Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

Published: August 5, 2022 doi: 10.3791/62949
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

Summary

DNA-metyltransferaser er potensielle kreftmedisinmål. Her presenteres en protokoll for å vurdere små molekyler for DNA-metyltransferasehemming. Denne analysen benytter en endonuklease for å koble DNA-metylering til fluorescensgenerering og gjør det mulig å overvåke enzymaktivitet i sanntid.

Abstract

DNA-metylering, en form for epigenetisk genregulering, er viktig for normal cellulær funksjon. I celler etablerer og opprettholder proteiner kalt DNA-metyltransferaser (DNMT) DNA-metyleringsmønsteret. Endringer i det normale DNA-metyleringsmønsteret er knyttet til kreftutvikling og progresjon, noe som gjør DNMTs potensielle kreftmedisinmål. Dermed er identifisering og karakterisering av nye små molekylhemmere av disse enzymene av stor betydning. Dette papiret presenterer en protokoll som kan brukes til å skjerme for DNA-metyltransferasehemmere. Den kontinuerlige koblede kinetikkanalysen gjør det mulig å bestemme innledende hastigheter av DNA-metylering i nærvær og fravær av potensielle små molekylhemmere. Analysen bruker den metylfølsomme endonuklease Gla I til å koble metylering av et hemimetylert DNA-substrat til fluorescensgenerering.

Denne kontinuerlige analysen gjør det mulig å overvåke enzymaktiviteten i sanntid. Gjennomføring av analysen i små mengder i mikrotiterplater reduserer kostnadene for reagenser. Ved hjelp av denne analysen ble det utført en liten eksempelskjerm for hemmere av DNMT1, den mest omfattende DNMT-isozymen hos mennesker. Det svært substituerte naturproduktet antrakinon, lakkasyre A, er en potent, DNA-kompetitiv hemmer av DNMT1. Her undersøker vi tre potensielle små molekylhemmere - antrakinoner eller antrakinonlignende molekyler med en til tre substituenter - i to konsentrasjoner for å beskrive analyseprotokollen. Innledende hastigheter brukes til å beregne prosentaktiviteten observert i nærvær av hvert molekyl. En av tre undersøkte forbindelser utviser konsentrasjonsavhengig hemming av DNMT1-aktivitet, noe som indikerer at det er en potensiell hemmer av DNMT1.

Introduction

DNA-metylering er et viktig epigenetisk merke som regulerer genuttrykk og kromatinstruktur. Metylering forekommer hovedsakelig i CpG-dinukleotider - cytosin etterfulgt av guanosin; metylgruppen tilsettes til 5-posisjonen av cytosin. Korrekte DNA-metyleringsmønstre, og dermed riktig genuttrykk, er nødvendig for passende cellulær utvikling og funksjon. Mange sykdomstilstander har vært assosiert med endringer i det normale metyleringsmønsteret 1,2,3. For eksempel er det en sammenheng mellom kreftinitiering og progresjon og endringer i DNA-metyleringsmønsteret. Vanligvis viser kreftceller lavere generelle nivåer av metylcytosin, noe som bidrar til ustabilitet i genomet. Samtidig er metylcytosinet som er tilstede i genomet konsentrert i promotorområdene av tumorundertrykkende gener, noe som fører til geninaktivering av disse viktige proteinene. Spesielt er epigenetiske endringer dynamiske og reversible, i motsetning til DNA-mutasjonene forbundet med tumorigenese. Dette har gjort proteinene involvert i epigenetisk genregulering interessante legemiddelmål 2,4.

DNA-metyltransferaser (DNMT) er proteinene som er ansvarlige for å generere og opprettholde DNA-metyleringsmønstre. Tre katalytisk aktive isoenzymer, DNMT1, DNMT3a og DNMT3b, finnes hos mennesker. Under utvikling og differensiering etablerer de novo metyltransferaser, DNMT3a og DNMT3b, metyleringsmønstre. Begge enzymene kan binde det katalytisk inaktive DNMT3L-proteinet for å danne komplekser som viser økt aktivitet 1,5. Etter celledeling inneholder datterceller hemimetylert DNA - DNA som inneholder metylcytosin i bare en streng av dupleks - fordi det nylig syntetiserte DNA er blottet for metyleringsmerker. Hovedfunksjonen til DNMT1 er å metylere dette hemimetylerte DNA, og dermed gjenopprette det fulle metyleringsmønsteret 1,5.

Koblinger mellom DNMT aktivitet og kreft er godt etablert. Overekspresjon av DNMT1, enten ved transkripsjonelle eller posttranslasjonelle mekanismer, er en konsekvens av flere vanlige onkogene veier 6,7,8,9. Genetiske tilnærminger til lavere DNMT1-aktivitet ved bruk av hypomorfe alleler resulterer i redusert tumordannelse hos Apc(Min)mus10. Antisense oligonukleotider som knockdown DNMT1 hemmer neoplasi i cellekultur og musetumormodeller11,12. Dermed virker hemming av DNMT1-aktivitet som en lovende kreftbehandlingsmetode. Rollene DNMT3-isozymene spiller er imidlertid ikke så enkle. DNMT3a-mutasjoner finnes ved akutt myelogen leukemi13 og myelodysplastisk syndrom14. Minst en av de identifiserte mutasjonene har vist seg å redusere DNA-metyleringsaktiviteten til enzymet15. DNMT3b er imidlertid overuttrykt i brystkreft16 og kolorektal kreft17. Med de forskjellige DNMT-isoenzymene som spiller forskjellige roller i karsinogenese, vil identifisering av isozymespesifikke hemmere være kritisk. Ikke bare vil disse forbindelsene være nyttige for utvikling av terapeutiske midler, men isozyme-spesifikke hemmere vil også være et uvurderlig verktøy for å dissekere rollen til hver DNMT-isozyme i kreftetiologi.

Flere DNMT-hemmere er rapportert i litteraturen. Kjente DNMT-hemmere kan deles inn i to klasser: nukleosid og ikke-nukleosid. Nukleosidhemmere er vanligvis cytidinanaloger. Disse forbindelsene er inkorporert i DNA og kovalent felle DNMTs. 5-azacytidin og 5-aza-2'-deoksycytidin er godkjent for behandling av myelodysplastisk syndrom og akutt myelogen leukemi 4,18. Den høye toksisiteten, lav biotilgjengelighet og kjemisk ustabilitet av disse forbindelsene gir problemer. Pågående arbeid undersøker effekten av neste generasjon nukleosidhemmere; SGI-110, avledet fra 5-aza-2'-deoksycytidin, er et eksempel 19,20. Nukleosidhemmere er ikke isozymespesifikke og vil inaktivere ethvert dnmt-isoenzym som oppstår. Derfor resulterer behandling med et nukleosid-demetyleringsmiddel i uttømming av alle DNMT-isoenzymer 4,18. Ikke-nukleosidhemmere trenger ikke å bli innlemmet i DNA for å utøve sine hemmende effekter. I stedet binder disse molekylene seg direkte til DNMT, og introduserer muligheten for isozymespesifikk inhibering. Flere ikke-nukleosidhemmere har blitt oppdaget til dags dato, inkludert SGI-1027 21, hydralazin22, prokainamid 23, RG108 og derivater 24, og naturlige produkter, (−)-epigallocatechin 3-gallate (EGCG)25 og lakkasyre A26,27. De fleste av de ikke-nukleosidhemmere oppdaget til dags dato er ikke isozyme-selektive eller vise svake preferanser for en DNMT isozyme. I tillegg må styrken til disse molekylene forbedres, spesielt i celler 4,18. Dermed er det behov for å oppdage eller utvikle mer potente, isozymeselektive DNMT-hemmere.

Et hinder for å oppdage nye små molekylhemmere av DNMTs er de arbeidskrevende analysene som tradisjonelt brukes til å undersøke DNMT-aktivitet28. Analyser er vanligvis diskontinuerlige med flere trinn. Den enzymatiske aktiviteten til DNMTs er fortsatt rutinemessig analysert ved bruk av radioaktiv S-adenosylmetionin (SAM) 29,30,31,32,33,34. Ikke-radioaktive analyser for DNA-metylering er også utviklet. For eksempel er analyser som benytter metylfølsomme restriksjonsendonukleaser og elektroforese for å skille fordøyelsesproduktene beskrevet35,36. Denne typen diskontinuerlige, flertrinnsanalyser er ikke lett mottagelige for narkotikaforskning. Siden midten av 2000-tallet har flere DNA-metyleringsanalyser med høyere gjennomstrømning blitt utviklet28. En scintillasjonsnærhetsanalyse ble brukt til å screene for DNMT1-hemmere37. En annen analyse ved bruk av en metylfølsom restriksjonsendonuklease ble brukt til å screene for DNMT3a-hemmere25,38. Mens begge analysene tillot høyere gjennomstrømning enn tradisjonelle DNA-metyleringsanalyser, krever analysene flere trinn og tillater ikke observasjon av metyleringsaktivitet i sanntid. Mer nylig er det beskrevet en kontinuerlig kinetikkanalyse som parrer dannelsen av S-adenosylhomocystein (SAH), et produkt av metyleringsreaksjonen, til den spektroskopiske forandringen ved 340 nm assosiert med NADPH-oksidasjon39. Denne analysen bruker tre koblingsenzymer for å generere et spektroskopisk signal.

Vi utviklet en fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse som benytter et enkelt kommersielt tilgjengelig koblingsenzym og kan generere data i sanntid (figur 1). Et hårnålsoligonukleotid som inneholder tre metylcytosiner brukes som substrat. Substrat-DNA inneholder en fluorofor på 5'-enden og en slukker på 3'-enden. Metylering av det hemimetylerte CpG-området genererer spaltningsstedet for endonuklease Gla I - fullt metylert GCGC. Gla I-spaltning av produktet oligonukleotid frigjør fluoroforen fra slukkeren og genererer fluorescens i sanntid. Analysen kan brukes til å undersøke aktiviteten til en hvilken som helst isoform av DNMT; Imidlertid observeres høyere aktivitet med DNMT1, da dette isozymet fortrinnsvis metylerer hemimetylert DNA 1,5. Enda mer robust aktivitet observeres hvis domenet autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) fjernes fra DNMT1. Dette domenet, som finnes i N-terminalreguleringsområdet, binder seg til det katalytiske stedet og forhindrer DNA-binding. Fjerning av de første ~ 600 aminosyrene resulterer i et avkortet enzym som er betydelig mer aktivt enn enzymet i full lengde (~ 640 ganger økning i kcat / Km) 40. Denne aktiverte formen av enzymet, referert til som RFTS-manglende DNMT1 (aminosyrer 621-1616), muliggjør lettere identifisering av inhibitorer på grunn av sin økte katalytiske kraft. Dette papiret presenterer en protokoll for å bruke RFTS-manglende DNMT1 i analyser for å skjerme for potensielle små molekylhemmere. Ved bruk av endonukleasekoblet kontinuerlig analyse bestemmes starthastigheten i nærvær og fravær av noen få små molekyler. Hver potensiell hemmer undersøkes i to konsentrasjoner for å se etter konsentrasjonsavhengig DNMT1-hemming. Den prosentvise aktiviteten observert i nærvær av de små molekylene ble beregnet i hvert tilfelle.

Figure 1
Figur 1: DNA-metyleringsanalyse. Et hemimetylert hårnåls-DNA med en fluorofor på 5'-enden og en slukker på 3'-enden brukes som substrat. DNMT1 katalyserer overføringen av metylgruppen fra S-adenosylmetionin til det ikke-metylerte CpG-stedet, genererer S-adenosylhomocystein og fullt metylert DNA. DNA-produktet inneholder spaltningsstedet for endonuklease Gla I, som klipper fullt metylerte GCGC-steder. Spaltning av produkt-DNA frigjør 5'-fluoroforen fra 3'-slukkeren, og genererer fluorescens. Forkortelser: Fl = fluorofor; Q = slukke; DNMT1 = DNA-metyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionine; SAH = S-adenosylhomocystein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered analyseløsninger for skjermen

MERK: Konsentrasjonene av substrater som brukes i denne analysen kan tilpasses. For RFTS-manglende DNMT1 er de eksperimentelt bestemte Km-verdiene for hårnåls-DNA-substratet og SAM henholdsvis 1–2 nM og 2 μM, henholdsvis26,40.

  1. Forbered 600 μL av hver analysetilstand som testes i mikrosentrifugerør på is.
    MERK: Det totale volumet av analyseløsning som trengs, avhenger av antall replikasjoner som utføres. Hver analysebetingelse ble kjørt i tre eksemplarer for denne protokollen.
    1. Tilsett ddH2 O og 5x metyleringsbuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamat, 5 mM dithiothreitol (DTT), 25% glyserol) til hvert rør for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1x buffer. For analyser som inneholder 20 μM forbindelse, tilsett 472 μL ddH2O og 120 μL 5x buffer. For analyser som inneholder 50 μM forbindelse, tilsett 470 μL ddH2O og 120 μL 5x buffer.
    2. Tilsett 3,15 μL 20 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) til hver prøve.
    3. Tilsett 2 μL 3,15 μM hårnåls DNA-substrat og 1,33 μL 4,75 mM SAM til hver prøve.
      MERK: Konsentrasjonen av substrater i analyseoppløsningsblandingen er 1,05 ganger de ønskede endelige konsentrasjonene.
    4. Legg inhibitor til en endelig konsentrasjon på 21 μM (1,26 μL på 10 mM) eller 52,5 μM (3,15 μL av 10 mM) til de aktuelle prøvene. Tilsett en ekvivalent mengde dimetylsulfoksid (DMSO) til en kontrollprøve.
      MERK: Konsentrasjonen av inhibitor som brukes i skjermen kan varieres. Maksimal endelig DMSO-konsentrasjon bør være ≤5 % (v/v). DMSO-konsentrasjoner på opptil 5 % (v/v) har ingen effekt på aktiviteten observert i analysen26.
  2. Bland løsningene ved vortexing (3000 o / min) i 3 s. Spinn prøvene i noen sekunder i en minisentrifuge (1,200 × g) for å sikre at løsningen samles i bunnen av røret.
  3. Aliquot 95 μL av hver analyseløsning i 6 påfølgende brønner i en svart halvareal 96-brønnplate (figur 2).
    MERK: Disse screeninganalysene ble utført i to omganger. Først ble 20 μM-hemmerprøver (4 totale tilstander) undersøkt, etterfulgt av 50 μM-hemmerprøver (4 totale forhold).

Figure 2
Figur 2: Oppsett av analyseplate. Hver analyseløsning aliseres i seks brønner i den svarte 96-brønnsplaten: DMSO-kontroll (blå), forbindelse 1 (grønn), forbindelse 2 (rød) og forbindelse 3 (gul). Både RFTS-manglende DNMT1 og Gla I vil bli lagt til tre brønner. Som en kontroll vil Gla I alene bli lagt til de tre andre brønnene. Forkortelser: RFTS = Replikasjon Foci målretting sekvens; DNMT1 = DNA-metyltransferase 1; DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Klargjør enzymløsninger for skjerm

MERK: RFTS-manglende DNMT1 kan uttrykkes i E. coli og renses til homogenitet. Ekspresjons- og renseprosedyrer for RFTS-manglende DNMT1 er beskrevet tidligere41. Volumet av enzym som trengs, avhenger av antall analyser som utføres. Her utføres fire forskjellige analyser i hvert sett; Hver analyse fullføres i tre eksemplarer.

  1. Forbered 75 μL av hver enzymoppløsning i mikrosentrifugerør på is.
    MERK: To enzymløsninger vil være nødvendig. En løsning vil inneholde DNMT1 og Gla I; den andre vil bare inneholde Gla I.
    1. Tilsett ddH2 O og 5x metyleringsbuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamat, 5 mM DTT, 25% glyserol) til hvert rør for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1x buffer. For Gla I-enzymløsningen, tilsett 15 μL 5x buffer og 58,8 μL ddH2O. For DNMT1 + Gla I enzymoppløsning, tilsett 15 μL 5x buffer og 58,2 μL ddH2O.
    2. Tilsett 1,2 μL 10 U/μL Gla I til hver oppløsning for en endelig konsentrasjon på 0,16 U/μL.
    3. Tilsett 0,6 μL 5 μM RFTS-manglende DNMT1 for en endelig konsentrasjon på 40 nM til DNMT1+Gla I-løsningen.
  2. Trykk forsiktig på for å blande oppløsningene. Spinn prøvene i noen sekunder i en mini-sentrifuge (1.200 × g) for å sikre at løsningen samles i bunnen av røret.
  3. Aliquot 12 μL av hver enzymløsning i 6 brønner i en koniskbunnet 96-brønnplate (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Oppsett av enzymplate. Løsningene Gla I (grå) og DNMT1+Gla I (blå) aliquoted hver i seks brønner i 96-brønnsplaten. Ved hjelp av en flerkanals pipet kan enzymet tilsettes en rad med analyseløsninger samtidig. For hver analysebetingelse (seks brønner) vil tre brønner motta DNMT1+Gla I, og tre brønner vil motta Gla I alene. Forkortelse: DNMT1 = DNA metyltransferase 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Kjør analysen og analyser dataene.

  1. Forvarm plateleseren til 37 °C. Sett inn den svarte platen som inneholder analyseløsningene. Rist platen (dobbel orbital ved 425 cpm for 5 s) og les fluorescensen med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en utslippsbølgelengde på 528 nm. Inkuber platen ved 37 °C i 5 min.
    MERK: Alternativt kan filtre med riktige bølgelengdeavskjæringer brukes til fluorescensavlesningene.
  2. Fjern analyseplaten. Tilsett 5 μL enzymoppløsning til hver brønn og bland ved pipettering opp og ned.
    MERK: Bruk flerkanalspipetter slik at en rad med prøver kan startes samtidig.
  3. Sett platen inn i plateleseren. Registrer fluorescens hver 53 s i 30 minutter. Rist platen (dobbel orbital ved 425 cpm i 4 s) før hver avlesning.
  4. Gjennomsnittlig tredobbelt Gla I kontrollanalyser for hver tilstand. Trekk det gjennomsnittlige Gla I-holdige kontrollreaksjonssporet fra de tredoble sporene oppnådd i nærvær av RFTS-manglende DNMT1. Bestem gjennomsnitts- og standardfeilen for gjennomsnittet for de korrigerte replikasjonene.
  5. Plott det gjennomsnittlige korrigerte reaksjonssporet og tilpass den første lineære delen til en linje for å bestemme starthastigheten.
  6. Bestem prosentaktiviteten ved å dele hastigheten observert i nærvær av en forbindelse med hastigheten observert i den DMSO-holdige kontrollreaksjonen og multiplisere med 100.

4. Ytterligere analysekontroll - sekvensiell tilsetning av enzymer

  1. Forbered 550 μL analyseløsning i et mikrosentrifugerør på is. Tilsett 110 μL 5x metyleringsbuffer, 3,88 μL 3,15 μM hårnåls-DNA-substrat, 6,43 μL 47,5 mM SAM, 3,06 μL 20 mg / ml BSA og 426,6 μL ddH2O.
  2. Bland oppløsningen ved vortexing (3000 o / min) i 3 s. Spinn prøvene i noen sekunder i en minisentrifuge (1,200 × g) for å sikre at løsningen samles i bunnen av røret.
  3. Aliquot 90 μL av analyseløsningen i 6 påfølgende brønner i en svart halvareal 96-brønnplate.
  4. Forbered DNMT1-enzymløsningene på is. Tilsett 4 μL 5x metyleringsbuffer, 0,76 μL 5 μM RFTS-manglende DNMT1 og 15,24 μL ddH2O til ett rør. Tilsett 4 μL 5x metyleringsbuffer og 16 μL ddH2O til et annet rør.
  5. Trykk forsiktig på for å blande oppløsningene. Spinn prøvene i noen sekunder i en bordplate mini-sentrifuge (1.200 × g) for å sikre at løsningen samles i bunnen av røret.
  6. Tilsett 5 μL av den DNMT1-holdige oppløsningen til tre brønner i den svarte halvarealet 96-brønnsplaten. Tilsett 5 μL av bufferkontrollløsningen til de tre andre brønnene.
  7. Plasser mikrotiterplaten i plateleseren forvarmet til 37 °C. Rist platen (dobbel orbital ved 425 cpm for 3 s) og les fluorescensen med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 528 nm. Gjenta ristingen og les hver 60 s i 30 min.
  8. Mens analyseplaten er i plateleseren, klargjør du Gla I-løsningen på is. Tilsett 8 μL 5x metyleringsbuffer, 0,64 μL 10 U / μL Gla I og 31,4 μL ddH2O til et mikrosentrifugerør. Trykk forsiktig på for å blande oppløsningen. Spinn prøven i noen sekunder i en bordplate mini-sentrifuge (1.200 × g) for å sikre at løsningen samles i bunnen av røret.
  9. Aliquot 6 μL av Gla I-løsningen i 6 brønner i en koniskbunnet 96-brønnplate.
  10. Etter den første 30 minutters lesingen, fjern den svarte platen fra plateleseren. Tilsett 5 μL Gla I-løsning i alle 6 brønner og bland ved pipettering opp og ned.
    MERK: Bruk en flerkanalspipet slik at alle brønnene kan startes samtidig.
  11. Plasser den svarte platen tilbake i plateleseren. Registrer fluorescens hver 35 s i 35 minutter. Rist platen (dobbel orbital ved 425 cpm i 3 s) før hver avlesning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aktiv DNMT1 er en forutsetning for denne analysen. RFTS-manglende DNMT1 ble uttrykt i E.coli og renset til homogenitet etter tidligere publiserte prosedyrer41. For å sikre at det rensede enzymet var aktivt, ble en diskontinuerlig endonukleasekoblet analyse brukt til å undersøke DNA-metyleringsaktivitet36. Denne analysen benytter et 32 basepar dupleks DNA med en enkelt hemimetylert CpG plassert i et Sau3A1-spaltningssted. Sau3A1 kan spalte det hemimetylerte substratet DNA; spaltning er imidlertid blokkert når DNA er fullstendig metylert. RFTS-manglende DNMT1 ble lagt til analyser som inneholdt 1 μM DNA og 0,5 mM SAM, og aliquots ble fjernet og flashfrosset over 30 min. Prøvene ble deretter fordøyd med Sau3A1, og produktene ble separert med gelelektroforese. Som vist i figur 4, er DNA beskyttet mot spaltning når reaksjonstiden øker, noe som indikerer at RFTS-manglende DNMT1 metylerer det hemimetylerte DNA. Det meste av 1 μM substrat-DNA som opprinnelig var tilstede i analysen, er omdannet til produkt i løpet av 30-minutters tidsforløpet.

Den endonukleasekoblede analysen beskrevet i dette papiret tillater observasjon av DNA-metyleringsaktivitet i sanntid som en økning i fluorescens. Nøkkelen til suksessen til denne analysen er metylfølsomheten til endonuklease Gla I. Gla I spalter ikke effektivt det hemimetylerte substrat-DNA, men vil spalte det fullt metylerte produkt-DNA (figur 1). Spaltning av hårnåls-DNA er nødvendig for å frigjøre fluoroforen fra slukkeren og generere en økning i fluorescensen. For å demonstrere at enzymene fungerer som forventet, ble det utført en kontrollreaksjon der enzymene, RFTS-manglende DNMT1 og Gla I, ble tilsatt sekvensielt i stedet for samtidig. Hvis den koblede analysen fungerer som den skal, bør tilsetningen av DNMT1 ikke påvirke fluorescensen, da metylering av DNA-substratet ikke forventes å påvirke bakgrunnsfluorescensen til det internt slukkede hårnåls-DNA. Imidlertid bør etterfølgende tilsetning av Gla I til analyser som inneholdt metyltransferasen resultere i fluorescensgenerering på grunn av spaltning av det fullt metylerte hårnåls-DNA. Det hemimetylerte hårnåls-DNA-substratet i seg selv har bakgrunnsfluorescens (figur 5); disse analysene inneholdt 20 nM hårnåls-DNA og 500 μM SAM. RFTS-manglende DNMT1 eller buffer ble lagt til analysene, og fluorescens ble fulgt i 30 minutter.

Som vist i figur 5 er fluorescensen upåvirket av RFTS-manglende DNMT1 i fravær av koblingsenzymet (blå nyanser inneholdt 10 nM RFTS-manglende DNMT1 mens røde nyanser er bufferkontrollen). Dermed endrer metylering av det hemimetylerte CpG-stedet ved DNMT1 ikke fluorescenssignalet nevneverdig. Men da Gla I ble lagt til alle brønner, ble robust fluorescensgenerering bare observert i analysene som inneholdt RFTS-manglende DNMT1 (figur 5). Dette viser at metylering av det hemimetylerte substrat-DNA ved DNMT1 er nødvendig for Gla I-spaltning og generering av fluorescens. Det skal bemerkes at økningen i fluorescens observert i denne kontrollanalysen gjenspeiler aktiviteten til Gla I da enzymene ble tilsatt sekvensielt. Alternativt kan disse reaksjonsblandingene fordøyes med Gla I, og de resulterende oligonukleotidene kan separeres ved elektroforese for å visualisere spaltning og sikre at enzymene fungerer som forventet.

For å bruke denne koblede analysen for å direkte bestemme de innledende hastighetene til DNMT1, må begge enzymer, RFTS-manglende DNMT1 og Gla I, tilsettes samtidig. Så lenge hastigheten på Gla I-spaltning av produkt-DNA er raskere enn DNA-metyleringshastigheten ved DNMT1, vil fluorescenssignalet som genereres gjenspeile DNA-metyleringsaktivitet. For å sikre at DNMT1-aktiviteten er hastighetsbegrensende, kan konsentrasjonen av DNMT1 varieres mens alle andre analysebetingelser holdes konstant. Graden av fluorescensgenerering bør være proporsjonal med konsentrasjonen av DNMT1. Dette har tidligere blitt vist for RFTS-manglende DNMT1 under de forhold som benyttes her40. Ved bruk av denne koblede analysen for å undersøke DNMT-aktivitet, utføres en Gla I-holdig kontrollreaksjon i tillegg til reaksjonen som inneholder både DNMT1 og Gla I (figur 6A). Gla I-kontrollen har flere funksjoner. Å trekke Gla I-kontrollreaksjonssporet fra det DNMT-holdige reaksjonssporet muliggjør regnskapsføring av både langsom spaltning av det hemimetylerte DNA-substratet og bakgrunnsfluorescensen. De korrigerte reaksjonssporene som genereres reflekterer DNA-metyleringsaktiviteten til DNMT1. Tilpasning av den første lineære delen av det korrigerte reaksjonssporet gjør det mulig å bestemme starthastigheten (figur 6B). Med 10 nM hårnåls-DNA-substrat og 10 μM SAM ble det oppnådd en starthastighet på 113 ± 2 RFU/min.

Substituerte antrakinoner har tidligere vist seg å hemme aktiviteten til DNMT1. Det naturlige produktet, lakkasyre A, et svært substituert antrakinon, er en potent, DNA-konkurransedyktig hemmer av DNMT127. Noen få forbindelser med enklere strukturer, en eller to substituenter på antrakinonkjernen, med en som en stor aromatisk substituent, har også vist seg å hemme DNMT1 på en DNA-konkurransedyktig måte41. Her ble evnen til tre substituerte antrakinoner eller antrakinonlignende molekyler til å hemme RFTS-manglende DNMT1-aktivitet i Gla I-koblede analysen undersøkt som et eksempel på hvordan man utfører disse screeninganalysene. Disse forbindelsene inneholdt en til tre substituenter, alle på den ene siden av antrakinonkjernen (tabell 1). Substratkonsentrasjonene (10 nM DNA og 10 μM SAM) som brukes til disse analysene er ~ 5x høyere enn Km for hvert substrat. Signalet som genereres i analysen kommer direkte fra substratets DNA. På grunn av dette er det vanskelig å analysere ved konsentrasjoner nær eller under Km; det er rett og slett ikke nok signal til å oppdage. Disse substratkonsentrasjonene ble valgt fordi robust aktivitet ses under disse forholdene i fravær av inhibitorer (figur 6B). Andre substratkonsentrasjoner kan brukes i screeninganalyser. For eksempel kan gjennomføring av en skjerm ved metning av SAM-konsentrasjoner brukes som en strategi for å bias søket mot SAM-konkurransehemmere.

Hver analyse inneholdt hårnåls-DNA-substratet, den metyldonerende kofaktoren SAM og en potensiell hemmer eller DMSO som en kontroll for skjermen. Vi genererer rutinemessig 10 mM-løsninger av screeningforbindelser i DMSO for bruk i analyser. Antrakinoner som de som er undersøkt her, viser dårlig oppløselighet i vandige løsninger. For å generere konsentrerte lagre brukes DMSO som løsningsmiddel. Tilsetningen av DMSO opp til 5% (v / v) endelig konsentrasjon påvirker ikke aktiviteten i analysen26. Når det gjelder forbindelser med lav løselighet i vandig oppløsning, bør det imidlertid utvises forsiktighet for å sikre at forbindelsen er løselig ved den valgte endelige screeningkonsentrasjonen(e).

For hver tilstand som undersøkes i skjermen, utføres en Gla I-holdig kontrollanalyse. I tillegg til å ta hensyn til bakgrunnsfluorescens og langsom spaltning av substratets hårnåls-DNA, tillater denne kontrollen bestemmelse av om den potensielle inhibitoren forstyrrer det spektroskopiske signalet (f.eks. Det er fluorescerende). Etter å ha startet reaksjonen ved å tilsette enzymer, ble fluorescens målt i 30 minutter med et tidsintervall på 53 s i screeningdataene. Dette er det raskeste tidsintervallet som er tilgjengelig på plateleseren i dette laboratoriet når du leser en hel 96-brønnsplate. Andre tidsintervaller kan brukes til å generere reaksjonssporene. Et passende tidsintervall vil avhenge av instrumentet som benyttes og antall brønner som leses. For å sikre reproduserbarhet utføres hver analyse i tre eksemplarer. Det gjennomsnittlige Gla I-holdige kontrollsporet trekkes fra reaksjonssporene observert i nærvær av RFTS-manglende DNMT1. Den innledende hastigheten til reaksjonen kan bestemmes ved å tilpasse den første lineære delen av de korrigerte reaksjonssporene.

I utgangspunktet ble virkningen av tre potensielle hemmere på fluorescensgenerering undersøkt ved en endelig konsentrasjon på 20 μM. Høyere konsentrasjoner av potensielle hemmere ble valgt for screening av to grunner. For det første er substratkonsentrasjonene i analysen begge over deres respektive Km-verdier . Dette kan gjøre det vanskeligere å oppdage inhibering i kinetiske analyser, spesielt hvis inhibitorene er konkurransedyktige. For det andre er antrakinonlignende forbindelser som brukes i denne skjermen betydelig enklere i struktur enn den kjente hemmeren, lakkasyre A. Siden disse molekylene bare inneholder noen få substituenter rundt kjernestrukturen, forventet vi svakere interaksjoner. I den DMSO-holdige kontrollanalysen ble det oppnådd en innledende hastighet på 111 ± 5 RFU/min (figur 7A). Merk at dette er svært likt frekvensen rapportert tidligere i fravær av DMSO og bekrefter at tillegg av lave mengder DMSO ikke påvirker den observerte aktiviteten. Tilsetningen av to forbindelser reduserte den observerte starthastigheten, mens tilsetningen av den tredje forbindelsen ikke hadde noen effekt på aktiviteten. De opprinnelige hastighetene ble brukt til å bestemme prosentaktiviteten observert i nærvær av hver forbindelse. Ved 20 μM resulterte tilsetningen av forbindelser 1 og 2 i en prosent aktivitet på ~ 80%, mens 100% prosent aktivitet ble observert i nærvær av forbindelse 3, noe som indikerer at dette molekylet ikke hemmer enzymet (tabell 1).

Inhibitorer forventes å utvise konsentrasjonsavhengig hemming. Deretter ble disse molekylene undersøkt på nytt ved en enda høyere konsentrasjon på 50 μM. For dette settet med analyser hadde den DMSO-holdige kontrollanalysen en innledende hastighet på 125 ± 7 RFU/min (figur 7B). Denne hastigheten er litt høyere enn de tidligere bestemte prisene; Imidlertid er disse hastighetene alle relativt nære innen feil. Igjen hadde forbindelse 3 liten effekt på starthastigheten, mens tilsetningen av forbindelser 1 og 2 reduserte den observerte starthastigheten. Som forventet, ved høyere konsentrasjon, hadde forbindelse 1 en større innvirkning på aktiviteten. Ved 50 μM resulterte tilsetningen av forbindelse 1 i en prosent aktivitet på ~60% (tabell 1). Tilsetningen av en høyere konsentrasjon av forbindelse 2 resulterte imidlertid ikke i mer robust hemming. Den prosentvise aktiviteten observert i nærvær av 50 μM forbindelse 2 var igjen nær 80%.

Som det fremgår av dataene som presenteres, kan den endonukleasekoblede fluorescensbaserte DNA-metyleringsanalysen brukes til å skjerme for potensielle DNMT-hemmere. Dataene indikerer at forbindelse 1 og forbindelse 2 er potensielle hemmere, mens forbindelse 3 ikke er det. Ytterligere studier er nødvendig for å validere potensielle hemmere som ekte DNMT1-hemmere.

Figure 4
Figur 4: DNMT1 aktivitetskontroll. Hemimetylert dupleks DNA-metylering beskytter mot Sau3A1-spaltning. RFTS-manglende DNMT1 ble tilsatt til analyseblandinger inneholdende 1 μM DNA og 500 μM SAM. Prøver ble samlet inn på de angitte tidspunktene under en 30-minutters inkubasjon ved 37 ° C, fordøyd med Sau3A1, og løst ved gelelektroforese på 18% SIDE. Her vises 5, 10, 15 og 30 min prøver. Det første kjørefeltet er en kontroll som mangler DNMT1. Forkortelser: DNMT1 = DNA metyltransferase 1; RFTS = Replikasjon Foci målretting sekvens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Fluorescensbasert analysekontroll. RFTS-manglende DNMT1 (10 nM endelig konsentrasjon) og Gla I (0,8 U) ble tilsatt sekvensielt til tredoble analyser som inneholdt 20 nM hårnåls-DNA-substrat og 500 μM SAM. Tillegg av DNMT1 (blå sirkler) eller buffer (røde sirkler) alene hadde ingen effekt på bakgrunnsfluorescensen. Tilsetning av Gla I til alle analyser resulterer i fluorescensgenerering i analyser som inneholdt DNMT1, men ikke i analyser som ikke gjør det. Forkortelser: DNMT1 = DNA metyltransferase 1; RFTS = replikering foci målretting sekvens; RFU = relative fluorescensenheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Fluorescensreaksjonsspor. Tredoble analyser inneholdt 10 nM hårnåls DNA-substrat og 10 μM SAM. (A) RFTS-manglende DNMT1 (2 nM) og Gla I (0,8 U) ble lagt til tre analyser (blå), og Gla I (0,8 U) alene ble lagt til tre analyser (rød). Robust fluorescensgenerering observeres bare i analysene som inneholder begge enzymer. (B) Det gjennomsnittlige Gla I-reaksjonssporet ble trukket fra DNMT1+Gla I-reaksjonssporene. Gjennomsnitts- og standardfeilen for gjennomsnittet av de tredoble dataene vises. Montering av den lineære delen av sporet gir en starthastighet på 113 ± 2 RFU/min. Forkortelser: DNMT1 = DNA metyltransferase 1; RFTS = replikering foci målretting sekvens; RFU = relative fluorescensenheter; SAM = S-adenosylmetionin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: DNA-metyleringsaktivitet i nærvær av potensielle hemmere. DNA-metyleringsaktivitet av RFTS-manglende DNMT1 ble undersøkt i nærvær av DMSO (svart), forbindelse 1 (rød), forbindelse 2 (blå) eller forbindelse 3 (grønn). Korrigerte reaksjonsspor ved 20 μM forbindelse (A) og 50 μM forbindelse (B) var egnet til å bestemme starthastigheten. Tilsetning av forbindelser 1 og 2 reduserte observert hastighet, mens forbindelse 3 hadde liten innvirkning på aktiviteten. Gjennomsnittlig og standardfeil for gjennomsnittet for de tredoble analysene vises. Forkortelser: DNMT1 = DNA metyltransferase 1; RFTS = replikering foci målretting sekvens; RFU = relative fluorescensenheter; DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Innledende hastigheter og prosentvise aktiviteter observert i nærvær av potensielle småmolekylhemmere. Innledende hastighet ble bestemt ved å tilpasse den første lineære delen av korrigerte reaksjonsspor til en linje; Feilen knyttet til passformen rapporteres. Prosentaktivitet ble bestemt ved å dele hastigheten bestemt i nærvær av forbindelse med hastigheten bestemt i DMSO-kontrollreaksjonen og multiplisere med 100; tilhørende feil ble forplantet. Forkortelser: Cmpd = sammensatt; DMSO = dimetylsulfoksid; RFU = relative fluorescensenheter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å identifisere og karakterisere inhibitorer av DNA-metyltransferaser, må enzymets aktivitet måles. Det finnes flere metoder for å undersøke DNA-metyltransferaseaktivitet. Aktivitet overvåkes vanligvis ved hjelp av radioaktivitet; overføring av den merkede metylgruppen av SAM kan kvantifiseres 29,30,31,32,33,34. Gelbaserte analyser som benytter metylfølsomme endonukleaser er også beskrevet35,36. Disse analysene er vanligvis diskontinuerlige og krever flere trinn for å undersøke aktivitet. Her beskrives en endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for potensielle DNA-metyltransferasehemmere. Denne teknikken har flere fordeler. Analysen er relativt enkel. Det krever ikke separasjonsteknikker (f.eks. Elektroforese, filterbinding) for å oppnå et signal. I tillegg er analysen kontinuerlig, slik at innsamling av data i sanntid. En annen kontinuerlig kinetikkanalyse for metyleringsaktivitet ble nylig beskrevet39. Denne analysen krever imidlertid tre koblingsenzymer for å generere et spektroskopisk signal. Analysen beskrevet her krever et enkelt koblingsenzym.

Disse DNMT-aktivitetsanalysene utføres ved først å generere en analyseløsning som inneholder alle analysekomponentene unntatt enzymer. Analyseløsningene inneholder substratene, hårnåls-DNA og SAM; 0,1 mg/ml BSA er også rutinemessig inkludert i analysene. Med de ekstremt lave konsentrasjonene (i nanomolarområdet) av DNA og DNMT1 som brukes i analysen, øker BSA den generelle proteinkonsentrasjonen for å forhindre vedheft til pipetspisser, rør og mikrotiterplater og miljømessige fornærmelser som kan påvirke enzymaktiviteten. Reaksjonen initieres deretter ved å tilsette enzymer til analyseløsningene. Disse fortynningene må tas hensyn til ved bestemmelse av de endelige konsentrasjonene av alle analysekomponenter. Reaksjoner initieres ved å tilsette 5 μL enzymoppløsning til 95 μL analyseløsning. Derfor er konsentrasjonene av DNA, SAM og BSA i analyseløsningene 1,05 ganger den ønskede endelige konsentrasjonen. For eksempel, hvis 10 nM DNA er ønsket, genereres analyseløsninger med 10,5 nM DNA. Konsentrasjonen av RFTS-manglende DNMT1 i enzymoppløsningen er 20x ønsket sluttkonsentrasjon. Her ble 40 nM RFTS-manglende DNMT1 brukt i enzymløsningen slik at den endelige konsentrasjonen av DNMT1 i hver analyse var 2 nM.

Siden Gla I er et kommersielt tilgjengelig enzym, er mengden gitt i enheter (U) som levert av produsenten. Enzymløsningene som genereres inneholder 0,16 U/μL Gla I slik at totalt 0,8 U Gla I tilsettes hver brønn. For å spare på reagenskostnader fremstilles små volumer av de aktuelle enzymløsningene, og disse løsningene blir deretter aliquoted i koniskbunnede 96-brønnsplater. Ved hjelp av flerkanalspipetter overføres 5 μL enzymløsninger fra den koniskbunnede platen til analyseløsningene i den svarte 96-brønns halvarealplaten. Denne prosessen gjør det mulig å starte en rekke analyser samtidig. Alternativt, med et annet analyseplateoppsett, kan enzymløsninger plasseres i reagensreservoarer, og deretter kan flerkanalspipetter brukes til å legge til enzym i analyseløsningene. Denne tilnærmingen vil imidlertid kreve større mengder enzymløsning på grunn av væskegjenvinningsavfall i reservoarene. Vi utfører analysene i 96-brønns halvarealplater; den mindre brønnstørrelsen i disse platene tillater et mindre totalt analysevolum (100 μL) enn tradisjonelle 96-brønnsplater, noe som igjen sparer reagenskostnader.

DNA-metyleringsanalysen beskrevet her krever et hemimetylert substrat-DNA på grunn av spesifisiteten til koblingsendonukleasen Gla I. Dette gjør analysen spesielt god for å undersøke aktiviteten til DNMT1, da dette isozymet fortrinnsvis metylerer hemimetylert DNA1. DNMT3-isoenzymene viser ikke en preferanse mellom ikke-metylert og hemimetylert DNA1. Dermed kan denne analysen også brukes til å undersøke aktiviteten til DNMT3-isozymene. Faktisk har hemming av DNMT3a av små molekyler blitt vurdert ved hjelp av denne analysen26,27,41. Kravet om et hemimetylert substrat-DNA betyr at denne analysen ikke kan brukes til å undersøke substratspesifisitet eller preferanse mellom ikke-metylerte og hemimetylerte CpG-steder.

Denne analysen er avhengig av et spektroskopisk signal: økningen i fluorescens når fluoroforen og slukkeren separeres. Dermed kan små molekyler som selv fluorescerer eller slukker fluorescens forstyrre analysen. En grunn til å utføre den Gla I-holdige kontrollen for hver analysebetingelse er å se etter denne muligheten. De spektroskopiske egenskapene til det lille molekylet kan forklares ganske enkelt ved å bruke Gla I-kontrolldataene (f.eks. Hvis molekylet har et svakt fluorescenssignal). Men hvis molekylet er sterkt fluorescerende eller en sterk slukker, kan denne analysen ikke brukes til å oppdage DNA-metyleringsaktivitet.

Skjermen beskrevet her er en første analyse for å oppdage potensielle DNMT-hemmere. Forbindelser som er "treff" i startskjermbildet må valideres i sekundære analyser for å sikre at de er sanne DNMT-hemmere. Fordi denne analysen er en koblet kinetikkanalyse, betyr det ikke nødvendigvis at forbindelsen hemmer metyltransferasen bare ved å observere en reduksjon i fluorescensgenerering i nærvær av et bestemt lite molekyl. Et lite molekyl som er i stand til å hemme koblingsenzymet Gla I, vil også resultere i en observert reduksjon i fluorescensgenerering. En enkel sekundær skjerm innebærer å bestemme aktiviteten til Gla I i nærvær og fravær av potensielle hemmere. For denne analysen brukes det fullt metylerte internt slukkede hårnåls-DNA som substrat26,41. Ytterligere analyser designet for å undersøke aggregeringsavhengig inhibering og DNA-interkalering kan også brukes som sekundære analyser for ytterligere å validere potensielle hemmere26,41. I dataene som presenteres her, ble forbindelse 1 og forbindelse 2 identifisert som potensielle DNMT1-hemmere. Ved hjelp av en rekke sekundære analyser har forbindelse 1 blitt validert som en direkte hemmer av DNMT141. Dette tidligere publiserte arbeidet viste at forbindelser som inneholder store substituenter ved C2-posisjonen til antrakinonkjernen syntes å være mer effektive hemmere av DNMT1. Imidlertid er det behov for flere studier for å forstå de strukturelle determinantene for DNMT1-hemming fullt ut.

Den koblede analysen beskrevet her har flere potensielle bruksområder. Analysen kan brukes til steady-state kinetikkeksperimenter. Fordi analysen er kontinuerlig, er det enkelt å bestemme innledende hastigheter. Denne analysen har tidligere blitt brukt til å undersøke makroskopiske kinetikkparametere (dvs. Km, Vmax og kcat) av forskjellige avkortede DNMT1-proteiner40. Analysen har blitt brukt til å undersøke et lite sett med molekyler for DNMT1-hemming 41 og vurdere isozymespesifisitet av identifiserte hemmere ved å undersøke deres innvirkning på DNMT3a-aktivitet26,27,41. Analysen har også blitt brukt til å karakterisere inhibitorer. Mekanismen for hemming og potens (f.eks. Ki, IC50) for både hemmende proteindomener36,40 og nye små molekyler 27,41 er bestemt ved hjelp av denne koblede kinetikkanalysen. Analysen er også tilpasset for bruk i en HTS-kampanje. I dette tilfellet ble analysen miniatyrisert videre til et 384-brønnformat og brukt som en endepunktanalyse for startskjermbildet26. Således er den fluorescensbaserte endonukleasekoblede DNA-metyleringsanalysen beskrevet her en allsidig analyse som kan brukes til å undersøke aktiviteten til DNA-metyltransferaser og muliggjør identifisering og karakterisering av små molekylhemmere av disse viktige epigenetiske modifikatorene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Forfatterne takker Bucknell University og Institutt for kjemi for deres støtte til dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates ThermoFisher 249570
Bovine Serum Albumin NEB B9000S
compound 1 ChemBridge 5812086 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2 ChemBridge 6722175 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3 ChemBridge 5249376 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol Sigma D0632
Gla I SibEnzyme E494 methyl-sensitive endonuclease
Glycerol RPI G22025
Magnesium Chloride Sigma M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) IDT custom synthesized internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate Sigma G1501
S-adenosylmethionine Sigma A4377 methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base RPI T60040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).

Tags

Biokjemi utgave 186 biokjemi utgave ,
Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Switzer, R., Ward, K. A., Medrano,… More

Switzer, R., Ward, K. A., Medrano, J. Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (186), e62949, doi:10.3791/62949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter