnzyme E494 methyl-sensitive endonuclease
Glycerol RPI G22025
Magnesium Chloride Sigma M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) IDT custom synthesized internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate Sigma G1501
S-adenosylmethionine Sigma A4377 methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base RPI T60040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية العدد 186 الكيمياء الحيوية العدد ,
مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Switzer, R., Ward, K. A., Medrano,… More

Switzer, R., Ward, K. A., Medrano, J. Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (186), e62949, doi:10.3791/62949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter