Summary
Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.
Abstract
La metilazione del DNA, una forma di regolazione genica epigenetica, è importante per la normale funzione cellulare. Nelle cellule, le proteine chiamate DNA metiltransferasi (DNMT) stabiliscono e mantengono il modello di metilazione del DNA. Le modifiche al normale modello di metilazione del DNA sono legate allo sviluppo e alla progressione del cancro, rendendo i DNMT potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Pertanto, identificare e caratterizzare nuovi inibitori di piccole molecole di questi enzimi è di grande importanza. Questo documento presenta un protocollo che può essere utilizzato per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi. Il test di cinetica accoppiata continua consente di determinare le velocità iniziali di metilazione del DNA in presenza e assenza di potenziali inibitori di piccole molecole. Il test utilizza l'endonucleasi metil-sensibile Gla I per accoppiare la metilazione di un substrato di DNA emimetilato alla generazione di fluorescenza.
Questo test continuo consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale. Condurre il test in piccoli volumi in piastre di microtitolazione riduce il costo dei reagenti. Utilizzando questo test, è stato condotto un piccolo esempio di screening per gli inibitori di DNMT1, l'isoenzima DNMT più abbondante nell'uomo. Il prodotto naturale antrachinone altamente sostituito, l'acido laccaico A, è un potente inibitore competitivo del DNA di DNMT1. Qui, esaminiamo tre potenziali inibitori di piccole molecole - antrachinoni o molecole simili all'antrachinone con uno o tre sostituenti - a due concentrazioni per descrivere il protocollo di analisi. Le velocità iniziali vengono utilizzate per calcolare l'attività percentuale osservata in presenza di ciascuna molecola. Uno dei tre composti esaminati mostra un'inibizione concentrazione-dipendente dell'attività di DNMT1, indicando che si tratta di un potenziale inibitore di DNMT1.
Introduction
La metilazione del DNA è un importante marchio epigenetico che regola l'espressione genica e la struttura della cromatina. La metilazione si verifica prevalentemente nei dinucleotidi CpG - citosina seguita da guanosina; Il gruppo metilico viene aggiunto alla posizione 5 della citosina. Sono necessari corretti modelli di metilazione del DNA, e quindi una corretta espressione genica, per un appropriato sviluppo e funzione cellulare. Molti stati patologici sono stati associati a cambiamenti nel normale modello di metilazione 1,2,3. Ad esempio, esiste un legame tra l'inizio e la progressione del cancro e le alterazioni del modello di metilazione del DNA. Tipicamente, le cellule tumorali mostrano livelli complessivi più bassi di metilcitosina, che contribuisce all'instabilità del genoma. Allo stesso tempo, la metilcitosina presente nel genoma è concentrata nelle regioni promotrici dei geni oncosoppressori, che porta al silenziamento genico di queste importanti proteine. In particolare, i cambiamenti epigenetici sono dinamici e reversibili, a differenza delle mutazioni del DNA associate alla tumorigenesi. Ciò ha reso le proteine coinvolte nella regolazione genica epigenetica interessanti bersagli farmacologici 2,4.
Le DNA metiltransferasi (DNMT) sono le proteine responsabili della generazione e del mantenimento dei modelli di metilazione del DNA. Tre isoenzimi cataliticamente attivi, DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, esistono negli esseri umani. Durante lo sviluppo e la differenziazione, le metiltransferasi de novo, DNMT3a e DNMT3b, stabiliscono modelli di metilazione. Entrambi gli enzimi possono legare la proteina DNMT3L cataliticamente inattiva per formare complessi che mostrano una maggiore attività 1,5. Dopo la divisione cellulare, le cellule figlie contengono DNA emimetilato - DNA contenente metilcitosina in un solo filamento del duplex - perché il DNA appena sintetizzato è privo di segni di metilazione. La funzione principale di DNMT1 è quella di metilare questo DNA emimetilato, ristabilendo così il modello di metilazione completo 1,5.
I legami tra l'attività di DNMT e il cancro sono ben stabiliti. La sovraespressione di DNMT1, sia attraverso meccanismi trascrizionali che post-traduzionali, è una conseguenza di diverse vie oncogeniche comuni 6,7,8,9. Gli approcci genetici per ridurre l'attività di DNMT1 utilizzando alleli ipomorfici determinano una diminuzione della formazione di tumore nei topi Apc (Min) 10. Gli oligonucleotidi antisenso che abbattono DNMT1 inibiscono la neoplasia in colture cellulari e modelli tumorali murini11,12. Pertanto, l'inibizione dell'attività DNMT1 sembra un approccio promettente alla terapia del cancro. Tuttavia, i ruoli che gli isoenzimi DNMT3 svolgono non sono così semplici. Le mutazioni di DNMT3a si trovano nella leucemia mieloide acuta13 e nella sindrome mielodisplastica14. Almeno una delle mutazioni identificate ha dimostrato di diminuire l'attività di metilazione del DNA dell'enzima15. Tuttavia, DNMT3b è sovraespresso nel cancro al seno16 e nel cancro del colon-retto17. Con i vari isoenzimi DNMT che svolgono ruoli diversi nella carcinogenesi, l'identificazione di inibitori isoenzimatici specifici sarà fondamentale. Non solo questi composti saranno utili per lo sviluppo di terapie, ma gli inibitori isoenzimatico-specifici sarebbero anche uno strumento inestimabile per analizzare il ruolo di ciascun isoenzima DNMT nell'eziologia del cancro.
In letteratura sono stati riportati diversi inibitori della DNMT. Gli inibitori DNMT noti possono essere suddivisi in due classi: nucleoside e non nucleoside. Gli inibitori nucleosidici sono tipicamente analoghi della citidina. Questi composti sono incorporati nel DNA e intrappolano covalentemente i DNMT. 5-azacitidina e 5-aza-2'-deossicitidina sono stati approvati per il trattamento della sindrome mielodisplastica e della leucemia mieloide acuta 4,18. L'elevata tossicità, la bassa biodisponibilità e l'instabilità chimica di questi composti presentano problemi. Il lavoro in corso sta esaminando l'efficacia della prossima generazione di inibitori nucleosidici; SGI-110, derivato dalla 5-aza-2'-deossicitidina, è un esempio 19,20. Gli inibitori nucleosidici non sono isoenzimo-specifici e inattiveranno qualsiasi isoenzima DNMT incontrato. Pertanto, il trattamento con un agente nucleosidico demetilante determina la deplezione di tutti gli isoenzimi DNMT 4,18. Gli inibitori non nucleosidici non hanno bisogno di essere incorporati nel DNA per esercitare i loro effetti inibitori. Invece, queste molecole si legano direttamente ai DNMT, introducendo la possibilità di inibizione isoenzima-specifica. Diversi inibitori non-nucleosidici sono stati scoperti fino ad oggi, tra cui SGI-1027 21, idralazina 22, procainamide 23, RG108 e derivati 24, e prodotti naturali, (-)-epigallocatechina 3-gallato (EGCG)25 e acido laccaico A 26,27. La maggior parte degli inibitori non nucleosidici scoperti fino ad oggi non sono isoenzimi-selettivi o mostrano preferenze deboli per un isoenzima DNMT. Inoltre, la potenza di queste molecole deve essere migliorata, specialmente nelle cellule 4,18. Pertanto, vi è la necessità di scoprire o sviluppare inibitori DNMT più potenti e isoenzimatici.
Un ostacolo alla scoperta di nuovi inibitori di piccole molecole di DNMT sono i laboriosi saggi tradizionalmente utilizzati per esaminare l'attività DNMT28. I saggi sono generalmente discontinui con più passaggi. L'attività enzimatica dei DNMT viene ancora regolarmente analizzata utilizzando S-adenosil metionina radioattiva (SAM)29,30,31,32,33,34. Sono stati sviluppati anche saggi non radioattivi per la metilazione del DNA. Ad esempio, sono stati descritti saggi che utilizzano endonucleasi di restrizione metil-sensibile ed elettroforesi per separare i prodotti della digestione35,36. Questi tipi di saggi discontinui e multistep non sono facilmente suscettibili di scoperta di farmaci. Dalla metà degli anni 2000, sono stati sviluppati diversi saggi di metilazione del DNA con un throughput più elevato28. Un saggio di prossimità a scintillazione è stato utilizzato per lo screening degli inibitori DNMT137. Un altro test che utilizza un'endonucleasi di restrizione metil-sensibile è stato utilizzato per lo screening degli inibitori DNMT3a25,38. Mentre entrambi i test hanno consentito una maggiore produttività rispetto ai tradizionali test di metilazione del DNA, i test richiedono più passaggi e non consentono l'osservazione dell'attività di metilazione in tempo reale. Più recentemente, è stato descritto un saggio cinetico continuo che accoppia la formazione di S-adenosilomocisteina (SAH), un prodotto della reazione di metilazione, al cambiamento spettroscopico a 340 nm associato all'ossidazione NADPH39. Questo test utilizza tre enzimi di accoppiamento per generare un segnale spettroscopico.
Abbiamo sviluppato un saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi basato sulla fluorescenza che utilizza un singolo enzima di accoppiamento disponibile in commercio e può generare dati in tempo reale (Figura 1). Un oligonucleotide a forcina contenente tre metilcitosine viene utilizzato come substrato. Il DNA del substrato contiene un fluoroforo all'estremità 5' e un quencher all'estremità 3'. La metilazione del sito CpG emimetilato genera il sito di scissione per l'endonucleasi Gla I - GCGC completamente metilato. La scissione Gla I dell'oligonucleotide prodotto rilascia il fluoroforo dal quencher e genera fluorescenza in tempo reale. Il test può essere utilizzato per esaminare l'attività di qualsiasi isoforma di DNMT; tuttavia, si osserva una maggiore attività con DNMT1 poiché questo isoenzima metila preferenzialmente il DNA emimetilato 1,5. Un'attività ancora più robusta si osserva se il dominio RFTS (Replication Foci Targeting Sequence) autoinibitorio viene rimosso da DNMT1. Questo dominio, che si trova nella regione regolatoria N-terminale, si lega al sito catalitico e impedisce il legame del DNA. La rimozione dei primi ~ 600 amminoacidi si traduce in un enzima troncato che è significativamente più attivo dell'enzima a lunghezza intera (aumento di ~ 640 volte in kcat / Km)40. Questa forma attivata dell'enzima, denominata DNMT1 privo di RFTS (aminoacidi 621-1616), consente una più facile identificazione degli inibitori grazie al suo maggiore potere catalitico. Questo articolo presenta un protocollo per utilizzare DNMT1 privo di RFTS nei saggi per lo screening di potenziali inibitori di piccole molecole. Utilizzando il saggio continuo accoppiato all'endonucleasi, la velocità iniziale viene determinata in presenza e assenza di alcune piccole molecole. Ogni potenziale inibitore viene esaminato a due concentrazioni per cercare l'inibizione DNMT1 dipendente dalla concentrazione. La percentuale di attività osservata in presenza delle piccole molecole è stata calcolata in ciascun caso.
Figura 1: Saggio di metilazione del DNA. Come substrato viene utilizzato un DNA a forcina emimetilata con un fluoroforo all'estremità 5' e un quencher all'estremità 3'. DNMT1 catalizza il trasferimento del gruppo metilico dalla S-adenosilmetionina al sito CpG non metilato, generando S-adenosilomocisteina e DNA completamente metilato. Il prodotto del DNA contiene il sito di scissione per l'endonucleasi Gla I, che fende i siti GCGC completamente metilati. La scissione del DNA del prodotto rilascia il fluoroforo 5' dal quencher 3', generando fluorescenza. Abbreviazioni: Fl = fluoroforo; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; SAM = S-adenosilmetionina; SAH = S-adenosilomocisteina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Protocol
1. Preparare soluzioni di analisi per lo schermo
NOTA: Le concentrazioni dei substrati utilizzati in questo test possono essere adattate. Per DNMT1 privo di RFTS, i valori di Km determinati sperimentalmente per il substrato del DNA hairpin e SAM sono 1-2 nM e 2 μM, rispettivamente26,40.
- Preparare 600 μL di ciascuna condizione di analisi da testare in provette da microcentrifuga su ghiaccio.
NOTA: il volume totale della soluzione di analisi necessaria dipende dal numero di repliche condotte. Ogni condizione di analisi è stata eseguita in triplice copia per questo protocollo.- Aggiungere ddH2 O e 5x tampone di metilazione (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutammato di potassio, 5 mM ditiotreitolo (DTT), 25% glicerolo) a ciascuna provetta per ottenere una concentrazione finale di 1x tampone. Per i saggi contenenti 20 μM di composto, aggiungere 472 μL di ddH2O e 120 μL di tampone 5x. Per i saggi contenenti 50 μM di composto, aggiungere 470 μL di ddH2O e 120 μL di tampone 5x.
- Aggiungere 3,15 μL di 20 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) a ciascun campione.
- Aggiungere 2 μL di substrato di DNA a forcina da 3,15 μM e 1,33 μL di 4,75 mM SAM a ciascun campione.
NOTA: La concentrazione di substrati nella miscela della soluzione di analisi è 1,05 volte le concentrazioni finali desiderate. - Aggiungere inibitore a una concentrazione finale di 21 μM (1,26 μL di 10 mM) o 52,5 μM (3,15 μL di 10 mM) ai campioni appropriati. Aggiungere una quantità equivalente di dimetilsolfossido (DMSO) a un campione di controllo.
NOTA: La concentrazione di inibitore utilizzata nello schermo può essere variata. La concentrazione finale massima di DMSO deve essere ≤5% (v/v). Concentrazioni di DMSO fino al 5% (v/v) non hanno alcun effetto sull'attività osservata nel saggio26.
- Miscelare le soluzioni mediante vortice (3.000 giri/min) per 3 s. Centrifugare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
- Aliquot 95 μL di ciascuna soluzione di saggio in 6 pozzetti consecutivi in una piastra nera a semiarea da 96 pozzetti (Figura 2).
NOTA: Questi test di screening sono stati eseguiti in due lotti. In primo luogo, sono stati esaminati 20 campioni di inibitori μM (4 condizioni totali), seguiti dai campioni di inibitori di 50 μM (4 condizioni totali).
Figura 2: Impostazione della piastra di analisi. Ogni soluzione di analisi è aliquotata in sei pozzetti nella piastra nera a 96 pozzetti: controllo DMSO (blu), composto 1 (verde), composto 2 (rosso) e composto 3 (giallo). Sia DNMT1 che Gla I privi di RFTS saranno aggiunti a tre pozzi. Come controllo, solo Gla I sarà aggiunto agli altri tre pozzi. Abbreviazioni: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Preparare soluzioni enzimatiche per lo screening
NOTA: DNMT1 privo di RFTS può essere espresso in E. coli e purificato fino all'omogeneità. Le procedure di espressione e purificazione per DNMT1 privo di RFTS sono state descritte in precedenza41. Il volume di enzima necessario dipende dal numero di saggi condotti. Qui, quattro diversi test vengono eseguiti in ogni set; Ogni saggio è completato in triplice copia.
- Preparare 75 μL di ciascuna soluzione enzimatica in provette da microcentrifuga su ghiaccio.
NOTA: saranno necessarie due soluzioni enzimatiche. Una soluzione conterrà DNMT1 e Gla I; l'altro conterrà solo Gla I.- Aggiungere ddH2 O e 5x tampone di metilazione (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutammato di potassio, 5 mM DTT, 25% glicerolo) a ciascuna provetta per ottenere una concentrazione finale di 1x tampone. Per la soluzione enzimatica Gla I, aggiungere 15 μL di tampone 5x e 58,8 μL ddH2O. Per la soluzione enzimatica DNMT1+Gla I, aggiungere 15 μL di tampone 5x e 58,2 μL ddH2O.
- Aggiungere 1,2 μL di 10 U/μL Gla I a ciascuna soluzione per una concentrazione finale di 0,16 U/μL.
- Aggiungere 0,6 μL di DNMT1 privo di RFTS da 5 μM per una concentrazione finale di 40 nM alla soluzione DNMT1+Gla I.
- Picchiettare delicatamente per mescolare le soluzioni. Centrifugare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
- Aliquot 12 μL di ciascuna soluzione enzimatica in 6 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico (Figura 3).
Figura 3: Impostazione della piastra enzimatica. Le soluzioni Gla I (grigio) e DNMT1+Gla I (blu) sono ciascuna suddivisa in sei pozzetti nella piastra da 96 pozzetti. Utilizzando un pipet multicanale, l'enzima può essere aggiunto a una fila di soluzioni di analisi contemporaneamente. Per ogni condizione di analisi (sei pozzi), tre pozzi riceveranno DNMT1 + Gla I e tre pozzi riceveranno Gla I da solo. Abbreviazione: DNMT1 = DNA metiltransferasi 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Eseguire il test e analizzare i dati.
- Preriscaldare il lettore di piastre a 37 °C. Inserire la piastra nera contenente le soluzioni di analisi. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 5 s) e leggere la fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nm. Incubare la piastra a 37 °C per 5 min.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare filtri con cutoff di lunghezza d'onda appropriati per le letture di fluorescenza. - Rimuovere la piastra di analisi. Aggiungere 5 μL di soluzione enzimatica a ciascun pozzetto e mescolare mediante pipettaggio su e giù.
NOTA: utilizzare pipet multicanale in modo che una riga di campioni possa essere avviata contemporaneamente. - Inserire la piastra nel lettore di piastre. Registrare la fluorescenza ogni 53 s per 30 minuti. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 4 s) prima di ogni lettura.
- Saggi di controllo Gla I triplicati medi per ciascuna condizione. Sottrarre la traccia media della reazione di controllo contenente Gla I dalle tracce triplicate ottenute in presenza di DNMT1 privo di RFTS. Determinare l'errore medio e standard della media per le repliche corrette.
- Tracciare la traccia di reazione corretta media e adattare la porzione lineare iniziale a una linea per determinare la velocità iniziale.
- Determinare la percentuale di attività dividendo la velocità osservata in presenza di un composto per la velocità osservata nella reazione di controllo contenente DMSO e moltiplicando per 100.
4. Controllo aggiuntivo del saggio — aggiunta sequenziale di enzimi
- Preparare 550 μL di soluzione di dosaggio in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio. Aggiungere 110 μL di tampone di metilazione 5x, 3,88 μL di substrato di DNA hairpin da 3,15 μM, 6,43 μL di 47,5 mM SAM, 3,06 μL di 20 mg/mL BSA e 426,6 μL di ddH2O.
- Miscelare la soluzione mediante vortice (3.000 giri/min) per 3 s. Centrifugare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
- Aliquot 90 μL della soluzione di analisi in 6 pozzetti consecutivi in una piastra nera a semiarea da 96 pozzetti.
- Preparare le soluzioni enzimatiche DNMT1 su ghiaccio. Aggiungere 4 μL di tampone di metilazione 5x, 0,76 μL di DNMT1 privo di RFTS da 5 μM e 15,24 μL di ddH2O in una provetta. Aggiungere 4 μL di tampone di metilazione 5x e 16 μL di ddH2O in un'altra provetta.
- Picchiettare delicatamente per mescolare le soluzioni. Far girare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
- Aggiungere 5 μL della soluzione contenente DNMT1 a tre pozzetti nella piastra nera a metà area a 96 pozzetti. Aggiungere 5 μL della soluzione di controllo del tampone agli altri tre pozzetti.
- Inserire la piastra di microtitolazione nel lettore di piastre preriscaldato a 37 °C. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 3 s) e leggere la fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nm. Ripetere il frullato e leggere ogni 60 s per 30 minuti.
- Mentre la piastra di analisi si trova nel lettore di piastre, preparare la soluzione di Gla I su ghiaccio. Aggiungere 8 μL di tampone di metilazione 5x, 0,64 μL di 10 U/μL Gla I e 31,4 μL di ddH2O in una provetta per microcentrifuga. Picchiettare delicatamente per mescolare la soluzione. Centrifugare il campione per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
- Aliquot 6 μL della soluzione di Gla I in 6 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico.
- Dopo la lettura iniziale di 30 minuti, rimuovere la piastra nera dal lettore di piastre. Aggiungere 5 μL di soluzione di Gla I in tutti e 6 i pozzetti e mescolare mediante pipettaggio su e giù.
NOTA: utilizzare un pipettaggio multicanale in modo che tutti i pozzetti possano essere avviati contemporaneamente. - Riposizionare la piastra nera nel lettore di piastre. Registrare la fluorescenza ogni 35 s per 35 minuti. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 3 s) prima di ogni lettura.
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Representative Results
DNMT1 attivo è un prerequisito per questa analisi. Il DNMT1 privo di RFTS è stato espresso in E.coli e purificato fino ad omogeneità seguendo procedure precedentemente pubblicate41. Per garantire che l'enzima purificato fosse attivo, è stato utilizzato un saggio discontinuo accoppiato a endonucleasi per esaminare l'attività di metilazione del DNA36. Questo test utilizza un DNA duplex a 32 coppie di basi con un singolo CpG emimetilato posizionato in un sito di scissione Sau3A1. Sau3A1 può scindere il DNA del substrato emimetilato; tuttavia, la scissione viene bloccata quando il DNA è completamente metilato. Il DNMT1 privo di RFTS è stato aggiunto ai test contenenti 1 μM di DNA e 0,5 mM di SAM, e le aliquote sono state rimosse e congelate per 30 minuti. I campioni sono stati successivamente digeriti con Sau3A1 e i prodotti sono stati separati mediante elettroforesi su gel. Come mostrato nella Figura 4, il DNA è protetto dalla scissione all'aumentare del tempo di reazione, indicando che il DNMT1 privo di RFTS sta metilando il DNA emimetilato. La maggior parte del DNA del substrato da 1 μM originariamente presente nel test è stato convertito in prodotto nel corso del tempo di 30 minuti.
Il saggio accoppiato all'endonucleasi descritto in questo articolo consente l'osservazione dell'attività di metilazione del DNA in tempo reale come aumento della fluorescenza. La chiave del successo di questo test è la sensibilità metilica dell'endonucleasi Gla I. Gla I non fende in modo efficiente il DNA del substrato emimetilato, ma fende il DNA del prodotto completamente metilato (Figura 1). La scissione del DNA della forcina è necessaria per rilasciare il fluoroforo dal quencher e generare un aumento della fluorescenza. Per dimostrare che gli enzimi funzionano come previsto, è stata condotta una reazione di controllo in cui gli enzimi, privi di DNMT1 e Gla I, sono stati aggiunti sequenzialmente piuttosto che contemporaneamente. Se il test accoppiato funziona correttamente, l'aggiunta di DNMT1 non dovrebbe influire sulla fluorescenza, poiché non si prevede che la metilazione del substrato del DNA influisca sulla fluorescenza di fondo del DNA a forcina temprato internamente. Tuttavia, la successiva aggiunta di Gla I ai saggi che contenevano la metiltransferasi dovrebbe provocare la generazione di fluorescenza a causa della scissione del DNA della forcina completamente metilata. Il substrato di DNA a forcina emimetilata ha fluorescenza di fondo (Figura 5); questi test contenevano 20 nM di DNA a forcina e 500 μM di SAM. Ai saggi è stato aggiunto DNMT1 o tampone privo di RFTS e la fluorescenza è stata seguita per 30 minuti.
Come si vede in Figura 5, la fluorescenza non è influenzata dal DNMT1 privo di RFTS in assenza dell'enzima di accoppiamento (le tonalità blu contenevano 10 nM RFTS-privi di DNMT1 mentre le tonalità rosse sono il controllo del buffer). Pertanto, la metilazione del sito CpG emimetilato da parte di DNMT1 non modifica sensibilmente il segnale di fluorescenza. Tuttavia, quando Gla I è stato aggiunto a tutti i pozzi, è stata osservata una robusta generazione di fluorescenza solo nei saggi che contenevano DNMT1 privo di RFTS (Figura 5). Ciò dimostra che la metilazione del DNA del substrato emimetilato da parte di DNMT1 è necessaria per la scissione di Gla I e la generazione di fluorescenza. Va notato che l'aumento della fluorescenza osservato in questo test di controllo riflette l'attività di Gla I quando gli enzimi sono stati aggiunti in sequenza. In alternativa, queste miscele di reazione potrebbero essere digerite con Gla I e gli oligonucleotidi risultanti potrebbero essere separati mediante elettroforesi per visualizzare la scissione e garantire che gli enzimi funzionino come previsto.
Per utilizzare questo test accoppiato per determinare direttamente le velocità iniziali di DNMT1, entrambi gli enzimi, DNMT1 privo di RFTS e Gla I, devono essere aggiunti contemporaneamente. Finché la velocità di scissione del DNA del prodotto è più veloce della velocità di metilazione del DNA da parte di DNMT1, il segnale di fluorescenza generato rifletterà l'attività di metilazione del DNA. Per garantire che l'attività di DNMT1 limiti la velocità, la concentrazione di DNMT1 può essere variata mantenendo costanti tutte le altre condizioni di analisi. La velocità di generazione della fluorescenza deve essere proporzionale alla concentrazione di DNMT1. Questo è stato precedentemente dimostrato per DNMT1 privo di RFTS nelle condizioni utilizzate qui40. Quando si utilizza questo saggio accoppiato per esaminare l'attività DNMT, viene eseguita una reazione di controllo contenente Gla I in aggiunta alla reazione che contiene sia DNMT1 che Gla I (Figura 6A). Il controllo Gla I ha diverse funzioni. La sottrazione della traccia di reazione di controllo Gla I dalla traccia di reazione contenente DNMT consente di tenere conto sia della lenta scissione del substrato di DNA emimetilato che della fluorescenza di fondo. Le tracce di reazione corrette generate riflettono l'attività di metilazione del DNA di DNMT1. Il montaggio della porzione lineare iniziale della traccia di reazione corretta consente di determinare la velocità iniziale (Figura 6B). Con un substrato di DNA a forcina da 10 nM e SAM 10 μM, è stata ottenuta una velocità iniziale di 113 ± 2 RFU/min.
Gli antrachinoni sostituiti hanno precedentemente dimostrato di inibire l'attività di DNMT1. Il prodotto naturale, l'acido laccaico A, un antrachinone altamente sostituito, è un potente inibitore del DNA-competitivo di DNMT127. Alcuni composti con strutture più semplici, uno o due sostituenti sul nucleo antrachinonico, uno dei quali è un sostituente aromatico ingombrante, hanno anche dimostrato di inibire DNMT1 in modo competitivo per il DNA41. Qui, la capacità di tre antrachinoni sostituiti o molecole simili agli antrachinoni di inibire l'attività DNMT1 priva di RFTS nel test accoppiato Gla I è stata esaminata come esempio di come condurre questi test di screening. Questi composti contenevano da uno a tre sostituenti, tutti su un lato del nucleo di antrachinone (Tabella 1). Le concentrazioni del substrato (10 nM DNA e 10 μM SAM) utilizzate per questi test sono ~ 5 volte superiori al Km per ciascun substrato. Il segnale generato nel test proviene direttamente dal DNA del substrato. Per questo motivo, è difficile dosare a concentrazioni vicine o inferiori a Km; Semplicemente non c'è abbastanza segnale da rilevare. Queste concentrazioni di substrato sono state scelte perché in queste condizioni si osserva un'attività robusta in assenza di inibitori (Figura 6B). Altre concentrazioni di substrato potrebbero essere utilizzate nei saggi di screening. Ad esempio, condurre uno screening a saturare le concentrazioni di SAM potrebbe essere utilizzato come strategia per influenzare la ricerca contro gli inibitori competitivi SAM.
Ogni test conteneva il substrato del DNA hairpin, il cofattore metil-donatore SAM e un potenziale inibitore o DMSO come controllo per lo schermo. Generiamo regolarmente soluzioni da 10 mM di composti di screening in DMSO per l'uso nei saggi. Gli antrachinoni come quelli qui esaminati mostrano scarsa solubilità in soluzioni acquose. Pertanto, per generare scorte concentrate, il DMSO viene utilizzato come solvente. L'aggiunta di DMSO fino al 5% (v/v) della concentrazione finale non influisce sull'attività nel saggio26. Tuttavia, quando si tratta di composti a bassa solubilità in soluzione acquosa, occorre prestare attenzione per garantire che il composto sia solubile alla concentrazione o alle concentrazioni finali di screening scelte.
Per ogni condizione esaminata nello schermo, viene eseguito un test di controllo contenente Gla I. Oltre a tenere conto della fluorescenza di fondo e della lenta scissione del DNA della forcina del substrato, questo controllo consente di determinare se il potenziale inibitore interferisce con il segnale spettroscopico (ad esempio, è fluorescente). Dopo aver avviato la reazione aggiungendo enzimi, la fluorescenza è stata misurata per 30 minuti con un intervallo di tempo di 53 s nei dati di screening. Questo è l'intervallo di tempo più veloce disponibile sul lettore di piastre in questo laboratorio quando si legge un'intera piastra da 96 pozzetti. Altri intervalli di tempo potrebbero essere utilizzati per generare le tracce di reazione. Un intervallo di tempo appropriato dipenderà dallo strumento utilizzato e dal numero di pozzi da leggere. Per garantire la riproducibilità, ogni test è condotto in triplice copia. La traccia di controllo media contenente Gla I viene sottratta dalle tracce di reazione osservate in presenza di DNMT1 privo di RFTS. La velocità iniziale della reazione può essere determinata adattando la porzione lineare iniziale delle tracce di reazione corrette.
Inizialmente, l'impatto di tre potenziali inibitori sulla generazione di fluorescenza è stato esaminato a una concentrazione finale di 20 μM. Concentrazioni più elevate dei potenziali inibitori sono state scelte per lo screening per due motivi. In primo luogo, le concentrazioni del substrato nel test sono entrambe superiori ai rispettivi valori Km . Ciò può rendere più difficile rilevare l'inibizione nei saggi cinetici, in particolare se gli inibitori sono competitivi. In secondo luogo, i composti simili all'antrachinone utilizzati in questo schermo sono significativamente più semplici nella struttura rispetto al noto inibitore, l'acido laccaico A. Poiché queste molecole contengono solo pochi sostituenti attorno alla struttura centrale, abbiamo anticipato interazioni più deboli. Nel test di controllo contenente DMSO, è stata ottenuta una velocità iniziale di 111 ± 5 RFU / min (Figura 7A). Si noti che questo è molto simile al tasso riportato in precedenza in assenza di DMSO e conferma che l'aggiunta di basse quantità di DMSO non influisce sull'attività osservata. L'aggiunta di due composti ha diminuito la velocità iniziale osservata, mentre l'aggiunta del terzo composto non ha avuto alcun effetto sull'attività. Le velocità iniziali sono state utilizzate per determinare la percentuale di attività osservata in presenza di ciascun composto. A 20 μM, l'aggiunta dei composti 1 e 2 ha determinato un'attività percentuale di ~ 80%, mentre l'attività percentuale del 100% è stata osservata in presenza del composto 3, indicando che questa molecola non inibisce l'enzima (Tabella 1).
Ci si aspetta che gli inibitori mostrino inibizione concentrazione-dipendente. Successivamente, queste molecole sono state riesaminate a una concentrazione ancora più elevata di 50 μM. Per questa serie di saggi, il test di controllo contenente DMSO aveva una velocità iniziale di 125 ± 7 RFU / min (Figura 7B). Questa velocità è leggermente superiore ai tassi precedentemente determinati; Tuttavia, queste velocità sono tutte relativamente vicine all'interno dell'errore. Ancora una volta, il composto 3 ha avuto scarso effetto sulla velocità iniziale, mentre l'aggiunta dei composti 1 e 2 ha diminuito la velocità iniziale osservata. Come previsto, alla concentrazione più elevata, il composto 1 ha avuto un impatto maggiore sull'attività. A 50 μM, l'aggiunta del composto 1 ha determinato un'attività percentuale di ~ 60% (Tabella 1). Tuttavia, l'aggiunta di una maggiore concentrazione di composto 2 non ha comportato un'inibizione più robusta. L'attività percentuale osservata in presenza di 50 μM di composto 2 era di nuovo vicina all'80%.
Come si può vedere nei dati presentati, il saggio di metilazione del DNA basato sulla fluorescenza accoppiato all'endonucleasi può essere utilizzato per lo screening di potenziali inibitori DNMT. I dati indicano che il composto 1 e il composto 2 sono potenziali inibitori, mentre il composto 3 non lo è. Sono necessari ulteriori studi per convalidare i potenziali inibitori come veri inibitori DNMT1.
Figura 4: Controllo dell'attività DNMT1. La metilazione del DNA duplex emimetilato protegge dalla scissione di Sau3A1. Il DNMT1 privo di RFTS è stato aggiunto alle miscele di analisi contenenti 1 μM di DNA e 500 μM di SAM. I campioni sono stati raccolti nei punti temporali indicati durante un'incubazione di 30 minuti a 37 °C, digeriti con Sau3A1 e risolti mediante elettroforesi su gel su 18% PAGE. Qui vengono mostrati campioni di 5, 10, 15 e 30 minuti. La prima corsia è un controllo privo di DNMT1. Abbreviazioni: DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; RFTS = Replication Foci Targeting Sequence. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Controllo del saggio basato sulla fluorescenza. DNMT1 (concentrazione finale di 10 nM) e Gla I (0,8 U) privi di RFTS sono stati aggiunti sequenzialmente a saggi triplicati contenenti substrato di DNA a forcina 20 nM e 500 μM SAM. L'aggiunta di DNMT1 (cerchi blu) o buffer (cerchi rossi) da sola non ha avuto alcun effetto sulla fluorescenza di fondo. L'aggiunta di Gla I a tutti i test determina la generazione di fluorescenza nei saggi che contenevano DNMT1, ma non nei saggi che non lo fanno. Abbreviazioni: DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; RFTS = sequenza di targeting dei foci di replica; RFU = unità di fluorescenza relativa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Tracce di reazione di fluorescenza. I test triplicati contenevano 10 nM di substrato di DNA a forcina e 10 μM di SAM. (A) DNMT1 (2 nM) e Gla I (0,8 U) privi di RFTS sono stati aggiunti a tre test (blu) e Gla I (0,8 U) da solo è stato aggiunto a tre saggi (rosso). La robusta generazione di fluorescenza si osserva solo nei saggi che contengono entrambi gli enzimi. (B) La traccia di reazione Gla I media è stata sottratta dalle tracce di reazione DNMT1+Gla I. Vengono mostrati l'errore medio e standard della media dei dati triplicati. Il montaggio della porzione lineare della traccia fornisce una velocità iniziale di 113 ± 2 RFU/min. Abbreviazioni: DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; RFTS = sequenza di targeting dei foci di replica; RFU = unità di fluorescenza relativa; SAM = S-adenosilmetionina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Attività di metilazione del DNA in presenza di potenziali inibitori. L'attività di metilazione del DNA di DNMT1 privo di RFTS è stata esaminata in presenza di DMSO (nero), composto 1 (rosso), composto 2 (blu) o composto 3 (verde). Le tracce di reazione corrette a 20 μM composto (A) e 50 μM composto (B) erano idonee a determinare la velocità iniziale. L'aggiunta dei composti 1 e 2 ha diminuito la velocità osservata, mentre il composto 3 ha avuto un impatto minimo sull'attività. Vengono mostrati l'errore medio e standard della media per i saggi triplicati. Abbreviazioni: DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; RFTS = sequenza di targeting dei foci di replica; RFU = unità di fluorescenza relativa; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Velocità iniziali e attività percentuali osservate in presenza di potenziali inibitori di piccole molecole. La velocità iniziale è stata determinata adattando la porzione lineare iniziale delle tracce di reazione corrette a una linea; Viene segnalato l'errore associato all'adattamento. L'attività percentuale è stata determinata dividendo la velocità determinata in presenza di composto per la velocità determinata nella reazione di controllo DMSO e moltiplicando per 100; L'errore associato è stato propagato. Abbreviazioni: Cmpd = composto; DMSO = dimetilsolfossido; RFU = unità di fluorescenza relativa. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Per identificare e caratterizzare gli inibitori delle DNA metiltransferasi, deve essere misurata l'attività dell'enzima. Esistono diversi metodi per esaminare l'attività della DNA metiltransferasi. L'attività è comunemente monitorata utilizzando la radioattività; il trasferimento del gruppo metilico marcato di SAM può essere quantificato 29,30,31,32,33,34. Sono stati descritti anche saggi a base di gel che utilizzano endonucleasi metil-sensibili35,36. Questi test sono generalmente discontinui e richiedono più passaggi per esaminare l'attività. Qui, viene descritto un test di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi per lo screening di potenziali inibitori della DNA metiltransferasi. Questa tecnica ha diversi vantaggi. Il test è relativamente semplice. Non richiede tecniche di separazione (ad esempio, elettroforesi, legame del filtro) per ottenere un segnale. Inoltre, il test è continuo, consentendo la raccolta di dati in tempo reale. Un diverso saggio di cinetica continua per l'attività di metilazione è stato recentemente descritto39. Tuttavia, questo test richiede tre enzimi di accoppiamento per generare un segnale spettroscopico. Il test qui descritto richiede un singolo enzima di accoppiamento.
Questi saggi di attività DNMT vengono eseguiti generando prima una soluzione di analisi che contiene tutti i componenti del saggio tranne gli enzimi. Le soluzioni di analisi contengono i substrati, il DNA a forcina e SAM; 0,1 mg/mL BSA è anche regolarmente incluso nei test. Con le concentrazioni estremamente basse (nell'intervallo nanomolare) di DNA e DNMT1 utilizzate nel test, la BSA aumenta la concentrazione proteica generale per aiutare a prevenire l'adesione alle punte dei pipetti, ai tubi e alle piastre di microtitolazione e insulti ambientali che potrebbero influire sull'attività enzimatica. La reazione viene quindi avviata aggiungendo enzimi alle soluzioni di analisi. Queste diluizioni devono essere prese in considerazione quando si determinano le concentrazioni finali di tutti i componenti del dosaggio. Le reazioni vengono avviate aggiungendo 5 μL di soluzione enzimatica a 95 μL di soluzione di dosaggio. Pertanto, le concentrazioni di DNA, SAM e BSA nelle soluzioni di analisi sono 1,05 volte la concentrazione finale desiderata. Ad esempio, se si desidera 10 nM DNA, vengono generate soluzioni di analisi con 10,5 nM DNA. La concentrazione di DNMT1 privo di RFTS nella soluzione enzimatica è 20 volte la concentrazione finale desiderata. Qui, nella soluzione enzimatica è stato utilizzato DNMT1 privo di RFTS 40 nM in modo che la concentrazione finale di DNMT1 in ciascun test fosse di 2 nM.
Poiché Gla I è un enzima disponibile in commercio, la sua quantità è espressa in unità (U) come fornito dal produttore. Le soluzioni enzimatiche generate contengono 0,16 U/μL Gla I in modo che un totale di 0,8 U di Gla I venga aggiunto a ciascun pozzetto. Per risparmiare sui costi dei reagenti, vengono preparati piccoli volumi delle soluzioni enzimatiche appropriate e tali soluzioni vengono quindi aliquotate in piastre coniche a 96 pozzetti. Utilizzando pipet multicanale, 5 μL di soluzioni enzimatiche vengono trasferiti dalla piastra con fondo conico alle soluzioni di analisi nella piastra nera a metà area a 96 pozzetti. Questo processo consente di avviare una serie di test contemporaneamente. In alternativa, con una diversa configurazione della piastra di analisi, le soluzioni enzimatiche potrebbero essere collocate in serbatoi di reagenti e quindi i pipet multicanale potrebbero essere utilizzati per aggiungere enzimi alle soluzioni di analisi. Tuttavia, questo approccio richiederà volumi più elevati di soluzione enzimatica a causa dei rifiuti di recupero liquidi nei serbatoi. Eseguiamo i saggi in piastre a mezza area a 96 pozzetti; le dimensioni ridotte del pozzo in queste piastre consentono un volume totale di analisi inferiore (100 μL) rispetto alle tradizionali piastre a 96 pozzetti, risparmiando ancora sui costi dei reagenti.
Il test di metilazione del DNA qui descritto richiede un substrato emimetilato DNA a causa della specificità dell'endonucleasi di accoppiamento Gla I. Ciò rende il test particolarmente utile per esaminare l'attività di DNMT1, poiché questo isoenzima metila preferenzialmente il DNA emimetilato1. Gli isoenzimi DNMT3 non mostrano una preferenza tra DNA non metilato ed emimetilato1. Pertanto, questo test può essere utilizzato anche per esaminare l'attività degli isoenzimi DNMT3. Infatti, l'inibizione di DNMT3a da parte di piccole molecole è stata valutata utilizzando questo saggio26,27,41. Il requisito di un DNA di substrato emimetilato significa che questo test non può essere utilizzato per esaminare la specificità del substrato o la preferenza tra siti CpG non metilati ed emimetilati.
Questo test si basa su un segnale spettroscopico: l'aumento della fluorescenza quando il fluoroforo e il quencher sono separati. Pertanto, piccole molecole che a loro volta fluorescono o estinguono la fluorescenza possono interferire con il test. Un motivo per condurre il controllo contenente Gla I per ciascuna condizione di analisi è verificare questa possibilità. Le proprietà spettroscopiche della piccola molecola potrebbero essere spiegate semplicemente usando i dati di controllo Gla I (ad esempio, se la molecola ha un debole segnale di fluorescenza). Tuttavia, se la molecola è fortemente fluorescente o un forte quencher, questo test non può essere utilizzato per rilevare l'attività di metilazione del DNA.
La schermata qui descritta è un test iniziale per rilevare potenziali inibitori DNMT. I composti che sono "hit" nella schermata iniziale devono essere convalidati in saggi secondari per garantire che siano veri inibitori DNMT. Poiché questo test è un test cinetico accoppiato, la semplice osservazione di una diminuzione della generazione di fluorescenza in presenza di una particolare piccola molecola non significa necessariamente che il composto stia inibendo la metiltransferasi. Una piccola molecola in grado di inibire l'enzima di accoppiamento Gla I comporterebbe anche una diminuzione osservata nella generazione di fluorescenza. Un semplice screening secondario comporta la determinazione dell'attività di Gla I in presenza e assenza dei potenziali inibitori. Per questo test, il DNA della forcina temprata internamente completamente metilato viene utilizzato come substrato 26,41. Ulteriori saggi progettati per esaminare l'inibizione dipendente dall'aggregazione e l'intercalazione del DNA possono anche essere utilizzati come saggi secondari per convalidare ulteriormente i potenziali inibitori26,41. Nei dati qui presentati, il composto 1 e il composto 2 sono stati identificati come potenziali inibitori di DNMT1. Utilizzando una varietà di saggi secondari, il composto 1 è stato validato come inibitore diretto di DNMT141. Questo lavoro precedentemente pubblicato ha mostrato che i composti contenenti sostituenti voluminosi nella posizione C2 del nucleo di antrachinone sembravano essere inibitori più efficaci di DNMT1. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per comprendere appieno i determinanti strutturali per l'inibizione di DNMT1.
Il saggio accoppiato qui descritto ha diversi usi potenziali. Il test può essere utilizzato per esperimenti di cinetica stazionaria. Poiché il test è continuo, determinare le velocità iniziali è semplice. Questo test è stato precedentemente utilizzato per esaminare i parametri cinetici macroscopici (cioè Km, Vmax e kcat) di varie proteine DNMT1 troncate40. Il test è stato utilizzato per esaminare un piccolo insieme di molecole per l'inibizione di DNMT1 41 e valutare la specificità isoenzimatica degli inibitori identificati esaminando il loro impatto sull'attività DNMT3a26,27,41. Il test è stato utilizzato anche per caratterizzare gli inibitori. Il meccanismo di inibizione e potenza (ad esempio, K i, IC50) di entrambii domini proteici inibitori36,40 e nuove piccole molecole 27,41 è stato determinato utilizzando questo saggio cinetico accoppiato. Il test è stato anche adattato per l'uso in una campagna HTS. In questo caso, il test è stato miniaturizzato ulteriormente in un formato a 384 pozzetti e utilizzato come test finale per la schermata iniziale26. Pertanto, il saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi basato sulla fluorescenza qui descritto è un test versatile che può essere utilizzato per esaminare l'attività delle DNA metiltransferasi e consente l'identificazione e la caratterizzazione di inibitori di piccole molecole di questi importanti modificatori epigenetici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Bucknell University e il Dipartimento di Chimica per il loro sostegno a questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 3694 | |
| 96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates | ThermoFisher | 249570 | |
| Bovine Serum Albumin | NEB | B9000S | |
| compound 1 | ChemBridge | 5812086 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 2 | ChemBridge | 6722175 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 3 | ChemBridge | 5249376 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | methyl-sensitive endonuclease |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M0250 | |
| Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | custom synthesized | internally quenched hairpin DNA (substrate) |
| Potassium Glutamate | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | methyl-donating co-factor (substrate) |
| Tris Base | RPI | T60040 |
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