Summary
Ubiquitinatie is een kritisch eiwit posttranslationele modificatie, waarvan ontregeling is betrokken bij tal van menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft hoe faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe ubiquitinevarianten te isoleren die de activiteit van E3-ligases kunnen binden en moduleren die de specificiteit, efficiëntie en patronen van ubiquitinatie regelen.
Abstract
Ubiquitine is een klein 8,6 kDa-eiwit dat een kerncomponent is van het ubiquitine-proteasoomsysteem. Bijgevolg kan het binden aan een breed scala aan eiwitten met een hoge specificiteit maar een lage affiniteit. Door middel van faagweergave kunnen ubiquitinevarianten (UbV's) zo worden ontworpen dat ze een verbeterde affiniteit vertonen ten opzichte van wildtype ubiquitine en bindingsspecificiteit behouden voor doeleiwitten. Faagweergave maakt gebruik van een faagmid-bibliotheek, waarbij het pIII-coatingeiwit van een filamenteuze M13-bacteriofaag (gekozen omdat het extern op het faagoppervlak wordt weergegeven) wordt gefuseerd met UbV's. Specifieke residuen van menselijk wildtype ubiquitine zijn zacht en gerandomiseerd (d.w.z. er is een voorkeur voor inheemse wildtypesequentie) om UbV's te genereren, zodat schadelijke veranderingen in eiwitconformatie worden vermeden en tegelijkertijd de diversiteit wordt geïntroduceerd die nodig is voor het bevorderen van nieuwe interacties met het doeleiwit. Tijdens het faagweergaveproces worden deze UbV's tot expressie gebracht en weergegeven op faaglaageiwitten en gepaneerd tegen een eiwit van belang. UUBV's die gunstige bindingsinteracties met het doeleiwit vertonen, worden behouden, terwijl slechte bindmiddelen worden weggespoeld en uit de bibliotheekpool worden verwijderd. De bewaarde UbV's, die zijn bevestigd aan het faagdeeltje dat de overeenkomstige faagmide van de UbV bevat, worden geëlueerd, versterkt en geconcentreerd, zodat ze in een andere faagronde tegen hetzelfde doeleiwit kunnen worden gepaneerd. Doorgaans worden maximaal vijf faagrondes uitgevoerd, waarbij een sterke selectiedruk wordt opgelegd aan UbV's die zwak en/of promiscue binden, zodat degenen met hogere affiniteiten geconcentreerd en verrijkt zijn. Uiteindelijk worden UbV's die een hogere specificiteit en /of affiniteit voor het doeleiwit aantonen dan hun wildtype-tegenhangers geïsoleerd en kunnen ze worden gekarakteriseerd door verdere experimenten.
Introduction
Het begrijpen van de moleculaire details van eiwit-eiwitinteracties is van cruciaal belang voor het afbakenen van de signaaltransductiemechanismen van biologische processen, met name die welke bijdragen aan klinisch belangrijke ziekten. In de afgelopen jaren is faagweergave gebruikt als een praktische en toegankelijke methode om eiwitten / peptiden te isoleren met een sterk verbeterde binding aan een gewenst doeleiwit1,2,3,4, dat op zijn beurt kan worden gebruikt als intracellulaire sondes van eiwit-eiwitinteracties.
Ubiquitinatie is een cascade van enzymatische activiteiten (E1 activerend enzym → E2-conjugaterend enzym → E3-ligases) die ubiquitine (Ub) covalent conjugeren aan eiwitsubstraten om ze te richten op afbraak of om celsignaleringsveranderingen te bemiddelen. Bovendien katalyseren deubiquitinasen de verwijdering van ubiquitine uit eiwitten. Daarom zijn er in cellen duizenden Ub-afhankelijke eiwit-eiwitinteracties, waarvan de overgrote meerderheid een gemeenschappelijk oppervlak herkent met een lage affiniteit maar hoge specificiteit om zwakke interacties door grote en diverse oppervlakken mogelijk te maken.
Ernst et al. introduceerden mutaties in bekende bindingsgebieden van Ub om te zien of ze de bindingsaffiniteit voor een interessant eiwit konden verbeteren met behoud van een hoge selectiviteit5. Een combinatorische bibliotheek van meer dan 10 miljard (7,5 x 1010) Ub-varianten (UbV's) met mutaties op posities over het Ub-oppervlak die de bekende Ub-eiwitinteracties bemiddelen, werd ontwikkeld. Deze bibliotheek bestond uit faagmiden die het M13 bacteriofaag pIII-vachteiwit tot expressie brengen, gefuseerd met gediversifieerde UbV's. Daarom kunnen individuele UbV's bij expressie via het vachteiwit op het faagoppervlak worden weergegeven. Tijdens het selectieproces worden fagen met UbV's met aanzienlijke bindingsinteracties met het doeleiwit behouden en verrijkt in volgende faagrondes, terwijl faag met UbV's die slecht binden aan het doeleiwit worden weggespoeld en uit de faagpool worden verwijderd. De vastgehouden faagdeeltjes bevatten het faagmide dat overeenkomt met hun weergegeven UbV, waardoor ze kunnen worden gesequenced en verder kunnen worden gekarakteriseerd zodra ze zijn geïsoleerd.
Met behulp van deze eiwittechnologiestrategie werden UbV-remmers ontwikkeld voor menselijke deubiquitinasen5 en virale proteasen6. Belangrijk is dat we remmende UbV's hebben gegenereerd voor menselijke HECT-familie E3-ligases door de E2-bindingsplaats te kapen en UbV's te activeren die een Ub-bindende exosiet op het HECT-domein bezetten7. We kunnen ook monomere RING-familie E3's remmen door ons te richten op de E2-bindingsplaats en UbV-dimerisatie induceren om homodimere RING E3s8 te activeren. Voor ring-E3's met meerdere subeenheden kunnen UbV's remming bereiken door zich te richten op de RING-subeenheid (bijvoorbeeld voor APC / C-complex9) of complexe vorming te verstoren (bijvoorbeeld voor SCF E3s10). Gezamenlijk kunnen UbV's worden gebruikt om systematisch eiwit-eiwitinteracties in het Ub-proteasoomsysteem (UPS) te ondervragen, zodat we biochemische mechanismen van UPS-enzymen beter kunnen ontcijferen en functionele locaties voor therapeutische interventie kunnen identificeren en valideren.
Het volgende protocol beschrijft hoe een eerder gegenereerde faag weergegeven UbV-bibliotheek kan worden gebruikt om een eiwit van belang te targeten en hoe de UbV-bindmiddelen die interageren met het doeleiwit kunnen worden verrijkt door middel van opeenvolgende faagweergaverondes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagensvoorbereiding
- PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing): Meng 50 ml 10x PBS-oplossing met 450 ml ultrapuur H2O. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C of kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
- 10% BSA (runderserumalbumine): Voeg langzaam 1 g BSA toe aan 7 ml ultrapuur H2O en meng tot het volledig is opgelost (geen klonten). Vul aan met ultrapuur H2O totdat het uiteindelijke volume 10 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
- PB-buffer (PBS aangevuld met 1% BSA): Voeg langzaam 5 g BSA toe aan 400 ml ultrapuur H2O en 50 ml PBS en meng tot het volledig is opgelost (geen klonten). Vul aan met ultrapuur H2O totdat het uiteindelijke volume 500 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
- PBT-buffer (PBS aangevuld met 1% BSA en 0,05% Tween 20): Voeg langzaam 5 g BSA toe aan 400 ml ultrapuur H2O en 50 ml PBS en meng totdat het volledig is opgelost (geen klonten). Voeg 250 μL Tween 20 toe. Vul aan met ultrapuur H2O totdat het uiteindelijke volume 500 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
- PT-buffer (PBS aangevuld met 0,05% Tween 20): Meng 1 ml Tween 20 met 400 ml PBS. Vul aan met ultrapuur H2O tot het uiteindelijke volume 2 L is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C of kamertemperatuur (~20-25 °C).
- 2YT bouillon: Voeg 16 g trypton, 10 g gistextract en 5 g NaCl toe aan 800 ml ultrapuur H2O en meng tot het volledig is opgelost (geen klonten). Vul aan met ultrapuur H2O tot het uiteindelijke volume 1 L is. Steriliseer door autoclaveren en bewaar bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
- LB/carb-platen: Voeg 12,5 g vooraf gemaakt LB-mengsel en 7,5 g agar toe aan 400 ml H2O. Vul aan met ultrapuur H2O tot het uiteindelijke volume 500 ml is en steriliseer door autoclaveren. Zorg ervoor dat agar volledig is opgelost en wacht tot het is afgekoeld tot onder de 60 °C. Voeg 500 μL 100 mg ml carbenicilline toe, meng goed en giet op het bord. Bewaren bij 4 °C.
- LB/tet-platen: voeg 12,5 g vooraf gemaakt LB-mengsel en 7,5 g agar toe aan 400 ml ultrapuur H2O. Vul aan met ultrapuur H2O tot het uiteindelijke volume 500 ml is en steriliseer door autoclaveren. Zorg ervoor dat agar volledig is opgelost en wacht tot het is afgekoeld tot onder de 60 °C. Voeg 500 μL tetracycline van 10 mg ml toe, meng goed en giet op het bord. Bewaren bij 4 °C.
- 20% PEG (polyethyleenglycol)/2,5 M NaCl: Voeg 50 g PEG-8000 en 36,5 g NaCl toe aan 200 ml ultrapuur H2O. Meng tot het volledig is opgelost.
OPMERKING: Dit kan een tijdje duren; verwarming kan helpen. Vul aan met ultrapuur H2O totdat het uiteindelijke volume 250 ml is. Steriliseren door filtratie of autoclaveren. - 0,1 M HCl: Meng 20 ml van 1 M HCl met 180 ml ultrapuur H2O. Steriliseer door filtratie en bewaar bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
- 1 M Tris (pH 11,0): Voeg 6,1 g Tris-basis toe aan 40 ml ultrapuur H2O. Stel de pH in op 11,0 met HCl en meng tot Tris volledig is opgelost. Vul aan met ultrapuur H2O totdat het uiteindelijke volume 50 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
- 100 mg/ml (1000x) carbenicilline: voeg 2 g van het carbenicilline dinatriumzout toe aan 20 ml ultrapuur H2O. Meng tot het volledig is opgelost. Steriliseer door filtratie en bewaar bij -20 °C.
- 50 mg /ml (1000x) kanamycine: Voeg 1 g kanamycinesulfaat toe aan 20 ml ultrapuur H2O. Meng tot het volledig is opgelost. Steriliseer door filtratie en bewaar bij -20 °C.
- 10 mg/ml (1000x) tetracycline: voeg 0,2 g tetracyclinehydrochloride toe aan 20 ml 70% ethanol. Meng tot het volledig is opgelost. Steriliseer door filtratie en bewaar bij -20 °C.
2. Eiwitbereiding
- Bepaal de concentratie van de doeleiwitvoorraad in μM. De handigste manier om de eiwitconcentratie te beoordelen is het meten van de absorptie van de eiwitvoorraad bij 280 nm. Als de concentratie bekend is in mg/ml, zet deze dan om in μM met behulp van het molecuulgewicht van het doeleiwit. Een reeks methoden kan worden gebruikt, afhankelijk van het eiwit van belang; zie het gedeelte Discussie voor meer informatie.
OPMERKING: Als het eiwit is afgekapt (specifiek eiwitdomein/motief) of is gelabeld, vergeet dan niet om rekening te houden met deze veranderingen in molecuulgewicht bij het omzetten van mg / ml naar μM. - Bereid drie microcentrifugebuizen voor met het label "ronde 1", "ronde 2/3" en "ronde 4/5".
- Bereken het eiwitvolume dat nodig is om het te verdunnen tot 1 μM in 800 μL PBS en aliquoteer dit volume in de buizen zonder PBS toe te voegen.
OPMERKING: Als de beschikbare hoeveelheid doeleiwit laag is, kan de concentratie worden verlaagd tot slechts 0,25 μM.
- Bereken het eiwitvolume dat nodig is om het te verdunnen tot 1 μM in 800 μL PBS en aliquoteer dit volume in de buizen zonder PBS toe te voegen.
3. Voorbereiding op selectieronde
- Bereid een zaadcultuur voor voor het kweken van de faaginvoer voor ronde twee van selectie.
- Ent 5 ml 2YT/tet met een goed geïsoleerde Escherichia coli-kolonie en incubeer 's nachts bij 37 °C met 200 tpm orbitaal schudden.
- Coat de plaat voor de eerste selectieronde.
- Verdun het doeleiwit in de "ronde 1" buis met de juiste hoeveelheid PBS en aliquot 100 μL in acht putjes van een 96-putbindingsplaat (d.w.z. de doelplaat).
OPMERKING: Faagweergave kan worden gedaan voor vier verschillende eiwitten tegelijkertijd op een enkele plaat door de putten in de hoeken van de plaat te coaten. - Optionele controle: Als het doeleiwit is gelabeld, zoals met GST of MBP (maltosebindend eiwit), bedekt u acht putjes in een andere 96-putbindingsplaat met 100 μL van een 1 μM-oplossing met het juiste epitooplabel. Dit wordt gebruikt om ongewenste fagen te verwijderen die niet-specifiek aan de tag binden.
- Schud plaat(en) 's nachts bij 4 °C met 200 rpm orbitaal schudden.
- Verdun het doeleiwit in de "ronde 1" buis met de juiste hoeveelheid PBS en aliquot 100 μL in acht putjes van een 96-putbindingsplaat (d.w.z. de doelplaat).
4. Rond een van de selectie af
- Bereid de ronde twee input voor.
- Ent 30 ml 2YT/tet met 200 μL van de zaadkweek vanaf stap 3.1.
- Incubeer bij 37 °C met 200 tpm orbitaal schudden totdat de bacteriën zich in de middenlogfase bevinden (OD600
0,6 - 0,8). Dit duurt ongeveer drie uur.
- Blokkeer doelplaat.
- Verwijder de coatingoplossing van de plaat, of beide platen als er een controleplaat is gemaakt, door om te keren en te schudden over een gootsteen. Dep droog op keukenpapier.
- Voeg 300 μL PB-buffer toe aan elke gecoate put.
- Verwijder de PB-buffer zoals in stap 4.2.1 en voeg nog eens 200 μL PB-buffer toe.
- Incubeer bij kamertemperatuur (~ 20-25 ° C) gedurende 1 uur met 300 tpm orbitaal schudden.
- Faagbibliotheek voorbereiden.
- Ontdooi de faagbibliotheek op ijs en verdun deze tot 100x de bibliotheekdiversiteit in PBS. Als de bibliotheekdiversiteit bijvoorbeeld 1 x 1010 is en de bibliotheekconcentratie 1 x 1013, verdunt u de bibliotheek zodat de concentratie 1 x 1012 is. Voor de bibliotheken die hier worden gebruikt, verdunt u ze 10-voudig in PBS door 1 ml van de bibliotheek te combineren met 9 ml PBS.
OPMERKING: De diversiteit van bibliotheken had tijdens het maken van de bibliotheek moeten worden bepaald en kan niet gemakkelijk anders worden beoordeeld. De bibliotheekconcentratie kan worden bepaald door E. coli-cellen in de mid-logfase (OD600 0,6 - 0,8) te enten op LB /carb. - Voeg 1/5 volume PEG/NaCl toe. Voeg bijvoorbeeld voor 10 ml van de eerder verdunde bibliotheek 2 ml PEG/NaCl toe.
- Incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C, gooi supernatant weg encentrifugeer gedurende 2 minuten om het resterende supernatant naar beneden te trekken.
OPMERKING: Plaats de buis de tweede keer in dezelfde richting in de rotor als de eerste keer om de pellet op dezelfde plaats te houden, waardoor deze gemakkelijker te zien is. - Resuspend de faagkorrel voorzichtig in 1 ml PBT per eiwit. Voor vier eiwitten, resuspend de pellet in 4 ml PBT.
OPMERKING: Probeer de pellet niet aan te raken en introduceer geen luchtbellen.
- Ontdooi de faagbibliotheek op ijs en verdun deze tot 100x de bibliotheekdiversiteit in PBS. Als de bibliotheekdiversiteit bijvoorbeeld 1 x 1010 is en de bibliotheekconcentratie 1 x 1013, verdunt u de bibliotheek zodat de concentratie 1 x 1012 is. Voor de bibliotheken die hier worden gebruikt, verdunt u ze 10-voudig in PBS door 1 ml van de bibliotheek te combineren met 9 ml PBS.
- Geef faag weer aan de doeleiwit(en).
- Optionele controle: Voeg 100 μL faagbibliotheek toe aan elke gecoate put in de controleplaat. Incubeer bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C) gedurende 1 uur met 300 tpm orbitaal schudden en breng de bibliotheek over van de bedieningsplaat naar de doelplaat. Sla stap 4.4.2 over.
- Verwijder de PB-buffer van de doelplaat zoals in stap 4.2.1 en voeg 100 μL van de faagbibliotheek toe aan elke gecoate put.
- Incubeer bij kamertemperatuur (~ 20-25 ° C) gedurende 1 uur met 300 tpm orbitaal schudden.
- Elute ronde één faag.
- Verwijder de faagbibliotheek en was de gecoate putjes vier keer met PT-buffer. Keer de plaat om en tik op een papieren handdoek om de laatste druppels te verwijderen.
OPMERKING: Als meerdere doeleiwitten op één plaat zijn gecoat, probeer dan de stroom van alle volgende oplossingen tussen de putten te minimaliseren. - Voeg 100 μL van 0,1 M HCl toe aan elke gecoate put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met 300 rpm orbitaal schudden.
- Neutraliseer de pH door 12,5 μL van 1 M Tris-HCl (pH 11) toe te voegen aan elke gecoate put.
- Bundel de geëlueerde faag uit alle 8 putten in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pipetteer op en neer tijdens de overdracht om oplossingen homogeen te maken en alle vloeistof uit de putten op te zuigen.
- Voeg 10% BSA toe aan de gepoolde geëlueerde faag tot een eindconcentratie van 1%. Voeg voor een typisch oplossingsvolume van 950 μL 95 μL 10% BSA toe. Bewaren bij 4 °C. Dit is de ronde één uitgang.
- Verwijder de faagbibliotheek en was de gecoate putjes vier keer met PT-buffer. Keer de plaat om en tik op een papieren handdoek om de laatste druppels te verwijderen.
0,6 - 0,8). Dit duurt ongeveer drie uur.5. Voorbereiding op volgende selectierondes
- Bereid een zaadkweek voor op het kweken van de faaginvoer voor de volgende selectieronde zoals in stap 3.1.
- Bekleed de plaat voor de derde selectieronde zoals in stap 3.2 met de onderstaande wijzigingen.
- Bestrijk slechts vier putjes per eiwit in een 96-putbindingsplaat. Gebruik de helft van de inhoud van de "ronde 2/3" of "ronde 4/5" buizen voor de juiste ronde. Verdun de inhoud van deze buisjes indien nodig om te voorkomen dat eiwitten uit de oplossing bezinken.
- Bereid de faaginvoer voor op de volgende selectieronde.
- Gebruik de helft van de round one-uitgang uit stap 4.5.5 om 3 ml mid-log fasecellen uit stap 4.1 te enten. Voor een typische ronde uitgang, ent u met 500 μL van de uitgang.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met 200 rpm orbitaal schudden.
- Voeg M13K07 helperfaag toe aan een eindconcentratie van 1 x 1010 PFU/ml.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur met 200 tpm orbitaal schudden.
- Breng de volledige 3 ml cultuur over op 30 ml 2YT /carb / kan. Groei 's nachts bij 37 °C met 200 rpm orbitaal schudden.
- Breng de volgende dag de cultuur over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 11.000 x g om cellen neer te slaan.
- Decanteer het supernatant in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml en meng met 8 ml PEG/NaCl en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en centrifugeer opnieuw gedurende 2 minuten.
OPMERKING: Plaats de buis de tweede keer in dezelfde richting in de rotor als de eerste keer om de pellet op dezelfde plaats te houden, waardoor deze gemakkelijker te zien is. - Resuspend de faagkorrel in 800 μL PBT zodat deze volledig homogeen is en er geen klonten zichtbaar zijn.
- Breng de faagoplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 4 minuten bij 4 °C bij 16.200 x g op pelletresten.
- Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis. Dit is de input voor de volgende selectieronde.
- Optioneel: Titer de input en output oplossingen.
- Gebruik 500 μL van een E. coli-zaadkweek om 5 ml 2YT/tet te enten en incubate bij 37 °C met 200 rpm orbitaal schudden totdat bacteriën zich in de middenlogfase bevinden (OD600 0,6 - 0,8). Dit duurt ongeveer 1 uur.
- Verdun faag input/output oplossingen tot 10-3 - 10-5 in PBS en voeg 10 μL van elke verdunning toe aan 90 μL gekweekte cellen.
OPMERKING: Gebruik verdunde faagoplossingen onmiddellijk omdat faag na verloop van tijd aan de buis zal adsorberen en transformaties vals negatieven kunnen produceren. - Incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten met 200 tpm orbitaal schudden.
- Plaat 5 μL op aparte LB/carb platen.
OPMERKING: De hoeveelheid is variabel, afhankelijk van eerdere resultaten/persoonlijke voorkeur.
- Gebruik 500 μL van een E. coli-zaadkweek om 5 ml 2YT/tet te enten en incubate bij 37 °C met 200 rpm orbitaal schudden totdat bacteriën zich in de middenlogfase bevinden (OD600
6. Volgende selectierondes
- Voer alle volgende rondes uit samen met de voorbereiding zoals gedaan in respectievelijk stap 3 en 4, met onderstaande verschillen.
- Gebruik de input die in de vorige ronde is geproduceerd als faagbron in plaats van een bibliotheek. Bestrijk 4 putjes per doeleiwit met 100 μL van de faaginput verkregen uit de vorige ronde. Bewaar de resterende faagingangen bij 4 °C.
- Maak de wasstap in 4.5.1 strenger bij elke selectieronde. Ronde één vereist 4 keer wassen, ronde twee vereist 6 keer, ronde drie vereist 8 keer en ronde vier en vijf vereisen beide 10 keer wassen.
- Verminder sommige volumes in vergelijking met die in ronde één, omdat volgende rondes slechts vier putten bedekken in plaats van acht. In stap 4.5.5 wordt bijvoorbeeld slechts 45 μL van 10% BSA aan de faaguitgang toegevoegd en in stap 5.3.1 wordt slechts 250 μL van de faaguitgang gebruikt om cellen te enten.
7. Naselectieverwerking en faagisolatie
- Titer de input- en outputoplossingen voor ronde vier en vijf.
- Als dit nog niet is gedaan in stap 5.4, volgt u dezelfde stappen om rondes vier en vijf faaguitgangen te titeren, idealiter produceert u een bereik van 30-300 kolonies over een paar platen.
- Kweek en isoleer faag.
- Aliquot 450 μL 2YT/carb/M13K07 in elke buis van een 96 mini tube kweekdoos.
- Kies goed geïsoleerde kolonies van een van de platen uit stap 7.1 om elke buis te inenten.
OPMERKING: Gebruik de bovenste helft van de doos voor ronde vier uitgangen en de onderste helft voor ronde vijf uitgangen. - Incubeer 's nachts bij 37 °C met 200 tpm orbitaal schudden.
- Centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Breng zoveel mogelijk supernatant over naar een nieuwe 96 mini tube kweekdoos zonder de celkorrel te storen en gooi de oude weg. Bewaren bij 4 °C.
- Breng vanuit de nieuwe doos 100 μL van elke buis over naar een 96 put niet-bindende plaat met 100 μL 50% glycerol in alle putten. Meng goed en bewaar bij -80 °C als reservevoorraad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bindmiddelen geproduceerd uit faagweergave kunnen op vele manieren worden geverifieerd en geanalyseerd. Het wordt aanbevolen om eerst over te gaan tot het sequencen van de faag met primers die de gediversifieerde insert in de faagmidbibliotheek flankeren. Een ideaal faagweergave-experiment zal een duidelijke voorkeur voor verschillende sequenties laten zien (figuur 1). Andere sequenties zullen ook aanwezig zijn, maar met een lagere telling, die meer als achtergrondgeluid verschijnen. In het gegeven voorbeeld, waar faagweergave werd uitgevoerd tussen ubiquitinevarianten (UbV's) en wildtype UBE4B, is er een bepaalde voorkeur voor sequenties # 1-4. Een voorbeeld python script voor het organiseren en analyseren van sequencing bestanden is verstrekt ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). Om het belang van de bindmiddelen te bevestigen, kunnen enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) worden gebruikt als een snelle maat voor relatieve bindingsaffiniteit aan het wildtype doeleiwit, gemuteerd doeleiwit en off-target eiwitten (figuur 1). Verschillen in bindingsaffiniteiten tussen de nieuwe bindmiddelen en het wildtype bindingseiwit, waarop de nieuwe bindmiddelen waren gebaseerd, kunnen worden bepaald door de ELISA-absorptie van de bindmiddelen te normaliseren ten opzichte van die van het wildtype-eiwit (niet getoond) of andere eiwitten die geen merkbare binding met het doeleiwit vertonen (figuur 1). Dit voorbeeld toont de neiging van de verrijkte sequenties om een hogere bindingsaffiniteit voor het doeleiwit te hebben. Een voorbeeld python script voor het organiseren en analyseren van sequencing bestanden is verstrekt ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Daarnaast is een voorbeeld python script specifiek voor het analyseren van UbV resultaten verstrekt ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Idealiter zullen bindmiddelsequenties die talrijker zijn een hogere relatieve bindingsaffiniteit bezitten dan minder talrijke sequenties, die vermoedelijk achtergrondruis zijn. Het is mogelijk dat onstabiele bindmiddelen laag in aantal zijn, maar een merkbare binding vertonen via ELISA's. Deze bindmiddelen moeten verder worden onderzocht om te bepalen of de ELISA-scores artefacten zijn of dat het inderdaad bindmiddelen zijn die verdere karakterisering waard zijn.
Figuur 1: Representatieve resultaten voor een selectie van een ubiquitinevariant (UbV) tegen UBE4B. (A) UbV's werden geordend van de hoogste naar de laagste frequentie (tellingen). Sequenties vertegenwoordigen het gediversifieerde ubiquitinegebied in de UbV met alle gerandomiseerde residuen (met name residuen 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 en 70-78). Alle ELISA-absorpties werden genormaliseerd tegen 96 gemiddelde BSA ELISA-scores en 96 gemiddelde GST ELISA-scores. Donkerder groen staat voor een sterkere relatieve binding. GST werd opgenomen als een controle voor niet-specifieke binding vanwege het feit dat het doeleiwit GST-gelabeld is. (B) Grafische samenvatting van de ELISA-resultaten van paneel A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Voorgestelde volgorde van stappen voor het uitvoeren van faagweergave. Stippellijnen geven processen aan die worden overgedragen naar de volgende dag of van de vorige dag. Alle volgende rondes na ronde drie verlopen op dezelfde manier als ronde drie, met uitzondering van ronde vijf waar geen faaginvoervoorbereiding nodig is, tenzij er meer rondes worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Voorgestelde labware en labels voor het opzetten van een faagweergave-experiment. Doel en relevante stappen in het protocol worden aangegeven. R: rond; I: input; O: uitgang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Verschijningen van typische pellets die worden aangetroffen tijdens de faagweergaveprocedure. De faagbibliotheekkorrel presenteert zich als een streep langs de zijkant van de buis en kan opnieuw worden gecentrifugeerd om de pellet in de bodem van de buis te concentreren. Faaginvoerpellets en puinkorrels lijken meer typerend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Python-scripts. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals vermeld in stap 2.1 (eiwitpreparaat), kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de eiwitconcentratie te beoordelen, en elk zal unieke voor- en nadelen hebben op basis van het specifieke doeleiwit dat wordt gebruikt voor faagweergave. Een bron van gedetailleerde beschrijvingen en protocollen voor populaire methoden is eerder verstrekt11.
Het gebruik van de faag die door een vorige faagronde wordt vastgehouden als input voor een volgende ronde verrijkt de goede bindmiddelen door geleidelijk bindmiddelen te verwijderen die zwak, voorbijgaand of toevallig gebonden zijn. Tegen ronde vier en vijf zal er idealiter een duidelijke voorkeur zijn voor een kleine en specifieke set peptidesequenties, die bindingsvoorkeuren van het doeleiwit aantonen.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met een UbV-bibliotheek. Hoewel deze stappen over het algemeen van toepassing kunnen zijn op andere soorten bibliotheken (bijv. Peptide, antilichaam, enz.), Zullen ze waarschijnlijk moeten worden aangepast om dergelijke niet-UbV-bibliotheken te accommoderen. Zoals vermeld in stap 4.3.1, moeten de diversiteit en concentratie van de bibliotheek bekend zijn voordat met faagweergave wordt overgegaan. Voor meer informatie over hoe deze bibliotheekkenmerken worden bepaald, raadpleegt u het protocol dat wordt gebruikt om de UbV-bibliotheken te maken die in deze procedure worden gebruikt12.
De faagweergaveresultaten kunnen zeer duidelijk zijn en voor de hand liggende kandidaat-bindmiddelen presenteren om verdere karakterisering na te streven. Bindmiddelen die zowel zeer frequent zijn als een significant hogere binding hebben, zoals gemeten door ELISA, zijn bijvoorbeeld duidelijke kandidaten voor verder onderzoek. Wanneer de frequentie van een bepaald bindmiddel echter niet positief correleert met de ELISA-gegevens, kan dit enige verwarring opleveren over hoe interessante bindmiddelen kunnen worden geselecteerd. In het gegeven voorbeeld (figuur 1) wordt aanbevolen om een combinatie te kiezen van de meest voorkomende bindmiddelen, zelfs als ze een lage bindingsaffiniteit hebben, en die met een hogere bindingsaffiniteit, zelfs als ze niet vaak voorkomen. Zeldzame bindmiddelen met hoge ELISA-scores komen mogelijk niet zo vaak voor als gevolg van instabiliteit tijdens faagweergave, wat hun prevalentie in deze definitieve gegevens negatief zou beïnvloeden. Als zodanig zijn deze het onderzoeken waard, net zoals de zeer frequente bindmiddelen dat zijn.
Geïsoleerde faagoplossingen kunnen gemakkelijk worden verontreinigd. Het wordt aanbevolen om zo snel mogelijk door te gaan met DNA-sequencing met behulp van primers die het gebied van het gediversifieerde peptide flankeren. Een andere typische post-display analyse is het uitvoeren van ELISA's van de bindmiddelen met hun doeleiwit. Bovendien kunnen ELISA's worden uitgevoerd met de bindmiddelen en gemuteerde / afgeknotte versies van hun doeleiwitten, die een ruw idee kunnen geven van hun waarschijnlijke bindingsmodus. Het is erg belangrijk op te merken dat faagoplossingen goed moeten worden gemengd voordat ze in een experiment worden gebruikt als ze al een tijdje zitten. De faag kan adsorberen aan de wanden van de buis of uit de oplossing bezinken en kan vals negatieven produceren.
De meest tijdsefficiënte manier om deze procedure uit te voeren wordt geïllustreerd in figuur 2. Begin elke ronde met het voorbereiden van de bacteriecultuur die nodig is voor het kweken van de faaginvoer voor de volgende ronde de volgende dag. Terwijl deze cultuur groeit, kunnen gecoate platen worden geblokkeerd. Terwijl de platen worden geblokkeerd, kan de bibliotheek worden voorbereid (voor ronde één) of kan de faaginvoer worden voorbereid (voor volgende rondes). Op de dag van ronde vier is het niet nodig om een zaadkweek voor te bereiden en dus is het op de dag van ronde vijf niet nodig om voorbereidingen te treffen voor de faaginput van de volgende ronde, tenzij men van plan is om meer dan vijf selectierondes te doen. Om de tijd verder te besparen, is er ook een voorgestelde labware-opstelling beschikbaar (figuur 3). Bovendien zijn faagpellets niet altijd verschillend, dus zijn foto's van typische pelletuitstralingen die tijdens deze procedure worden aangetroffen, verstrekt (figuur 4).
Als er problemen zijn met het pelleteren van de faag tijdens de voorbereiding van de input voor een volgende ronde, moet het experiment mogelijk een dag worden stilgelegd terwijl nieuwe fagen worden gekweekt. Deze kunnen worden teruggewonnen door terug te gaan naar de faag die in de buizen is opgeslagen voor de invoer voor die ronde. Als de faag die nodig is voor de derde weergaveronde bijvoorbeeld om de een of andere reden niet kan worden gepelletiseerd, kunt u terugkeren naar de "R3I" -buis die 400 μL faaginvoer bevat voor ronde drie. Dit kan slechts één keer worden herhaald als vier putten met 100 μL worden bedekt.
De titer van de output faag voor rondes vier tot vijf ligt meestal in het bereik van 106 tot 108 PFU / ml. Als titeren niet van belang is, zou het simpelweg aanwezig hebben van voldoende kolonies om een minikweekdoos met 96 buizen te vullen voldoende moeten zijn om een nauwkeurige weergave van de faagdiversiteit en titer te bieden, maakt niet noodzakelijkerwijs uit. Als de titer van de uitgangsfaag echter laag is en meer kolonies gewenst zijn, kan faag opnieuw worden vereenvoudigd door stap 5.3 te herhalen. In wezen kan de faag opnieuw worden vereenvoudigd door de output voor de gewenste selectieronde te nemen, cellen in de middenlogfase te inenten, helpersfaag en carbenicilline toe te voegen, de cultuur 's nachts te laten groeien en de faag te oogsten via PEG-neerslag zoals eerder beschreven.
Er bestaan andere weergavemethoden en elk heeft zijn eigen voor- en nadelen ten opzichte van faagweergave. In vivo weergavemethoden, zoals weergave van het celoppervlak, kunnen de kans op een goede eiwitvouwing vergroten en ook posttranslationele wijzigingen mogelijk maken; deze methoden worden echter beperkt door aanzienlijk kleinere bibliotheekgroottes13 te moeten gebruiken en eiwitten polyvalent tot expressie te brengen. Polyvalente expressie introduceert aviditeitseffecten die de intrinsieke affiniteit van het peptide verstoren en maskeren, wat van groter belang is bij het genereren van nieuwe bindmiddelen. Faagweergave omzeilt dit probleem omdat het is aangepast voor monovalente weergave, waardoor de selectie van bindmiddelen met echt verbeterde affiniteiten wordt vergemakkelijkt14,15,16. Andere in vitro weergavemethoden worden evenmin belemmerd door de beperkingen van in vivo weergavemethoden, maar bieden hun eigen unieke uitdagingen. Ribosoomweergave kan bijvoorbeeld worden gebruikt om grotere bibliotheken te onderzoeken (1013-14)17, maar de output van de selecties is in de vorm van mRNA-moleculen die inherent minder stabiel zijn dan de faag-ingekapselde DNA-output van faagweergave18. Andere in vitro weergavemethoden, zoals mRNA/cDNA-weergave, cis activity-based display (CIS) en covalente antilichaamweergave (CAD), hebben problemen aangetoond met efficiëntie, stabiliteit en inconsistentie19,20,21,22,23.
Faagweergave zelf wordt beperkt door bibliotheekgroottes die worden beperkt door de efficiëntie van bacteriële transformatie en door geen bibliotheken toe te staan met sequenties die de faag / bacteriële groei verstoren16, maar over het algemeen zijn deze beperkingen verwaarloosbaar en faagweergave is succesvol geweest in het produceren van zeer specifieke en krachtige bindmiddelen van doeleiwitten2,5,10,24, 25. Dit kan niet alleen worden gebruikt in medisch onderzoek om nieuwe therapieën te ontwikkelen, maar ook om eiwit- en enzymkenmerken op te helderen en meer te leren over eiwitinteracties die betrokken zijn bij belangrijke biologische routes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
De ubiquitine variant technologie werd bedacht in het laboratorium van Dr. Sachdev Sidhu (Universiteit van Toronto). WZ is momenteel een CIFAR Azrieli Global Scholar in het Humans & The Microbiome Program. Dit onderzoek werd gefinancierd door NSERC Discovery Grants toegekend aan WZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
References
- Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
- Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
- Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
- Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
- Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
- Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
- Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
- Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
- Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
- Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
- Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
- Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
- Sheehan, J., Marasco, W. A.
- Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
- Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
- Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
- Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
- Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
- Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
- Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
- Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
- Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
- Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
- Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
- Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).
