Summary
L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale critica della proteina, la cui disregolazione è stata implicata in numerose malattie umane. Questo protocollo descrive in dettaglio come la visualizzazione dei fagi può essere utilizzata per isolare nuove varianti di ubiquitina in grado di legare e modulare l'attività delle ligasi E3 che controllano la specificità, l'efficienza e i modelli di ubiquitinazione.
Abstract
L'ubiquitina è una piccola proteina da 8,6 kDa che è un componente fondamentale del sistema ubiquitina-proteasoma. Di conseguenza, può legarsi a una vasta gamma di proteine con elevata specificità ma bassa affinità. Attraverso la visualizzazione dei fagi, le varianti di ubiquitina (UbV) possono essere progettate in modo tale da mostrare una migliore affinità rispetto all'ubiquitina wildtype e mantenere la specificità di legame alle proteine bersaglio. Il display dei fagi utilizza una libreria fagemidica, in cui la proteina del mantello pIII di un batteriofago filamentoso M13 (scelto perché visualizzato esternamente sulla superficie del fago) viene fuso con UbV. I residui specifici di ubiquitina wildtype umana sono morbidi e randomizzati (cioè, c'è una propensione verso la sequenza wildtype nativa) per generare UbV in modo che vengano evitati cambiamenti deleteri nella conformazione proteica introducendo la diversità necessaria per promuovere nuove interazioni con la proteina bersaglio. Durante il processo di visualizzazione dei fagi, questi UbV vengono espressi e visualizzati sulle proteine del rivestimento fagico e panned contro una proteina di interesse. Gli UbV che mostrano interazioni di legame favorevoli con la proteina bersaglio vengono mantenuti, mentre i leganti poveri vengono lavati via e rimossi dal pool della biblioteca. Gli UbV trattenuti, che sono attaccati alla particella fagica contenente il fagemide corrispondente dell'UbV, sono eluiti, amplificati e concentrati in modo che possano essere panned contro la stessa proteina bersaglio in un altro round di visualizzazione dei fagi. Tipicamente, vengono eseguiti fino a cinque cicli di visualizzazione dei fagi, durante i quali viene imposta una forte pressione di selezione contro gli UbV che si legano debolmente e / o promiscuamente in modo che quelli con affinità più elevate siano concentrati e arricchiti. In definitiva, gli UbV che dimostrano una maggiore specificità e/o affinità per la proteina bersaglio rispetto alle loro controparti wildtype sono isolati e possono essere caratterizzati attraverso ulteriori esperimenti.
Introduction
Comprendere i dettagli molecolari delle interazioni proteina-proteina è fondamentale per delineare i meccanismi di trasduzione del segnale dei processi biologici, in particolare quelli che contribuiscono a malattie clinicamente importanti. Negli ultimi anni, la visualizzazione dei fagi è stata utilizzata come metodo pratico e accessibile per isolare proteine / peptidi con un legame molto migliorato a una proteina bersaglio desiderata1,2,3,4, che a sua volta può essere utilizzata come sonde intracellulari di interazioni proteina-proteina.
L'ubiquitinazione è una cascata di attività enzimatiche (enzima attivante E1 → enzima coniugante E2 → ligasi E3) che coniugano covalentemente l'ubiquitina (Ub) a substrati proteici per indirizzarli alla degradazione o per mediare i cambiamenti di segnalazione cellulare. Inoltre, le deubiquitinasi catalizzano la rimozione dell'ubiquitina dalle proteine. Pertanto, nelle cellule, ci sono migliaia di interazioni proteina-proteina ub-dipendenti, la stragrande maggioranza delle quali riconosce una superficie comune con bassa affinità ma alta specificità per consentire interazioni deboli attraverso superfici ampie e diverse.
Ernst et al. hanno introdotto mutazioni in regioni di legame note di Ub per vedere se potevano migliorare l'affinità di legame per una proteina di interesse pur mantenendo un'elevata selettività5. È stata sviluppata una libreria combinatoria di oltre 10 miliardi (7,5 x 1010) varianti di Ub (UbV) con mutazioni in posizioni sulla superficie Ub che mediano le interazioni Ub-proteina conosciute. Questa libreria consisteva di fagemidi che esprimono la proteina del rivestimento del batteriofago M13 pIIII fusa in UbV diversificati. Pertanto, i singoli UbV possono essere visualizzati sulla superficie del fago tramite la proteina del mantello al momento dell'espressione. Durante il processo di selezione, i fagi che mostrano UbV con notevoli interazioni di legame con la proteina bersaglio saranno mantenuti e arricchiti nei successivi cicli di visualizzazione dei fagi, mentre i fagi che mostrano UbV che si legano male alla proteina bersaglio vengono lavati via e rimossi dal pool fagico. Le particelle di fagi trattenute contengono il fagemino corrispondente al loro UbV visualizzato, consentendo loro di essere sequenziati e ulteriormente caratterizzati una volta isolati.
Utilizzando questa strategia di ingegneria proteica, sono stati sviluppati inibitori UbV per le deubiquitinasi umane5 e le proteasi virali6. È importante sottolineare che abbiamo generato UbV inibitori per le ligasi E3 della famiglia HECT umana attraverso il dirottamento del sito di legame E2 e l'attivazione di UbV che occupano un esosite Ub-binding sul dominio HECT7. Possiamo anche inibire gli E3 monomerici della famiglia RING prendendo di mira il sito di legame E2 e indurre la dimerizzazione UbV per attivare l'ANELLO omodimerico E3s8. Per gli RING E3 multi-subunità, gli UbV possono ottenere l'inibizione prendendo di mira la subunità RING (ad esempio, per il complesso APC/ C9) o interrompendo la formazione di complessi (ad esempio, per SCF E3s10). Collettivamente, gli UbV possono essere sfruttati per interrogare sistematicamente le interazioni proteina-proteina nel sistema Ub-proteasoma (UPS) in modo da poter decifrare meglio i meccanismi biochimici degli enzimi UPS e identificare e convalidare i siti funzionali per l'intervento terapeutico.
Il seguente protocollo descrive come impiegare una libreria UbV visualizzata da fagi generati in precedenza per indirizzare una proteina di interesse e come arricchire i leganti UbV che interagiscono con la proteina bersaglio attraverso cicli successivi di visualizzazione dei fagi.
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Protocol
1. Preparazione del reagente
- PBS (soluzione salina tamponata con fosfato): mescolare 50 mL di soluzione 10x PBS con 450 mL di H2O ultrapuro. Sterilizzare mediante filtrazione e conservare a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
- 10% BSA (albumina sierica bovina): aggiungere lentamente 1 g di BSA a 7 ml di H2O ultrapuro e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Ricaricare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 10 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C.
- Tampone PB (PBS integrato con BSA all'1%): aggiungere lentamente 5 g di BSA a 400 ml di H2O ultrapuro e 50 ml di PBS e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Ricaricare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C.
- Tampone PBT (PBS integrato con 1% BSA e 0,05% Tween 20): aggiungere lentamente 5 g di BSA a 400 mL di H2O ultrapuro e 50 ml di PBS e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Aggiungere 250 μL di Tween 20. Ricaricare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C.
- Buffer PT (PBS integrato con 0,05% Tween 20): Mescolare 1 mL di Tween 20 con 400 mL di PBS. Rabboccare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 2 L. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
- Brodo 2YT: Aggiungere 16 g di triptone, 10 g di estratto di lievito e 5 g di NaCl a 800 ml di H2O ultrapuro e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Rabboccare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 1 L. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente (~20-25 °C).
- Piastre LB/carb: aggiungere 12,5 g di miscela LB prefabbricata e 7,5 g di agar a 400 mL di H2O. Ricaricare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml e sterilizzare in autoclave. Assicurarsi che l'agar sia completamente sciolto e attendere che si raffreddi al di sotto dei 60 °C. Aggiungere 500 μL di 100 mg di ml di carbenicillina, mescolare bene e versare nel piatto. Conservare a 4 °C.
- LB/piastre tet: Aggiungere 12,5 g di miscela LB prefabbricata e 7,5 g di agar a 400 mL di H2O ultrapuro. Rabboccare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml e sterilizzare in autoclave. Assicurarsi che l'agar sia completamente sciolto e attendere che si raffreddi al di sotto dei 60 °C. Aggiungere 500 μL di tetraciclina da 10 mg di mL, mescolare bene e versare nel piatto. Conservare a 4 °C.
- 20% PEG (polietilenglicole)/2,5 M NaCl: Aggiungere 50 g di PEG-8000 e 36,5 g di NaCl a 200 mL di H2O ultrapuro. Mescolare fino a completa dissoluzione.
NOTA: questa operazione potrebbe richiedere del tempo; il riscaldamento può aiutare. Ricaricare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 250 ml. Sterilizzare per filtrazione o autoclave. - 0,1 M HCl: Mescolare 20 mL di 1 M HCl con 180 mL di H2O ultrapuro. Sterilizzare per filtrazione e conservare a temperatura ambiente (~20-25 °C).
- 1 M Tris (pH 11,0): Aggiungere 6,1 g di base Tris a 40 mL di H2O ultrapuro. Regolare il pH a 11,0 con HCl e mescolare fino a completa dissoluzione di Tris. Ricaricare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 50 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a temperatura ambiente (~20-25 °C).
- 100 mg/mL (1000x) di carbenicillina: Aggiungere 2 g di sale disodico di carbenicillina a 20 mL di H2O ultrapuro. Mescolare fino a completa dissoluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a -20 °C.
- 50 mg/mL (1000x) kanamicina: Aggiungere 1 g di kanamicina solfato a 20 mL di H2O ultrapuro. Mescolare fino a completa dissoluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a -20 °C.
- 10 mg/mL (1000x) tetraciclina: aggiungere 0,2 g di tetraciclina cloridrato a 20 ml di etanolo al 70%. Mescolare fino a completa dissoluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a -20 °C.
2. Preparazione proteica
- Determinare la concentrazione dello stock proteico target in μM. Il modo più conveniente per valutare la concentrazione proteica è misurare l'assorbanza dello stock proteico a 280 nm. Se la concentrazione è nota in mg/mL, convertirla in μM utilizzando il peso molecolare della proteina bersaglio. Una gamma di metodi può essere utilizzata a seconda della proteina di interesse; vedere la sezione Discussione per i dettagli.
NOTA: se la proteina è troncata (dominio/motivo proteico specifico) o etichettata, ricordarsi di tenere conto di queste variazioni del peso molecolare durante la conversione da mg/mL a μM. - Preparare tre tubi microcentrifuga etichettati "round 1", "round 2/3" e "round 4/5".
- Calcolare il volume di proteine necessario per diluirlo a 1 μM in 800 μL PBS e aliquotare questo volume nei tubi senza aggiungere PBS.
NOTA: se la quantità di proteina bersaglio disponibile è bassa, la concentrazione può essere abbassata a un minimo di 0,25 μM.
- Calcolare il volume di proteine necessario per diluirlo a 1 μM in 800 μL PBS e aliquotare questo volume nei tubi senza aggiungere PBS.
3. Preparazione per il primo turno di selezione
- Preparare una coltura di semi per la coltura dell'input del fago per il secondo round di selezione.
- Inoculare 5 mL di 2YT/tet con una colonia di Escherichia coli ben isolata e incubare durante la notte a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 rpm.
- Rivestire il piatto per il primo turno di selezione.
- Diluire la proteina bersaglio nel tubo "round 1" con la quantità appropriata di PBS e aliquota 100 μL in otto pozzetti di una piastra legante a 96 pozzetti (cioè la piastra bersaglio).
NOTA: la visualizzazione dei fagi può essere eseguita per quattro diverse proteine contemporaneamente su una singola piastra rivestendo i pozzetti negli angoli della piastra. - Controllo opzionale: se la proteina bersaglio è etichettata, ad esempio con GST o MBP (proteina legante il maltosio), rivestire otto pozzetti in un'altra piastra legante a 96 pozzetti con 100 μL di una soluzione da 1 μM contenente il tag epitopo appropriato. Questo verrà utilizzato per rimuovere i fagi indesiderati che si legano al tag in modo non specifico.
- Agitare le piastre durante la notte a 4 °C con agitazione orbitale a 200 giri/min.
- Diluire la proteina bersaglio nel tubo "round 1" con la quantità appropriata di PBS e aliquota 100 μL in otto pozzetti di una piastra legante a 96 pozzetti (cioè la piastra bersaglio).
4. Primo turno di selezione
- Preparare l'input del secondo round.
- Inoculare 30 mL di 2YT/tet con 200 μL della coltura di semi dal punto 3.1.
- Incubare a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 giri/min fino a quando i batteri sono in fase mid-log (OD600
0,6 - 0,8). Questo richiede circa tre ore.
- Blocca la piastra di destinazione.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento dalla piastra, o entrambe le piastre se è stata realizzata una piastra di controllo, invertendo e scuotendo su un lavandino. Asciugare su carta assorbente.
- Aggiungere 300 μL di tampone PB a ciascun pozzetto rivestito.
- Rimuovere il buffer PB come nel passaggio 4.2.1 e aggiungere altri 200 μL di buffer PB.
- Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con scuotimento orbitale a 300 giri/min.
- Preparare la libreria dei fagi.
- Scongelare la libreria di fagi sul ghiaccio e diluirla a 100 volte la diversità della libreria in PBS. Ad esempio, se la diversità della libreria è 1 x 1010 e la concentrazione della libreria è 1 x 1013, diluire la libreria in modo che la concentrazione sia 1 x 1012. Per le librerie qui utilizzate, diluirle 10 volte in PBS combinando 1 mL della libreria con 9 mL di PBS.
NOTA: la diversità della libreria dovrebbe essere stata determinata durante la creazione della libreria e non può essere facilmente valutata altrimenti. La concentrazione della libreria può essere determinata inoculando cellule di E. coli in fase mid-log (OD600 0,6 - 0,8) e placcando su LB / carb. - Aggiungere 1/5 di volume di PEG/NaCl. Ad esempio, per 10 mL della libreria precedentemente diluita, aggiungere 2 mL di PEG/NaCl.
- Incubare sul ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare a 11.000 x g per 30 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e rifiltrare per 2 minuti per abbattere il surnatante rimanente.
NOTA: Mettere il tubo nel rotore nello stesso orientamento la seconda volta in quanto è stato il primo a mantenere il pellet nello stesso posto, quindi, rendendolo più facile da vedere. - Risospendare delicatamente il pellet di fagi in 1 mL di PBT per proteina. Per quattro proteine, risospesare il pellet in 4 ml di PBT.
NOTA: Cercare di non toccare il pellet e non introdurre bolle d'aria.
- Scongelare la libreria di fagi sul ghiaccio e diluirla a 100 volte la diversità della libreria in PBS. Ad esempio, se la diversità della libreria è 1 x 1010 e la concentrazione della libreria è 1 x 1013, diluire la libreria in modo che la concentrazione sia 1 x 1012. Per le librerie qui utilizzate, diluirle 10 volte in PBS combinando 1 mL della libreria con 9 mL di PBS.
- Mostra il fago alle proteine bersaglio.
- Controllo opzionale: aggiungere 100 μL di libreria di fagi a ciascun pozzetto rivestito nella piastra di controllo. Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con scuotimento orbitale a 300 rpm e trasferire la libreria dalla piastra di controllo alla piastra di destinazione. Saltare il passaggio 4.4.2.
- Rimuovere il buffer PB dalla piastra di destinazione come nel passaggio 4.2.1 e aggiungere 100 μL della libreria di fagi a ciascun pozzetto rivestito.
- Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con scuotimento orbitale a 300 giri/min.
- Elute intorno a un fago.
- Rimuovere la libreria di fagi e lavare i pozzetti rivestiti quattro volte con tampone PT. Capovolgere il piatto e toccare un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce.
NOTA: se più proteine bersaglio sono rivestite su una piastra, cercare di ridurre al minimo il flusso di tutte le soluzioni successive tra i pozzetti. - Aggiungere 100 μL di 0,1 M HCl a ciascun pozzetto rivestito e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti con scuotimento orbitale a 300 giri/min.
- Neutralizzare il pH aggiungendo 12,5 μL di 1 M Tris-HCl (pH 11) a ciascun pozzo rivestito.
- Raggruppare il fago eluito da tutti gli 8 pozzi in un singolo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Pipettare su e giù durante il trasferimento per rendere omogenee le soluzioni e aspirare tutto il liquido dai pozzetti.
- Aggiungere il 10% di BSA al fago eluito aggregato ad una concentrazione finale dell'1%. Per un tipico volume di eluizione rotondo di 950 μL, aggiungere 95 μL di BSA al 10%. Conservare a 4 °C. Questo è l'output del primo round.
- Rimuovere la libreria di fagi e lavare i pozzetti rivestiti quattro volte con tampone PT. Capovolgere il piatto e toccare un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce.
0,6 - 0,8). Questo richiede circa tre ore.5. Preparazione per i successivi turni di selezione
- Preparare una coltura di semi per la coltivazione dell'input fagico per il prossimo ciclo di selezione come nel passaggio 3.1.
- Rivestire la piastra per il terzo turno di selezione come nel passaggio 3.2 con le modifiche indicate di seguito.
- Rivestire solo quattro pozzetti per proteina in una piastra legante a 96 pozzetti. Utilizzare metà del contenuto dei tubi "round 2/3" o "round 4/5" per il round appropriato. Diluire il contenuto di questi tubi secondo necessità, al fine di evitare che le proteine si depositino dalla soluzione.
- Preparare l'input del fago per il prossimo round di selezione.
- Utilizzare metà dell'output del primo round dal passaggio 4.5.5 per inoculare 3 mL di celle di fase mid-log dal passaggio 4.1. Per un tipico round one output, inoculare con 500 μL di uscita.
- Incubare a 37 °C per 30 minuti con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
- Aggiungere il fago helper M13K07 ad una concentrazione finale di 1 x 1010 PFU/mL.
- Incubare a 37 °C per 1 ora con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
- Trasferire l'intero 3 mL di coltura a 30 mL di 2YT/carb/kan. Crescere durante la notte a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
- Il giorno successivo, trasferire la coltura in un tubo centrifuga da 50 ml e centrifugare a 11.000 x g per 10 minuti a 4 °C per precipitare le cellule.
- Decantare il surnatante in un nuovo tubo di centrifuga da 50 mL e mescolare con 8 mL di PEG/NaCl e incubare sul ghiaccio per 10 min.
- Centrifugare a 11.000 x g per 10 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e centrifugare nuovamente per 2 minuti.
NOTA: Mettere il tubo nel rotore nello stesso orientamento la seconda volta in quanto è stato il primo a mantenere il pellet nello stesso posto, quindi, rendendolo più facile da vedere. - Risospesci il pellet di fagi in 800 μL di PBT in modo che sia completamente omogeneo e non siano visibili grumi.
- Trasferire la soluzione di fagi in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e centrifuga a 16.200 x g per 4 minuti a 4 °C in detriti di pellet.
- Trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga. Questo è l'input per il prossimo turno di selezione.
- Opzionale: titolare le soluzioni di input e output.
- Utilizzare 500 μL di una coltura di semi di E. coli per inoculare 5 mL di 2YT/tet e incubare a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 rpm fino a quando i batteri sono in fase mid-log (OD600 0,6 - 0,8). Ci vogliono circa 1 h.
- Diluire le soluzioni di ingresso/uscita dei fagi a 10-3 - 10-5 in PBS e aggiungere 10 μL di ogni diluizione a 90 μL di cellule coltivate.
NOTA: utilizzare immediatamente soluzioni fagiche diluite perché il fago assorbirà al tubo nel tempo e le trasformazioni potrebbero produrre falsi negativi. - Incubare a 37 °C per 20 minuti con agitazione orbitale a 200 giri/min.
- Piastra da 5 μL su piastre LB/carb separate.
NOTA: la quantità placcata è variabile in base ai risultati precedenti / alle preferenze personali.
- Utilizzare 500 μL di una coltura di semi di E. coli per inoculare 5 mL di 2YT/tet e incubare a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 rpm fino a quando i batteri sono in fase mid-log (OD600
6. Successivi turni di selezione
- Eseguire tutti i round successivi insieme alla preparazione come fatto nei passaggi 3 e 4, rispettivamente, con le differenze indicate di seguito.
- Utilizzare l'input prodotto nel round precedente come sorgente di fagi anziché come libreria. Rivestire 4 pozzetti per proteina bersaglio con 100 μL dell'input fagico acquisito dal round precedente. Conservare gli input fagici rimanenti a 4 °C.
- Rendere la fase di lavaggio in 4.5.1 più rigorosa con ogni turno di selezione. Il primo round richiede il lavaggio 4 volte, il secondo round richiede 6 volte, il terzo round richiede 8 volte e i round quattro e cinque richiedono entrambi il lavaggio 10 volte.
- Ridurre alcuni volumi rispetto a quelli utilizzati nel primo round perché i round successivi rivestono solo quattro pozzetti invece di otto. Ad esempio, nel passaggio 4.5.5 solo 45 μL del 10% di BSA vengono aggiunti all'output del fago e nel passaggio 5.3.1 solo 250 μL dell'output del fago vengono utilizzati per inoculare le cellule.
7. Elaborazione post selezione e isolamento dei fagi
- Piastrellare le soluzioni di input e output per i round quattro e cinque.
- Se non è già stato fatto nel passaggio 5.4, seguire gli stessi passaggi per titer round quattro e cinque uscite di fagi, producendo idealmente una gamma di 30-300 colonie su alcune piastre.
- Coltura e fago isolato.
- Aliquota 450 μL di 2YT/carb/M13K07 in ogni tubo di una scatola di coltura da 96 mini tubi.
- Scegli colonie ben isolate da una qualsiasi delle piastre dal passaggio 7.1 per inoculare ogni tubo.
NOTA: utilizzare la metà superiore della casella per le uscite arrotondate quattro e la metà inferiore per le uscite round cinque. - Incubare durante la notte a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
- Centrifugare a 1.200 x g per 10 min a 4 °C.
- Trasferire il maggior numero possibile di surnatante in una nuova scatola di coltura a 96 mini tubi senza disturbare il pellet cellulare e scartare quello vecchio. Conservare a 4 °C.
- Dalla nuova scatola, trasferire 100 μL da ciascun tubo a una piastra non vincolante da 96 pozzetti contenente 100 μL di glicerolo al 50% in tutti i pozzetti. Mescolare bene e conservare a -80 °C come scorta di riserva.
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Representative Results
I leganti prodotti dal display dei fagi possono essere verificati e analizzati in molti modi. Si raccomanda di procedere prima con il sequenziamento del fago con primer che affiancano l'inserto diversificato nella libreria fagemimidica. Un esperimento di visualizzazione ideale dei fagi mostrerà una chiara inclinazione verso diverse sequenze (Figura 1). Saranno presenti anche altre sequenze ma con un conteggio inferiore, apparendo più come rumore di fondo. Nell'esempio fornito, dove la visualizzazione dei fagi è stata eseguita tra varianti di ubiquitina (UbV) e UBE4B wildtype, c'è una particolare inclinazione verso le sequenze #1-4. È stato fornito uno script Python di esempio per l'organizzazione e l'analisi dei file di sequenziazione ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). Per confermare l'importanza dei leganti, i saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA) possono essere utilizzati come misura rapida dell'affinità di legame relativa alla proteina bersaglio wildtype, alla proteina bersaglio mutata e alle proteine off-target (Figura 1). Le differenze nelle affinità di legame tra i nuovi leganti e la proteina legante wildtype, su cui si basavano i nuovi leganti, possono essere determinate normalizzando l'assorbanza ELISA dei leganti a quella della proteina wildtype (non mostrata) o di altre proteine che non dimostrano alcun legame apprezzabile con la proteina bersaglio (Figura 1). Questo esempio dimostra la tendenza delle sequenze arricchite ad avere una maggiore affinità di legame per la proteina bersaglio. È stato fornito uno script Python di esempio per l'organizzazione e l'analisi dei file di sequenziazione ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Inoltre, è stato fornito uno script Python di esempio specifico per l'analisi dei risultati UbV ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Idealmente, le sequenze di leganti che sono più numerose avranno un'affinità di legame relativa più elevata rispetto alle sequenze meno numerose, che sono presumibilmente rumore di fondo. È possibile che i leganti instabili siano in numero ridotto, ma dimostrino un legame apprezzabile attraverso le ELISA. Questi leganti dovrebbero essere ulteriormente studiati per determinare se i punteggi ELISA sono artefatti o se sono effettivamente leganti degni di ulteriore caratterizzazione.
Figura 1: Risultati rappresentativi per una selezione di varianti di ubiquitina (UbV) rispetto a UBE4B. (A) Gli UbV sono stati ordinati dalla frequenza più alta alla più bassa (conteggi). Le sequenze rappresentano la regione diversificata dell'ubiquitina nell'UbV con tutti i residui randomizzati (in particolare, i residui 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 e 70-78). Tutte le assorbanze ELISA sono state normalizzate rispetto a 96 punteggi ELISA BSA medi e 96 punteggi ELISA GST medi. Il verde più scuro rappresenta un legame relativo più forte. La GST è stata inclusa come controllo per il legame non specifico a causa del fatto che la proteina bersaglio è etichettata GST. (B) Riepilogo grafico dei risultati ELISA dal pannello A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Ordine suggerito dei passaggi per l'esecuzione della visualizzazione dei fagi. Le linee tratteggiate indicano i processi che vengono trasferiti al giorno successivo o dal giorno precedente. Tutti i round successivi dopo il terzo round procedono in modo simile al terzo round, escluso il quinto round in cui non è necessaria alcuna preparazione all'input dei fagi a meno che non vengano eseguiti più round. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Labware ed etichette suggeriti per l'impostazione di un esperimento di visualizzazione dei fagi. Sono indicati lo scopo e i passaggi pertinenti nel protocollo. R: rotondo; I: ingresso; O: uscita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Apparizioni di pellet tipici incontrati durante la procedura di visualizzazione dei fagi. Il pellet della libreria di fagi si presenta come una striscia lungo il lato del tubo e può essere ririvigato per concentrare il pellet sul fondo del tubo. I pellet di ingresso dei fagi e i pellet di detriti appaiono più tipici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Script Python. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Come accennato nel passaggio 2.1 (preparazione delle proteine), è possibile utilizzare una varietà di metodi per valutare la concentrazione proteica e ciascuno avrà vantaggi e svantaggi unici in base alla specifica proteina bersaglio utilizzata per la visualizzazione dei fagi. In precedenza è stata fornita una fonte di descrizioni e protocolli dettagliati per i metodi più diffusi11.
L'uso del fago trattenuto da un precedente ciclo di visualizzazione dei fagi come input per un round successivo arricchisce i buoni leganti rimuovendo gradualmente i leganti che si legavano debolmente, transitoriamente o per caso. Entro i round quattro e cinque ci sarà idealmente un chiaro pregiudizio verso un piccolo e specifico insieme di sequenze peptidiche, dimostrando le preferenze di legame della proteina bersaglio.
Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con una libreria UbV. Mentre questi passaggi possono generalmente applicarsi ad altri tipi di librerie (ad esempio, peptidi, anticorpi, ecc.), Probabilmente dovranno essere adattati per ospitare tali librerie non UbV. Come accennato nel passaggio 4.3.1, la diversità e la concentrazione della biblioteca devono essere conosciute prima di procedere con la visualizzazione dei fagi. Per ulteriori informazioni su come vengono determinati questi attributi di libreria, vedere il protocollo utilizzato per creare le librerie UbV utilizzate in questa procedura12.
I risultati di visualizzazione dei fagi possono essere molto chiari e presentare ovvi leganti candidati per perseguire un'ulteriore caratterizzazione. Ad esempio, i leganti che sono entrambi molto frequenti e hanno un legame significativamente più elevato, come misurato da ELISA, sono chiari candidati per ulteriori studi. Tuttavia, quando la frequenza di un particolare legante non è correlata positivamente con i dati ELISA, ciò può presentare una certa confusione su come individuare leganti interessanti. Nell'esempio fornito (Figura 1), si consiglia di scegliere una combinazione dei leganti più comuni, anche se hanno una bassa affinità di legame, e quelli con affinità di legame più elevata, anche se appaiono poco frequenti. I leganti poco frequenti con punteggi ELISA elevati potrebbero non essere così comuni a causa dell'instabilità durante la visualizzazione dei fagi, che influenzerebbe negativamente la loro prevalenza in questi dati finali. Come tali, vale la pena indagare tanto quanto i leganti altamente frequenti.
Le soluzioni di fagi isolati possono essere facilmente contaminate. Si raccomanda di procedere con il sequenziamento del DNA il prima possibile utilizzando primer che fiancheggiano la regione del peptide diversificato. Un'altra tipica analisi post-visualizzazione consiste nell'eseguire ELISA dei leganti con la loro proteina bersaglio. Inoltre, gli ELISA possono essere eseguiti con i leganti e le versioni mutate / troncate delle loro proteine bersaglio, che possono dare un'idea approssimativa della loro probabile modalità di legame. È molto importante notare che le soluzioni fagiche dovrebbero essere mescolate bene prima dell'uso in qualsiasi esperimento se sono state sedute per un po '. Il fago può adsorbire alle pareti del tubo o depositarsi fuori dalla soluzione e può produrre falsi negativi.
Il modo più efficiente in termini di tempo per eseguire questa procedura è illustrato nella Figura 2. Inizia ogni round con la preparazione della coltura batterica necessaria per far crescere l'input del fago per il round successivo il giorno successivo. Mentre questa cultura sta crescendo, i piatti rivestiti possono essere bloccati. Mentre le piastre vengono bloccate, la libreria può essere preparata (per il primo round) o l'input del fago può essere preparato (per i round successivi). Il giorno del quarto round non è necessario preparare una coltura di semi e quindi il giorno del quinto round non è necessario fare alcuna preparazione per l'input fagico del round successivo a meno che non si intenda fare più di cinque round di selezione. Per risparmiare ulteriormente il tempo, è stata fornita anche una configurazione del labware suggerita (Figura 3). Inoltre, i pellet di fagi non sono sempre distinti, quindi sono state fornite immagini delle tipiche apparenze di pellet incontrate durante questa procedura (Figura 4).
Se ci sono problemi con la pellettizzazione del fago durante la preparazione dell'input per un round successivo, l'esperimento potrebbe dover essere interrotto per un giorno mentre vengono coltivati nuovi fagi. Questi possono essere recuperati tornando al fago salvato nei tubi per l'input per quel round. Ad esempio, se il fago necessario per il terzo round di visualizzazione non può essere pellettato per qualche motivo, è possibile tornare al tubo "R3I" che contiene 400 μL di ingresso fagico per il terzo round. Questo può essere ripetuto solo una volta se si rivestono quattro pozzetti con 100 μL.
Il titolo del fago di uscita per i round da quattro a cinque è in genere compreso tra 106 e 108 PFU / mL. Se il titolo non è di interesse, avere semplicemente abbastanza colonie presenti per riempire una mini scatola di coltura a 96 tubi dovrebbe essere sufficiente per fornire una rappresentazione accurata della diversità dei fagi e il titolo non ha necessariamente importanza. Tuttavia, se il titolo del fago di uscita è basso e si desiderano più colonie, il fago può essere reimpletato ripetendo il passaggio 5.3. Essenzialmente, il fago può essere reimmplificato prendendo l'output per il round di selezione desiderato, inoculando le cellule della fase mid-log, aggiungendo fago helper e carbenicillin, facendo crescere la coltura durante la notte e raccogliendo il fago tramite precipitazione PEG come descritto in precedenza.
Esistono altri metodi di visualizzazione e ognuno possiede i propri vantaggi e svantaggi rispetto alla visualizzazione dei fagi. I metodi di visualizzazione in vivo, come la visualizzazione della superficie cellulare, possono aumentare la probabilità di un corretto ripiegamento delle proteine e consentire anche modifiche post-traduzionali; tuttavia, questi metodi sono limitati dal dover utilizzare librerie di dimensioni considerevolmente più piccole13 ed esprimere le proteine in modo polivalente. L'espressione polivalente introduce effetti di avidità che interferiscono e mascherano l'affinità intrinseca del peptide, che è di maggiore interesse quando si generano nuovi leganti. Il display Phage bypassa questo problema perché è stato adattato per la visualizzazione monovalente, facilitando così la selezione di leganti con affinità veramente migliorate14,15,16. Allo stesso modo, altri metodi di visualizzazione in vitro non sono ostacolati dai limiti dei metodi di visualizzazione in vivo, ma presentano sfide uniche. Ad esempio, la visualizzazione dei ribosomi può essere utilizzata per sondare librerie più grandi (1013-14)17, tuttavia, l'output delle selezioni è sotto forma di molecole di mRNA che sono intrinsecamente meno stabili dell'output di DNA incapsulato nei fagi del display dei fagi18. Altri metodi di visualizzazione in vitro, come il display mRNA/cDNA, il cis activity-based display (CIS) e il display degli anticorpi covalenti (CAD) hanno dimostrato problemi di efficienza, stabilità e incoerenza19,20,21,22,23.
La visualizzazione stessa dei fagi è limitata dalle dimensioni della libreria limitate dall'efficienza della trasformazione batterica e dal fatto che non consente librerie con sequenze che interferiscono con la crescita fagica/batterica16, ma in generale, queste limitazioni sono trascurabili e la visualizzazione dei fagi ha avuto successo nel produrre leganti altamente specifici e potenti delle proteine bersaglio2,5,10,24, 25. Questo può essere utilizzato non solo nella ricerca medica per sviluppare nuove terapie, ma anche per chiarire le caratteristiche delle proteine e degli enzimi e saperne di più sulle interazioni proteiche coinvolte in importanti percorsi biologici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
La tecnologia della variante dell'ubiquitina è stata ideata nel laboratorio del Dr. Sachdev Sidhu (Università di Toronto). WZ è attualmente un CIFAR Azrieli Global Scholar nel programma Humans & The Microbiome. Questa ricerca è stata finanziata da NSERC Discovery Grants assegnato a WZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
References
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