Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Summary

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Abstract

La metilación del ADN, una forma de regulación genética epigenética, es importante para la función celular normal. En las células, las proteínas llamadas metiltransferasas de ADN (DNMT) establecen y mantienen el patrón de metilación del ADN. Los cambios en el patrón normal de metilación del ADN están relacionados con el desarrollo y la progresión del cáncer, lo que hace que los DNMT sean posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Por lo tanto, la identificación y caracterización de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de estas enzimas es de gran importancia. Este documento presenta un protocolo que se puede utilizar para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN. El ensayo cinético de acoplamiento continuo permite determinar las velocidades iniciales de metilación del ADN en presencia y ausencia de posibles inhibidores de moléculas pequeñas. El ensayo utiliza la endonucleasa sensible al metilo Gla I para acoplar la metilación de un sustrato de ADN hemimetilado a la generación de fluorescencia.

Este ensayo continuo permite monitorizar la actividad enzimática en tiempo real. La realización del ensayo en pequeños volúmenes en placas de microtitulación reduce el costo de los reactivos. Usando este ensayo, se realizó una pequeña pantalla de ejemplo para inhibidores de DNMT1, la isoenzima DNMT más abundante en humanos. El producto natural de antraquinona altamente sustituido, ácido laccaico A, es un potente inhibidor competitivo del ADN de DNMT1. Aquí, examinamos tres posibles inhibidores de moléculas pequeñas: antraquinonas o moléculas similares a la antraquinona con uno a tres sustituyentes, en dos concentraciones para describir el protocolo de ensayo. Las velocidades iniciales se utilizan para calcular el porcentaje de actividad observado en presencia de cada molécula. Uno de los tres compuestos examinados exhibe inhibición dependiente de la concentración de la actividad de DNMT1, lo que indica que es un inhibidor potencial de DNMT1.

Introduction

La metilación del ADN es una marca epigenética importante que regula la expresión génica y la estructura de la cromatina. La metilación ocurre predominantemente en los dinucleótidos CpG: citosina seguida de guanosina; El grupo metilo se añade a la posición 5 de la citosina. Los patrones correctos de metilación del ADN y, por lo tanto, la expresión génica adecuada, son necesarios para el desarrollo y la función celular apropiados. Muchos estados de enfermedad se han asociado con cambios en el patrón normal de metilación ^1,2,3. Por ejemplo, existe un vínculo entre el inicio y la progresión del cáncer y las alteraciones en el patrón de metilación del ADN. Por lo general, las células cancerosas exhiben niveles generales más bajos de metilcitosina, lo que contribuye a la inestabilidad del genoma. Al mismo tiempo, la metilcitosina que está presente en el genoma se concentra en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores, lo que conduce al silenciamiento génico de estas proteínas importantes. En particular, los cambios epigenéticos son dinámicos y reversibles, a diferencia de las mutaciones del ADN asociadas con la tumorigénesis. Esto ha hecho que las proteínas implicadas en la regulación génica epigenética sean interesantes dianas farmacológicas ^2,4.

Las metiltransferasas de ADN (DNMT) son las proteínas responsables de generar y mantener los patrones de metilación del ADN. Tres isoenzimas catalíticamente activas, DNMT1, DNMT3a y DNMT3b, existen en humanos. Durante el desarrollo y la diferenciación, las metiltransferasas de novo, DNMT3a y DNMT3b, establecen patrones de metilación. Ambas enzimas pueden unirse a la proteína DNMT3L catalíticamente inactiva para formar complejos que exhiben una mayor actividad ^1,5. Después de la división celular, las células hijas contienen ADN hemimetilado (ADN que contiene metilcitosina en una sola hebra del dúplex) porque el ADN recién sintetizado carece de marcas de metilación. La función principal de DNMT1 es metilar este ADN hemimetilado, restableciendo así el patrón de metilación completo ^1,5.

Los vínculos entre la actividad de DNMT y el cáncer están bien establecidos. La sobreexpresión de DNMT1, ya sea por mecanismos transcripcionales o postraduccionales, es una consecuencia de varias vías oncogénicas comunes 6,7,8,9. Los enfoques genéticos para disminuir la actividad de DNMT1 utilizando alelos hipomórficos dan como resultado una disminución de la formación de tumores en ratones Apc^(Min)10. Los oligonucleótidos antisentido que derriban DNMT1 inhiben la neoplasia en cultivos celulares y modelos tumorales de ratón^11,12. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de DNMT1 parece un enfoque prometedor de la terapia contra el cáncer. Sin embargo, los roles que desempeñan las isoenzimas DNMT3 no son tan sencillos. Las mutaciones DNMT3a se encuentran en la leucemia mieloide aguda¹³ y en el síndrome mielodisplásico¹⁴. Se ha demostrado que al menos una de las mutaciones identificadas disminuye la actividad de metilación del ADN de la enzima¹⁵. Sin embargo, DNMT3b se sobreexpresa en el cáncer de mama¹⁶ y el cáncer colorrectal¹⁷. Dado que las diversas isoenzimas DNMT desempeñan diferentes funciones en la carcinogénesis, la identificación de inhibidores específicos de isoenzimas será fundamental. Estos compuestos no solo serán útiles para el desarrollo de terapias, sino que los inhibidores específicos de isoenzimas también serían una herramienta invaluable para diseccionar el papel de cada isoenzima DNMT en la etiología del cáncer.

Varios inhibidores de DNMT han sido reportados en la literatura. Los inhibidores conocidos de DNMT se pueden dividir en dos clases: nucleósidos y no nucleósidos. Los inhibidores de nucleósidos son típicamente análogos de la citidina. Estos compuestos se incorporan al ADN y atrapan covalentemente las DNMT. La 5-azacitidina y la 5-aza-2′-desoxicitidina han sido aprobadas para el tratamiento del síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda ^4,18. La alta toxicidad, la baja biodisponibilidad y la inestabilidad química de estos compuestos presentan problemas. El trabajo en curso está examinando la eficacia de la próxima generación de inhibidores de nucleósidos; SGI-110, derivado de 5-aza-2′-desoxicitidina, es un ejemplo ^19,20. Los inhibidores de nucleósidos no son isozimas específicos e inactivarán cualquier isoenzima DNMT encontrada. Por lo tanto, el tratamiento con un agente desmetilante de nucleósidos resulta en el agotamiento de todas las isoenzimas DNMT ^4,18. Los inhibidores no nucleósidos no necesitan ser incorporados al ADN para ejercer sus efectos inhibitorios. En cambio, estas moléculas se unen directamente a los DNMT, introduciendo la posibilidad de inhibición específica de isoenzimas. Hasta la fecha se han descubierto varios inhibidores no nucleósidos, incluyendo SGI-1027²¹, hidralazina 22, procainamida 23, RG108 y derivados 24, y productos naturales, (-)-epigalocatequina 3-galato (EGCG)25 y ácido laccaico A ^26,27. La mayoría de los inhibidores no nucleósidos descubiertos hasta la fecha no son isozimo-selectivos o muestran preferencias débiles por una isoenzima DNMT. Además, la potencia de estas moléculas necesita ser mejorada, especialmente en las células ^4,18. Por lo tanto, existe la necesidad de descubrir o desarrollar inhibidores de DNMT más potentes y selectivos de isoenzimas.

Un obstáculo para descubrir nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de DNMTs son los laboriosos ensayos tradicionalmente utilizados para examinar la actividad de DNMT²⁸. Los ensayos suelen ser discontinuos con múltiples pasos. La actividad enzimática de las DNMT todavía se ensaya rutinariamente utilizando S-adenosil metionina radiactiva (SAM)^{29,30,31,32,33,34}. También se han desarrollado ensayos no radiactivos para la metilación del ADN. Por ejemplo, se han descrito ensayos que utilizan endonucleasas de restricción sensibles al metilo y electroforesis para separar los productos de digestión^35,36. Estos tipos de ensayos discontinuos de varios pasos no son fácilmente susceptibles de descubrimiento de fármacos. Desde mediados de la década de 2000, se han desarrollado varios ensayos de metilación del ADN con un mayor rendimiento²⁸. Se utilizó un ensayo de proximidad de centelleo para detectar inhibidores de DNMT1³⁷. Otro ensayo que utilizó una endonucleasa de restricción sensible al metilo se utilizó para detectar inhibidores de DNMT3a^25,38. Si bien ambos ensayos permitieron un mayor rendimiento que los ensayos tradicionales de metilación del ADN, los ensayos requieren múltiples pasos y no permiten la observación de la actividad de metilación en tiempo real. Más recientemente, se ha descrito un ensayo cinético continuo que acopla la formación de S-adenosilhomocisteína (SAH), un producto de la reacción de metilación, al cambio espectroscópico a 340 nm asociado con la oxidación de NADPH³⁹. Este ensayo utiliza tres enzimas de acoplamiento para generar una señal espectroscópica.

Desarrollamos un ensayo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia que utiliza una sola enzima de acoplamiento disponible comercialmente y puede generar datos en tiempo real (Figura 1). Un oligonucleótido de horquilla que contiene tres metilcitosinas se utiliza como sustrato. El ADN del sustrato contiene un fluoróforo en el extremo 5′ y un quencher en el extremo 3′. La metilación del sitio CpG hemimetilado genera el sitio de escisión para la endonucleasa Gla I – GCGC completamente metilado. La escisión Gla I del oligonucleótido producto libera el fluoróforo del exprimidor y genera fluorescencia en tiempo real. El ensayo se puede utilizar para examinar la actividad de cualquier isoforma de DNMT; sin embargo, se observa una mayor actividad con DNMT1 ya que esta isoenzima metila preferentemente el ADN hemimetilado ^1,5. Se observa una actividad aún más robusta si el dominio autoinhibitorio Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) se elimina de DNMT1. Este dominio, que se encuentra en la región reguladora N-terminal, se une al sitio catalítico y evita la unión del ADN. La eliminación de los primeros ~600 aminoácidos da como resultado una enzima truncada que es significativamente más activa que la enzima de longitud completa (aumento de ~640 veces en k_cat / K_m)⁴⁰. Esta forma activada de la enzima, conocida como DNMT1 que carece de RFTS (aminoácidos 621-1616), permite la identificación más fácil de los inhibidores debido a su mayor poder catalítico. Este documento presenta un protocolo para utilizar DNMT1 que carece de RFTS en ensayos para detectar posibles inhibidores de moléculas pequeñas. Usando el ensayo continuo acoplado a endonucleasa, la velocidad inicial se determina en presencia y ausencia de unas pocas moléculas pequeñas. Cada inhibidor potencial se examina en dos concentraciones para buscar la inhibición de DNMT1 dependiente de la concentración. El porcentaje de actividad observado en presencia de las moléculas pequeñas se calculó en cada caso.

Figura 1: Ensayo de metilación del ADN. Se utiliza como sustrato un ADN de horquilla hemimetilada con un fluoróforo en el extremo 5′ y un quencher en el extremo 3′. DNMT1 cataliza la transferencia del grupo metilo de S-adenosilmetionina al sitio CpG no metilado, generando S-adenosilhomocisteína y ADN completamente metilado. El producto de ADN contiene el sitio de escisión de la endonucleasa Gla I, que escinde los sitios GCGC completamente metilados. La escisión del ADN del producto libera el fluoróforo 5′ del enfriador 3′, generando fluorescencia. Abreviaturas: Fl = fluoróforo; Q = enfriador; DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; SAM = S-adenosilmetionina; HSA = S-adenosilhomocisteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Prepare soluciones de ensayo para la pantalla NOTA: Las concentraciones de sustratos utilizados en este ensayo pueden ser adaptadas. Para DNMT1 que carece de RFTS, los valores de Km determinados experimentalmente para el sustrato de ADN de horquilla y SAM son 1–2 nM y 2 μM, respectivamente26,40. Preparar 600 μL de cada condición de ensayo que se esté probando en tubos de microcentrífuga s…

Representative Results

DNMT1 activo es un requisito previo para este análisis. La DNMT1 que carece de RFTS se expresó en E. coli y se purificó a homogeneidad siguiendo procedimientos previamente publicados41. Para asegurar que la enzima purificada estaba activa, se utilizó un ensayo discontinuo acoplado a endonucleasa para examinar la actividad de metilación del ADN36. Este ensayo utiliza un ADN dúplex de 32 pares de bases con una sola CpG hemimetilada posicionada en un sitio de es…

Discussion

Para identificar y caracterizar los inhibidores de las metiltransferasas del ADN, se debe medir la actividad de la enzima. Existen varios métodos para examinar la actividad de la metiltransferasa del ADN. La actividad se controla comúnmente mediante radiactividad; La transferencia del grupo metilo marcado de SAM se puede cuantificar 29,30,31,32,33,34^</s…

Materials

96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates	ThermoFisher	249570
Bovine Serum Albumin	NEB	B9000S
compound 1	ChemBridge	5812086	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2	ChemBridge	6722175	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3	ChemBridge	5249376	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	methyl-sensitive endonuclease
Glycerol	RPI	G22025
Magnesium Chloride	Sigma	M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	custom synthesized	internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate	Sigma	G1501
S-adenosylmethionine	Sigma	A4377	methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base	RPI	T60040