Summary
As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.
Abstract
A metilação do DNA, uma forma de regulação genética epigenética, é importante para a função celular normal. Nas células, as proteínas chamadas DNA metiltransferases (DNMTs) estabelecem e mantêm o padrão de metilação do DNA. Mudanças no padrão normal de metilação do DNA estão ligadas ao desenvolvimento e progressão do câncer, tornando os DNMTs potenciais alvos de medicamentos contra o câncer. Assim, identificar e caracterizar novos inibidores de pequenas moléculas dessas enzimas é de grande importância. Este trabalho apresenta um protocolo que pode ser utilizado para o rastreamento de inibidores da DNA metiltransferase. O ensaio de cinética acoplada contínua permite que as velocidades iniciais de metilação do DNA sejam determinadas na presença e ausência de potenciais inibidores de moléculas pequenas. O ensaio usa a endonuclease sensível à metila Gla I para acoplar a metilação de um substrato de DNA hemimetilado à geração de fluorescência.
Este ensaio contínuo permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real. A realização do ensaio em pequenos volumes em placas de microtitulação reduz o custo dos reagentes. Usando este ensaio, uma pequena tela de exemplo foi conduzida para inibidores de DNMT1, a isoenzima DNMT mais abundante em humanos. O produto natural de antraquinona altamente substituído, o ácido lacáico A, é um potente inibidor competitivo de DNA da DNMT1. Aqui, examinamos três potenciais inibidores de moléculas pequenas - antraquinonas ou moléculas semelhantes à antraquinona com um a três substituintes - em duas concentrações para descrever o protocolo de ensaio. As velocidades iniciais são usadas para calcular a porcentagem de atividade observada na presença de cada molécula. Um dos três compostos examinados exibe inibição dependente da concentração da atividade DNMT1, indicando que é um inibidor potencial da DNMT1.
Introduction
A metilação do DNA é uma importante marca epigenética que regula a expressão gênica e a estrutura da cromatina. A metilação ocorre predominantemente nos dinucleotídeos CpG — citosina seguida de guanosina; o grupo metilo é adicionado à posição 5 da citosina. Padrões corretos de metilação do DNA e, portanto, a expressão gênica adequada, são necessários para o desenvolvimento e a função celular apropriados. Muitos estados patológicos têm sido associados a alterações no padrão normal de metilação 1,2,3. Por exemplo, existe uma ligação entre o início e a progressão do câncer e alterações no padrão de metilação do DNA. Normalmente, as células cancerosas exibem níveis gerais mais baixos de metilcitosina, o que contribui para a instabilidade do genoma. Ao mesmo tempo, a metilcitosina que está presente no genoma está concentrada nas regiões promotoras dos genes supressores de tumor, o que leva ao silenciamento genético dessas proteínas importantes. Notavelmente, as alterações epigenéticas são dinâmicas e reversíveis, ao contrário das mutações no DNA associadas à tumorigênese. Isso tornou as proteínas envolvidas na regulação epigenética gênica alvos de drogas interessantes 2,4.
As metiltransferases de DNA (DNMTs) são as proteínas responsáveis por gerar e manter os padrões de metilação do DNA. Três isozimas cataliticamente ativas, DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, existem em humanos. Durante o desenvolvimento e diferenciação, as metiltransferases de novo, DNMT3a e DNMT3b, estabelecem padrões de metilação. Ambas as enzimas podem se ligar à proteína DNMT3L cataliticamente inativa para formar complexos que exibem atividade aumentada 1,5. Após a divisão celular, as células filhas contêm DNA hemimetilado - DNA contendo metilcitosina em apenas uma fita do duplex - porque o DNA recém-sintetizado é desprovido de marcas de metilação. A principal função do DNMT1 é metilar esse DNA hemimetilado, restabelecendo assim o padrão completo de metilação 1,5.
As ligações entre a atividade da DNMT e o câncer estão bem estabelecidas. A superexpressão de DNMT1, seja por mecanismos transcricionais ou pós-traducionais, é consequência de várias vias oncogênicas comuns 6,7,8,9. Abordagens genéticas para menor atividade da DNMT1 usando alelos hipomórficos resultam em diminuição da formação tumoral em camundongos Apc(Min)10. Os oligonucleotídeos antisense que derrubam a DNMT1 inibem a neoplasia em modelos de cultura celular e tumores de camundongos11,12. Assim, inibir a atividade da DNMT1 parece ser uma abordagem promissora de terapia contra o câncer. No entanto, os papéis que as isozimas DNMT3 desempenham não são tão simples. As mutações DNMT3a são encontradas na leucemia mieloide aguda13 e na síndrome mielodisplásica14. Pelo menos uma das mutações identificadas demonstrou diminuir a atividade de metilação do DNA da enzima15. No entanto, o DNMT3b é superexpresso no câncer de mama16 e no câncer colorretal17. Com as várias isozimas DNMT desempenhando papéis diferentes na carcinogênese, a identificação de inibidores específicos de isoenzimas será crítica. Não só esses compostos serão úteis para o desenvolvimento de terapias, mas os inibidores específicos da isoenzima também seriam uma ferramenta inestimável para dissecar o papel de cada isoenzima DNMT na etiologia do câncer.
Vários inibidores de DNMT têm sido relatados na literatura. Os inibidores conhecidos da DNMT podem ser divididos em duas classes: nucleosídeo e não nucleosídeo. Os inibidores de nucleosídeos são tipicamente análogos da citidina. Esses compostos são incorporados ao DNA e retêm covalentemente DNMTs. 5-azacitidina e 5-aza-2'-desoxicitidina foram aprovados para o tratamento da síndrome mielodisplásica e leucemia mieloide aguda 4,18. A alta toxicidade, a baixa biodisponibilidade e a instabilidade química desses compostos apresentam problemas. O trabalho em andamento está examinando a eficácia da próxima geração de inibidores de nucleosídeos; SGI-110, derivado de 5-aza-2'-desoxicitidina, é um exemplo19,20. Os inibidores de nucleosídeos não são específicos da isoenzima e inativarão qualquer isoenzima DNMT encontrada. Portanto, o tratamento com um agente nucleosídeo-desmetilante resulta na depleção de todas as isozimas DNMT 4,18. Os inibidores não nucleosídeos não precisam ser incorporados ao DNA para exercer seus efeitos inibitórios. Em vez disso, essas moléculas se ligam diretamente aos DNMTs, introduzindo a possibilidade de inibição específica da isozima. Vários inibidores não nucleosídeos foram descobertos até o momento, incluindo SGI-102721, hidralazina 22, procainamida 23, RG108 e derivados 24, e produtos naturais, (−)-epigalocatequina 3-galato (EGCG)25 e ácido lacáico A 26,27. A maioria dos inibidores não-nucleosídeos descobertos até o momento não são seletivos de isoenzima ou exibem preferências fracas para uma isoenzima DNMT. Além disso, a potência dessas moléculas precisa ser melhorada, principalmente nas células 4,18. Assim, há uma necessidade de descobrir ou desenvolver inibidores de DNMT mais potentes e seletivos de isozima.
Um obstáculo para a descoberta de novos inibidores de pequenas moléculas de DNMTs são os ensaios laboriosos tradicionalmente usados para examinar a atividade da DNMT28. Os ensaios geralmente são descontínuos com várias etapas. A atividade enzimática dos DNMTs ainda é rotineiramente ensaiada utilizando S-adenosilmetionina radioativa (SAM)29,30,31,32,33,34. Ensaios não radioativos para metilação do DNA também foram desenvolvidos. Por exemplo, ensaios utilizando endonucleases de restrição sensíveis à metila e eletroforese para separar os produtos da digestão têm sido descritos35,36. Esses tipos de ensaios descontínuos e em várias etapas não são facilmente passíveis de descoberta de medicamentos. Desde meados dos anos 2000, vários ensaios de metilação de DNA com maior rendimento foram desenvolvidos28. Um ensaio de proximidade de cintilação foi utilizado para triagem de inibidores de DNMT137. Outro ensaio utilizando endonuclease de restrição sensível à metila foi utilizado para rastrear inibidores de DNMT3a25,38. Embora ambos os ensaios tenham permitido um rendimento mais elevado do que os ensaios tradicionais de metilação do ADN, os ensaios requerem várias etapas e não permitem a observação da atividade de metilação em tempo real. Mais recentemente, um ensaio de cinética contínua tem sido descrito que acopla a formação de S-adenosilhomocisteína (HAS), um produto da reação de metilação, à alteração espectroscópica a 340 nm associada à oxidação do NADPH39. Este ensaio utiliza três enzimas de acoplamento para gerar um sinal espectroscópico.
Desenvolvemos um ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease baseado em fluorescência que utiliza uma única enzima de acoplamento comercialmente disponível e pode gerar dados em tempo real (Figura 1). Um oligonucleotídeo hairpin contendo três metilcitosinas é usado como substrato. O DNA do substrato contém um fluoróforo na extremidade 5' e um quencher na extremidade 3'. A metilação do sítio CpG hemimetilado gera o sítio de clivagem para a endonuclease Gla I — GCGC totalmente metilado. A clivagem Gla I do oligonucleotídeo do produto libera o fluoróforo do quencher e gera fluorescência em tempo real. O ensaio pode ser usado para examinar a atividade de qualquer isoforma de DNMT; no entanto, observa-se maior atividade com DNMT1, pois esta isoenzima preferencialmente metila o DNA hemimetilado 1,5. Atividade ainda mais robusta é observada se o domínio RFTS (Replication Foci Targeting Sequence) autoinibitório for removido da DNMT1. Este domínio, encontrado na região reguladora N-terminal, liga-se ao sítio catalítico e impede a ligação do DNA. A remoção dos primeiros ~600 aminoácidos resulta em uma enzima truncada que é significativamente mais ativa do que a enzima de comprimento total (~640 vezes maior em kcat/Km)40. Esta forma ativada da enzima, referida como DNMT1 sem RFTS (aminoácidos 621-1616), permite a identificação mais fácil de inibidores devido ao seu aumento do poder catalítico. Este artigo apresenta um protocolo para utilizar DNMT1 sem RFTS em ensaios para triagem de potenciais inibidores de moléculas pequenas. Usando o ensaio contínuo acoplado à endonuclease, a velocidade inicial é determinada na presença e ausência de algumas moléculas pequenas. Cada inibidor potencial é examinado em duas concentrações para procurar inibição DNMT1 dependente da concentração. A porcentagem de atividade observada na presença das pequenas moléculas foi calculada em cada caso.
Figura 1: Ensaio de metilação do DNA. Um DNA de grampo de cabelo hemimetilado com um fluoróforo na extremidade 5' e um quencher na extremidade 3' é usado como substrato. DNMT1 catalisa a transferência do grupo metilo da S-adenosilmetionina para o sítio CpG não metilado, gerando S-adenosilhomocisteína e DNA totalmente metilado. O produto de DNA contém o local de clivagem para a endonuclease Gla I, que cliva os sítios GCGC totalmente metilados. A clivagem do DNA do produto libera o fluoróforo de 5' do quencher de 3', gerando fluorescência. Abreviaturas: Fl = fluoróforo; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferase 1; SAM = S-adenosilmetionina; HAS = S-adenosilhomocisteína. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Prepare soluções de ensaio para a tela
NOTA: As concentrações de substratos utilizadas neste ensaio podem ser adaptadas. Para DNMT1 sem RFTS, os valores de Km determinados experimentalmente para o substrato de DNA do hairpin e SAM são 1–2 nM e 2 μM, respectivamente26,40.
- Preparar 600 μL de cada condição de ensaio que está sendo testada em tubos de microcentrífuga sobre gelo.
NOTA: O volume total de solução de ensaio necessário depende do número de replicações que estão sendo conduzidas. Cada condição de ensaio foi executada em triplicado para este protocolo.- Adicione ddH 2O e tampão de metilação 5x (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamato de potássio, 5 mM ditiotreitol (DTT), 25% de glicerol) a cada tubo para atingir uma concentração final de 1x tampão. Para ensaios contendo composto de 20 μM, adicionar 472 μL de ddH2O e 120 μL 5x tampão. Para ensaios contendo 50 μM de composto, adicionar 470 μL de ddH2O e 120 μL de tampão 5x.
- Adicionar 3,15 μL de 20 mg/mL de albumina sérica bovina (ASC) a cada amostra.
- Adicionar 2 μL de substrato de DNA hairpin de 3,15 μM e 1,33 μL de SAM de 4,75 mM a cada amostra.
NOTA: A concentração de substratos na mistura de solução de ensaio é de 1,05x as concentrações finais desejadas. - Adicionar inibidor a uma concentração final de 21 μM (1,26 μL de 10 mM) ou 52,5 μM (3,15 μL de 10 mM) às amostras adequadas. Adicionar uma quantidade equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO) a uma amostra de controlo.
NOTA: A concentração do inibidor utilizado no ecrã pode ser variada. A concentração final máxima de DMSO deve ser de ≤5% (v/v). Concentrações de DMSO até 5% (v/v) não têm efeito sobre a atividade observada no ensaio26.
- Misture as soluções por vórtice (3.000 rpm) por 3 s. Gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa (1.200 × g) para garantir que a solução seja coletada no fundo do tubo.
- Aliquota 95 μL de cada solução de ensaio em 6 poços consecutivos em uma placa preta de 96 poços de meia área (Figura 2).
NOTA: Estes ensaios de triagem foram realizados em dois lotes. Primeiro, 20 amostras de inibidores de μM (4 condições totais) foram examinadas, seguidas pelas amostras de inibidores de 50 μM (4 condições totais).
Figura 2: Configuração da placa de ensaio. Cada solução de ensaio é aliquotada em seis poços na placa preta de 96 poços: controle DMSO (azul), composto 1 (verde), composto 2 (vermelho) e composto 3 (amarelo). Tanto o DNMT1 com falta de RFTS quanto o Gla I serão adicionados a três poços. Como controle, só Gla I será adicionada aos outros três poços. Abreviaturas: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA metiltransferase 1; DMSO = dimetilsulfóxido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Preparar soluções enzimáticas para triagem
NOTA: DNMT1 sem RFTS pode ser expresso em E. coli e purificado até homogeneidade. Procedimentos de expressão e purificação para DNMT1 sem RFTS foram descritos anteriormente41. O volume de enzima necessário depende do número de ensaios que estão sendo conduzidos. Aqui, quatro ensaios diferentes estão sendo realizados em cada conjunto; cada ensaio é completado em triplicata.
- Preparar 75 μL de cada solução enzimática em tubos de microcentrífuga sobre gelo.
NOTA: Serão necessárias duas soluções enzimáticas. Uma solução conterá DNMT1 e Gla I; o outro conterá apenas Gla I.- Adicionar ddH 2O e tampão de metilação 5x (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamato de potássio, 5 mM DTT, 25% de glicerol) a cada tubo para atingir uma concentração final de 1x tampão. Para a solução da enzima Gla I, adicionar 15 μL de tampão 5x e 58,8 μL ddH2O. Para a solução enzimática DNMT1+Gla I, adicionar 15 μL de tampão 5x e 58,2 μL ddH2O.
- Adicionar 1,2 μL de 10 U/μL Gla I a cada solução para uma concentração final de 0,16 U/μL.
- Adicionar 0,6 μL de DNMT1 com falta de RFTS de 5 μM para uma concentração final de 40 nM à solução DNMT1+Gla I.
- Bata suavemente para misturar as soluções. Gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa (1.200 × g) para garantir que a solução seja coletada no fundo do tubo.
- Aliquota 12 μL de cada solução enzimática em 6 poços em uma placa de 96 poços de fundo cônico (Figura 3).
Figura 3: Configuração da placa enzimática. As soluções Gla I (cinza) e DNMT1+Gla I (azul) são alíquotas em seis poços na placa de 96 poços. Usando uma pipeta multicanal, a enzima pode ser adicionada a uma linha de soluções de ensaio simultaneamente. Para cada condição de ensaio (seis poços), três poços receberão DNMT1+Gla I e três poços receberão apenas Gla I. Abreviatura: DNMT1 = DNA metiltransferase 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Execute o ensaio e analise os dados.
- Pré-aqueça o leitor de placas a 37 °C. Insira a placa preta que contém as soluções de ensaio. Agitar a placa (orbital duplo a 425 cpm durante 5 s) e ler a fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 528 nm. Incubar a placa a 37 °C durante 5 min.
NOTA: Alternativamente, filtros com cortes de comprimento de onda adequados podem ser usados para as leituras de fluorescência. - Remova a placa de ensaio. Adicionar 5 μL de solução enzimática a cada poço e misturar pipetando para cima e para baixo.
Observação : use pipes multicanal para que uma linha de amostras pode ser iniciada simultaneamente. - Insira a placa no leitor de placas. Grave a fluorescência a cada 53 s por 30 min. Agite a placa (orbital duplo a 425 cpm durante 4 s) antes de cada leitura.
- Ensaios de controle de Gla I triplicados médios para cada condição. Subtraia o traço médio da reação de controle contendo Gla I dos traços triplicados obtidos na presença de DNMT1 sem RFTS. Determine o erro médio e padrão da média para as replicações corrigidas.
- Plote o traço médio de reação corrigida e ajuste a porção linear inicial a uma linha para determinar a velocidade inicial.
- Determine a porcentagem de atividade dividindo a velocidade observada na presença de um composto pela velocidade observada na reação de controle contendo DMSO e multiplicando por 100.
4. Controlo adicional do ensaio — adição sequencial de enzimas
- Preparar 550 μL de solução de ensaio num tubo de microcentrífuga sobre gelo. Adicionar 110 μL de tampão de metilação 5x, 3,88 μL de substrato de DNA hairpin de 3,15 μM, 6,43 μL de SAM de 47,5 mM, 3,06 μL de BSA de 20 mg/mL e 426,6 μL de ddH2O.
- Misture a solução por vórtice (3.000 rpm) por 3 s. Gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa (1.200 × g) para garantir que a solução seja coletada no fundo do tubo.
- Aliquota 90 μL da solução de ensaio em 6 poços consecutivos em uma placa preta de 96 poços de meia área.
- Preparar as soluções enzimáticas DNMT1 no gelo. Adicione 4 μL de 5x tampão de metilação, 0,76 μL de 5 μM de DNMT1 sem RFTS e 15,24 μL de ddH2O a um tubo. Adicionar 4 μL de tampão de metilação 5x e 16 μL de ddH2O a outro tubo.
- Bata suavemente para misturar as soluções. Gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa (1.200 × g) para garantir que a solução seja coletada no fundo do tubo.
- Adicionar 5 μL da solução contendo DNMT1 a três poços na placa preta de 96 poços de meia área. Adicionar 5 μL da solução de controle tampão aos outros três poços.
- Colocar a placa de microtitulação no leitor de placas pré-aquecida a 37 °C. Agitar a placa (orbital duplo a 425 cpm durante 3 s) e ler a fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 528 nm. Repita o shake e leia a cada 60 s por 30 min.
- Enquanto a placa de ensaio estiver no leitor de placas, prepare a solução Gla I no gelo. Adicionar 8 μL de tampão de metilação 5x, 0,64 μL de 10 U/μL Gla I e 31,4 μL de ddH2O a um tubo de microcentrífuga. Bata suavemente para misturar a solução. Gire a amostra por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa (1.200 × g) para garantir que a solução seja coletada no fundo do tubo.
- Aliquota 6 μL da solução de Gla I em 6 poços em uma placa de fundo cônico de 96 poços.
- Após a leitura inicial de 30 minutos, remova a placa preta do leitor de placas. Adicione 5 μL de solução Gla I a todos os 6 poços e misture pipetando para cima e para baixo.
NOTA: Use um pipete multicanal para que todos os poços possam ser iniciados simultaneamente. - Coloque a placa preta de volta no leitor de placas. Grave a fluorescência a cada 35 s por 35 min. Agite a placa (orbital duplo a 425 cpm durante 3 s) antes de cada leitura.
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Representative Results
DNMT1 ativo é um pré-requisito para esta análise. A DNMT1 sem RFTS foi expressa em E.coli e purificada até a homogeneidade seguindo procedimentos previamente publicados41. Para garantir que a enzima purificada estivesse ativa, um ensaio descontínuo acoplado à endonuclease foi usado para examinar a atividade de metilação do DNA36. Este ensaio utiliza um DNA duplex de 32 pares de bases com um único CpG hemimetilado posicionado em um local de clivagem Sau3A1. Sau3A1 pode clivar o DNA do substrato hemimetilado; no entanto, a clivagem é bloqueada quando o DNA está totalmente metilado. O DNMT1 sem RFTS foi adicionado a ensaios contendo 1 μM de DNA e 0,5 mM SAM, e as alíquotas foram removidas e congeladas por flash ao longo de 30 min. As amostras foram posteriormente digeridas com Sau3A1 e os produtos separados por eletroforese em gel. Como mostrado na Figura 4, o DNA é protegido da clivagem à medida que o tempo de reação aumenta, indicando que o DNMT1 sem RFTS está metilando o DNA hemimetilado. A maior parte do DNA do substrato de 1 μM originalmente presente no ensaio foi convertida em produto ao longo do curso de tempo de 30 minutos.
O ensaio acoplado à endonuclease descrito neste trabalho permite a observação da atividade de metilação do DNA em tempo real como um aumento na fluorescência. A chave para o sucesso deste ensaio é a sensibilidade metílica da endonuclease Gla I. Gla I não cliva eficientemente o DNA do substrato hemimetilado, mas cliva o DNA do produto totalmente metilado (Figura 1). A clivagem do DNA hairpin é necessária para liberar o fluoróforo do quencher e gerar um aumento na fluorescência. Para demonstrar que as enzimas estão funcionando como esperado, uma reação de controle foi conduzida na qual as enzimas, DNMT1 e Gla I sem RFTS, foram adicionadas sequencialmente em vez de simultaneamente. Se o ensaio acoplado estiver funcionando corretamente, a adição de DNMT1 não deve afetar a fluorescência, pois não se espera que a metilação do substrato de DNA afete a fluorescência de fundo do DNA do hairpin extinto internamente. No entanto, a adição subsequente de Gla I a ensaios que continham a metiltransferase deve resultar em geração de fluorescência devido à clivagem do DNA do grampo de cabelo totalmente metilado. O próprio substrato de DNA do grampo de cabelo hemimetilado possui fluorescência de fundo (Figura 5); estes ensaios continham 20 nM de ADN hairpin e 500 μM SAM. RFTS-sem DNMT1 ou tampão foi adicionado aos ensaios, e a fluorescência foi seguida por 30 min.
Como visto na Figura 5, a fluorescência não é afetada pela DNMT1 sem RFTS na ausência da enzima de acoplamento (tons azuis continham DNMT1 sem RFTS de 10 nM, enquanto os tons vermelhos são o controle do buffer). Assim, a metilação do sítio CpG hemimetilado pelo DNMT1 não altera sensivelmente o sinal de fluorescência. No entanto, quando a Gla I foi adicionada a todos os poços, a geração de fluorescência robusta foi observada apenas nos ensaios que continham DNMT1 sem RFTS (Figura 5). Isso mostra que a metilação do DNA do substrato hemimetilado por DNMT1 é necessária para a clivagem de Gla I e a geração de fluorescência. Deve-se notar que o aumento da fluorescência observado neste ensaio de controle reflete a atividade da Gla I à medida que as enzimas foram adicionadas sequencialmente. Alternativamente, essas misturas de reação poderiam ser digeridas com Gla I, e os oligonucleotídeos resultantes poderiam ser separados por eletroforese para visualizar a clivagem e garantir que as enzimas estejam funcionando conforme o esperado.
Para usar este ensaio acoplado para determinar diretamente as velocidades iniciais do DNMT1, ambas as enzimas, DNMT1 sem RFTS e Gla I, precisam ser adicionadas simultaneamente. Contanto que a taxa de clivagem de Gla I do DNA do produto seja mais rápida do que a taxa de metilação do DNA por DNMT1, o sinal de fluorescência gerado refletirá a atividade de metilação do DNA. Para garantir que a atividade DNMT1 seja limitante da taxa, a concentração de DNMT1 pode ser variada mantendo todas as outras condições de ensaio constantes. A taxa de geração de fluorescência deve ser proporcional à concentração de DNMT1. Isso já foi demonstrado anteriormente para DNMT1 sem RFTS sob as condições utilizadas aqui40. Ao utilizar este ensaio acoplado para examinar a atividade da DNMT, uma reação de controle contendo Gla I é realizada além da reação que contém DNMT1 e Gla I (Figura 6A). O controle Gla I tem várias funções. Subtrair o traço de reação de controle Gla I do traço de reação contendo DNMT permite a contabilização da clivagem lenta do substrato de DNA hemimetilado e da fluorescência de fundo. Os traços de reação corrigidos gerados refletem a atividade de metilação do DNA do DNMT1. O ajuste da porção linear inicial do traço de reação corrigido permite a determinação da velocidade inicial (Figura 6B). Com substrato de DNA hairpin de 10 nM e SAM de 10 μM, obteve-se uma velocidade inicial de 113 ± 2 RFU/min.
As antraquinonas substituídas demonstraram anteriormente inibir a atividade da DNMT1. O produto natural, o ácido lacáico A, uma antraquinona altamente substituída, é um potente inibidor competitivo do DNA da DNMT127. Alguns compostos com estruturas mais simples, um ou dois substituintes no núcleo da antraquinona, sendo um deles um substituinte aromático volumoso, também demonstraram inibir a DNMT1 de maneira competitiva em DNA41. Aqui, a capacidade de três antraquinonas substituídas ou moléculas semelhantes à antraquinona de inibir a atividade DNMT1 sem RFTS no ensaio acoplado Gla I foi examinada como um exemplo de como conduzir esses ensaios de triagem. Esses compostos continham de um a três substituintes, todos de um lado do núcleo de antraquinona (Tabela 1). As concentrações de substrato (10 nM de DNA e 10 μM SAM) utilizadas para estes ensaios são ~5x superiores ao Km para cada substrato. O sinal gerado no ensaio vem diretamente do DNA do substrato. Devido a isso, é difícil de testar em concentrações próximas ou abaixo de Km; simplesmente não há sinal suficiente para detectar. Essas concentrações de substrato foram escolhidas porque a atividade robusta é observada nessas condições na ausência de inibidores (Figura 6B). Outras concentrações de substrato poderiam ser usadas em ensaios de triagem. Por exemplo, a realização de uma tela em concentrações de SAM saturadas poderia ser usada como uma estratégia para enviesar a busca contra inibidores competitivos de SAM.
Cada ensaio continha o substrato de DNA hairpin, o cofator SAM doador de metila e um inibidor potencial ou DMSO como controle para a tela. Geramos rotineiramente soluções de 10 mM de compostos de triagem em DMSO para uso em ensaios. As antraquinonas, como as examinadas aqui, apresentam baixa solubilidade em soluções aquosas. Assim, para gerar estoques concentrados, o DMSO é usado como solvente. A adição de DMSO até 5% (v/v) de concentração final não impacta a atividade no ensaio26. No entanto, quando se trata de compostos com baixa solubilidade em solução aquosa, deve-se tomar cuidado para garantir que o composto seja solúvel na(s) concentração(ões) de triagem final(is) escolhida(s).
Para cada condição examinada na tela, um ensaio de controle contendo Gla I é realizado. Além de contabilizar a fluorescência de fundo e a clivagem lenta do DNA do grampo do substrato, esse controle permite determinar se o inibidor potencial interfere no sinal espectroscópico (por exemplo, é fluorescente). Após o início da reação pela adição de enzimas, a fluorescência foi medida por 30 min com um intervalo de tempo de 53 s nos dados de triagem. Este é o intervalo de tempo mais rápido disponível no leitor de placas neste laboratório ao ler uma placa inteira de 96 poços. Outros intervalos de tempo poderiam ser usados para gerar os traços de reação. Um intervalo de tempo apropriado dependerá do instrumento que está sendo utilizado e do número de poços que estão sendo lidos. Para garantir a reprodutibilidade, cada ensaio é conduzido em triplicado. O traço de controle médio contendo Gla I é subtraído dos traços de reação observados na presença de DNMT1 sem RFTS. A velocidade inicial da reação pode ser determinada ajustando a porção linear inicial dos traços de reação corrigidos.
Inicialmente, o impacto de três inibidores potenciais na geração de fluorescência foi examinado em uma concentração final de 20 μM. Concentrações mais altas dos inibidores potenciais foram escolhidas para triagem por dois motivos. Primeiro, as concentrações de substrato no ensaio estão acima de seus respectivos valores de Km . Isso pode dificultar a detecção de inibição em ensaios cinéticos, particularmente se os inibidores forem competitivos. Em segundo lugar, os compostos semelhantes à antraquinona utilizados nesta tela são significativamente mais simples em estrutura do que o inibidor conhecido, o ácido lacáico A. Como essas moléculas contêm apenas alguns substituintes ao redor da estrutura do núcleo, antecipamos interações mais fracas. No ensaio de controle contendo DMSO, obteve-se uma velocidade inicial de 111 ± 5 RFU/min (Figura 7A). Note-se que isso é muito semelhante à taxa relatada anteriormente na ausência de DMSO e confirma que a adição de baixas quantidades de DMSO não afeta a atividade observada. A adição de dois compostos diminuiu a velocidade inicial observada, enquanto a adição do terceiro composto não teve efeito sobre a atividade. As velocidades iniciais foram utilizadas para determinar a porcentagem de atividade observada na presença de cada composto. A 20 μM, a adição dos compostos 1 e 2 resultou em uma atividade percentual de ~80%, enquanto 100% de atividade percentual foi observada na presença do composto 3, indicando que essa molécula não inibe a enzima (Tabela 1).
Espera-se que os inibidores exibam inibição dependente da concentração. Em seguida, essas moléculas foram reexaminadas a uma concentração ainda maior, de 50 μM. Para este conjunto de ensaios, o ensaio de controle contendo DMSO teve uma velocidade inicial de 125 ± 7 RFU/min (Figura 7B). Esta velocidade é ligeiramente superior às taxas previamente determinadas; no entanto, essas velocidades são todas relativamente próximas dentro do erro. Novamente, o composto 3 teve pouco efeito sobre a velocidade inicial, enquanto a adição dos compostos 1 e 2 diminuiu a velocidade inicial observada. Como esperado, na concentração mais alta, o composto 1 teve um impacto maior na atividade. A 50 μM, a adição do composto 1 resultou em uma atividade percentual de ~60% (Tabela 1). No entanto, a adição de uma maior concentração de composto 2 não resultou em inibição mais robusta. A atividade percentual observada na presença de 50 μM do composto 2 foi novamente próxima de 80%.
Como pode ser visto nos dados apresentados, o ensaio de metilação do DNA baseado em fluorescência acoplado à endonuclease pode ser usado para rastrear potenciais inibidores de DNMT. Os dados indicam que o composto 1 e o composto 2 são inibidores potenciais, enquanto o composto 3 não é. Estudos adicionais são necessários para validar os potenciais inibidores como verdadeiros inibidores da DNMT1.
Figura 4: Controle de atividade DNMT1. A metilação hemimetilada do ADN duplex protege contra a clivagem do Sau3A1. O DNMT1 sem RFTS foi adicionado às misturas de ensaio contendo 1 μM de DNA e 500 μM de SAM. As amostras foram coletadas nos momentos indicados durante uma incubação de 30 min a 37 °C, digeridas com Sau3A1 e resolvidas por eletroforese em gel a 18% PAGE. Aqui, amostras de 5, 10, 15 e 30 minutos são mostradas. A primeira faixa é um controle sem DNMT1. Abreviaturas: DNMT1 = DNA metiltransferase 1; RFTS = Sequência de Direcionamento de Focos de Replicação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Controle de ensaio baseado em fluorescência. DNMT1 (concentração final de 10 nM) e Gla I (0,8 U) sem RFTS foram adicionados sequencialmente a ensaios triplicados contendo substrato de DNA hairpin de 20 nM e SAM de 500 μM. A adição de DNMT1 (círculos azuis) ou buffer (círculos vermelhos) isoladamente não teve efeito sobre a fluorescência de fundo. A adição de Gla I a todos os ensaios resulta em geração de fluorescência em ensaios que continham DNMT1, mas não em ensaios que não contêm. Abreviaturas: DNMT1 = DNA metiltransferase 1; RFTS = Sequência de Direcionamento de Foci de Replicação; RFU = unidades de fluorescência relativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Traços de reação de fluorescência. Os ensaios tripulados continham substrato de DNA hairpin de 10 nM e SAM de 10 μM. (A) DNMT1 (2 nM) e Gla I (0,8 U) sem RFTS foram adicionados a três ensaios (azul), e Gla I (0,8 U) sozinho foi adicionado a três ensaios (vermelho). A geração de fluorescência robusta é observada apenas nos ensaios que contêm ambas as enzimas. (B) O traço médio da reação Gla I foi subtraído dos traços de reação DNMT1+Gla I. O erro médio e padrão da média dos dados triplicados são mostrados. O ajuste da porção linear do traço dá uma velocidade inicial de 113 ± 2 RFU/min. Abreviaturas: DNMT1 = DNA metiltransferase 1; RFTS = Sequência de Direcionamento de Foci de Replicação; RFU = unidades de fluorescência relativa; SAM = S-adenosilmetionina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Atividade de metilação do DNA na presença de potenciais inibidores. A atividade de metilação do DNA do DNMT1 sem RFTS foi examinada na presença de DMSO (preto), composto 1 (vermelho), composto 2 (azul) ou composto 3 (verde). Traços de reação corrigidos em composto de 20 μM (A) e composto de 50 μM (B) foram ajustados para determinar a velocidade inicial. A adição dos compostos 1 e 2 diminuiu a velocidade observada, enquanto o composto 3 teve pouco impacto na atividade. O erro médio e padrão da média para os ensaios triplicados é mostrado. Abreviaturas: DNMT1 = DNA metiltransferase 1; RFTS = Sequência de Direcionamento de Foci de Replicação; RFU = unidades de fluorescência relativa; DMSO = dimetilsulfóxido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Velocidades iniciais e porcentagem de atividades observadas na presença de potenciais inibidores de moléculas pequenas. A velocidade inicial foi determinada ajustando-se a porção linear inicial dos traços de reação corrigidos a uma linha; o erro associado ao ajuste é relatado. A atividade percentual foi determinada dividindo-se a taxa determinada na presença de composto pela taxa determinada na reação de controle do DMSO e multiplicando-se por 100; o erro associado foi propagado. Abreviaturas: Cmpd = composto; DMSO = dimetilsulfóxido; RFU = unidades de fluorescência relativa. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Para identificar e caracterizar inibidores de DNA metiltransferases, a atividade da enzima deve ser medida. Existem vários métodos para examinar a atividade da DNA metiltransferase. A atividade é comumente monitorada usando radioatividade; a transferência do grupo metilo marcado da SAM pode ser quantificada 29,30,31,32,33,34. Ensaios à base de gel que utilizam endonucleases sensíveis à metila também foram descritos35,36. Esses ensaios geralmente são descontínuos e exigem várias etapas para examinar a atividade. Aqui, um ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease é descrito para rastrear potenciais inibidores da DNA metiltransferase. Esta técnica tem várias vantagens. O ensaio é relativamente simples. Não requer técnicas de separação (por exemplo, eletroforese, ligação do filtro) para obter um sinal. Além disso, o ensaio é contínuo, permitindo a coleta de dados em tempo real. Um ensaio cinético contínuo diferente para a atividade de metilação foi recentemente descrito39. No entanto, este ensaio requer três enzimas de acoplamento para gerar um sinal espectroscópico. O ensaio aqui descrito requer uma única enzima de acoplamento.
Esses ensaios de atividade DNMT são realizados primeiro gerando uma solução de ensaio que contém todos os componentes do ensaio, exceto as enzimas. As soluções de ensaio contêm os substratos, o ADN hairpin e o SAM; 0,1 mg/mL de BSA também é rotineiramente incluído nos ensaios. Com as concentrações extremamente baixas (na faixa nanomolar) de DNA e DNMT1 usadas no ensaio, a BSA aumenta a concentração geral de proteína para ajudar a prevenir a adesão a pontas de tubeta, tubos e placas de microtitulação e insultos ambientais que possam afetar a atividade enzimática. A reação é então iniciada pela adição de enzimas às soluções de ensaio. Estas diluições devem ser tidas em conta na determinação das concentrações finais de todos os componentes do ensaio. As reações são iniciadas pela adição de 5 μL de solução enzimática a 95 μL de solução de ensaio. Portanto, as concentrações de DNA, SAM e BSA nas soluções de ensaio são 1,05x a concentração final desejada. Por exemplo, se 10 nM de DNA é desejado, as soluções de ensaio são geradas com DNA de 10,5 nM. A concentração de DNMT1 sem RFTS na solução enzimática é 20x a concentração final desejada. Aqui, 40 nM RFTS-faltando DNMT1 foi utilizado na solução enzimática de modo que a concentração final de DNMT1 em cada ensaio foi de 2 nM.
Como a Gla I é uma enzima comercialmente disponível, sua quantidade é dada em unidades (U), conforme fornecido pelo fabricante. As soluções enzimáticas geradas contêm 0,16 U/μL Gla I, de modo que um total de 0,8 U de Gla I é adicionado a cada poço. Para economizar nos custos de reagentes, pequenos volumes das soluções enzimáticas apropriadas são preparados, e essas soluções são então alicotadas em placas de 96 poços de fundo cônico. Usando pipetas multicanal, 5 μL de soluções enzimáticas são transferidas da placa de fundo cônico para as soluções de ensaio na placa preta de meia área de 96 poços. Esse processo permite que uma linha de ensaios seja iniciada simultaneamente. Alternativamente, com uma configuração de placa de ensaio diferente, as soluções enzimáticas poderiam ser colocadas em reservatórios de reagentes e, em seguida, pipetos multicanais poderiam ser usados para adicionar enzimas às soluções de ensaio. No entanto, essa abordagem exigirá maiores volumes de solução enzimática devido aos resíduos de recuperação líquida nos reservatórios. Realizamos os ensaios em placas de meia área de 96 poços; o menor tamanho do poço nessas placas permite um volume total de ensaio menor (100 μL) do que as placas tradicionais de 96 poços, novamente economizando nos custos de reagente.
O ensaio de metilação do DNA descrito aqui requer um DNA de substrato hemimetilado devido à especificidade da endonuclease de acoplamento Gla I. Isso torna o ensaio especialmente bom para examinar a atividade do DNMT1, pois essa isoenzima preferencialmente metila o DNA hemimetilado1. As isozimas DNMT3 não apresentam preferência entre DNA não metilado e hemimetilado1. Assim, este ensaio pode ser usado para examinar a atividade das isozimas DNMT3 também. De fato, a inibição da DNMT3a por pequenas moléculas tem sido avaliada usando este ensaio26,27,41. A exigência de um DNA de substrato hemimetilado significa que este ensaio não pode ser usado para examinar a especificidade do substrato ou a preferência entre locais de CpG não metilados e hemimetilados.
Este ensaio baseia-se em um sinal espectroscópico: o aumento da fluorescência quando o fluoróforo e o extinguimento são separados. Assim, pequenas moléculas que elas próprias fluorescem ou extinguem a fluorescência podem interferir no ensaio. Uma razão para realizar o controle contendo Gla I para cada condição de ensaio é verificar essa possibilidade. As propriedades espectroscópicas da pequena molécula podem ser explicadas simplesmente usando os dados de controle Gla I (por exemplo, se a molécula tiver um sinal de fluorescência fraco). No entanto, se a molécula é fortemente fluorescente ou um quencher forte, este ensaio não pode ser usado para detectar a atividade de metilação do DNA.
A tela descrita aqui é um ensaio inicial para detectar potenciais inibidores de DNMT. Os compostos que são "hits" na tela inicial devem ser validados em ensaios secundários para garantir que sejam verdadeiros inibidores de DNMT. Como este ensaio é um ensaio de cinética acoplada, simplesmente observar uma diminuição na geração de fluorescência na presença de uma pequena molécula específica não significa necessariamente que o composto esteja inibindo a metiltransferase. Uma pequena molécula capaz de inibir a enzima de acoplamento Gla I também resultaria em uma diminuição observada na geração de fluorescência. Uma tela secundária simples envolve a determinação da atividade da Gla I na presença e ausência dos potenciais inibidores. Para este ensaio, o DNA do hairpin totalmente metilado internamente extinguido é utilizado como substrato26,41. Ensaios adicionais projetados para examinar a inibição dependente da agregação e a intercalação do DNA também podem ser usados como ensaios secundários para validar ainda mais potenciais inibidores26,41. Nos dados aqui apresentados, o composto 1 e o composto 2 foram identificados como potenciais inibidores da DNMT1. Usando uma variedade de ensaios secundários, o composto 1 foi validado como um inibidor direto da DNMT141. Este trabalho publicado anteriormente mostrou que compostos contendo substituintes volumosos na posição C2 do núcleo de antraquinona pareciam ser inibidores mais eficazes da DNMT1. No entanto, mais estudos são necessários para entender completamente os determinantes estruturais para a inibição da DNMT1.
O ensaio acoplado descrito aqui tem vários usos potenciais. O ensaio pode ser utilizado para experimentos de cinética de estado estacionário. Como o ensaio é contínuo, a determinação das velocidades iniciais é simples. Este ensaio já foi usado anteriormente para examinar parâmetros cinéticos macroscópicos (ou seja, Km, Vmax e kcat) de várias proteínas DNMT1 truncadas40. O ensaio tem sido utilizado para examinar um pequeno conjunto de moléculas para a inibição da DNMT1 41 e avaliar a especificidade da isoenzima dos inibidores identificados, examinando seu impacto na atividade da DNMT3a26,27,41. O ensaio também tem sido usado para caracterizar inibidores. O mecanismo de inibição e potência (por exemplo, Ki, IC50) de ambos os domínios de proteínas inibitórias36,40 e novas moléculas pequenas 27,41 foram determinados usando este ensaio cinético acoplado. O ensaio também foi adaptado para uso em uma campanha HTS. Neste caso, o ensaio foi miniaturizado ainda mais para um formato de 384 poços e usado como um ensaio de ponto final para a tela inicial26. Assim, o ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência descrito aqui é um ensaio versátil que pode ser usado para examinar a atividade das metiltransferases de DNA e permite a identificação e caracterização de inibidores de pequenas moléculas desses importantes modificadores epigenéticos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Universidade de Bucknell e ao Departamento de Química por seu apoio a este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 3694 | |
| 96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates | ThermoFisher | 249570 | |
| Bovine Serum Albumin | NEB | B9000S | |
| compound 1 | ChemBridge | 5812086 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 2 | ChemBridge | 6722175 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 3 | ChemBridge | 5249376 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | methyl-sensitive endonuclease |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M0250 | |
| Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | custom synthesized | internally quenched hairpin DNA (substrate) |
| Potassium Glutamate | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | methyl-donating co-factor (substrate) |
| Tris Base | RPI | T60040 |
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