Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Abstract

Ubiquitin, ubiquitin-proteazom sisteminin temel bir bileşeni olan küçük bir 8.6 kDa proteinidir. Sonuç olarak, yüksek özgüllüğe ancak düşük benzeşime sahip çeşitli proteinler dizisine bağlanabilir. Faj ekranı sayesinde, ubiquitin varyantları (UbV'ler) wildtype ubiquitin üzerinde gelişmiş benzeşim gösterecek ve hedef proteinlere bağlayıcı özgüllüğü koruyacak şekilde geliştirilebilir. Faj ekranı, filamentli bir M13 bakteriyofajının pIII kat proteininin (faj yüzeyinde harici olarak görüntülendiği için seçilir) UbV'lerle kaynaştırıldığı bir fajmid kütüphanesi kullanır. İnsan wildtype ubiquitin'in spesifik kalıntıları yumuşak ve randomizedir (yani, yerel wildtype dizisine karşı bir önyargı vardır), böylece hedef proteinle yeni etkileşimleri teşvik etmek için gerekli çeşitliliği tanıtırken protein uyumundaki zararlı değişikliklerden kaçınılır. Faj görüntüleme işlemi sırasında, bu UbV'ler faj kat proteinleri üzerinde ifade edilir ve görüntülenir ve ilgi çekici bir proteine karşı tavalanır. Hedef proteinle olumlu bağlayıcı etkileşimler gösteren UBV'ler korunurken, zayıf bağlayıcılar yıkanır ve kütüphane havuzundan çıkarılır. UbV'nin karşılık gelen fajmidini içeren faj parçacığına bağlı tutulan UbV'ler, başka bir faj ekranında aynı hedef proteine karşı panned edilebilmeleri için eluted, amplified ve konsantre edilir. Tipik olarak, beş adede kadar faj ekranı gerçekleştirilir ve bu sırada zayıf ve/veya karışık bir şekilde bağlanan UBV'lere karşı güçlü bir seçim baskısı uygulanır, böylece daha yüksek yakınlıkları olanlar konsantre edilir ve zenginleştirilir. Sonuç olarak, hedef protein için wildtype meslektaşlarından daha yüksek özgüllük ve/veya benzeşim gösteren UbV'ler izole edilir ve daha fazla deneyle karakterize edilebilir.

Introduction

Protein-protein etkileşimlerinin moleküler ayrıntılarını anlamak, özellikle klinik olarak önemli hastalıklara katkıda bulunan biyolojik süreçlerin sinyal transdüksiyon mekanizmalarını suçlu bulmak için kritik öneme sahiptir. Son yıllarda, faj görüntüleme, protein-protein etkileşimlerinin hücre içi probları olarak kullanılabilen istenen bir hedef proteine çok daha iyi bağlanmış proteinleri / peptitleri izole etmek için pratik ve erişilebilir bir yöntem olarak kullanılmaktadır1,2,3,4.

Ubiquitination, ubiquitin'i (Ub) bozulma veya hücre sinyal değişikliklerine aracılık etmek için protein substratlarına kovalent olarak eşleyen enzimatik faaliyetlerin (E1 aktive enzim → E2 konjugating enzimi → E3 ligazyonları) bir çağlayanıdır. Ek olarak, deubiquitinases, ubiquitin'in proteinlerden uzaklaştırılmasını katalİze eder. Bu nedenle, hücrelerde, büyük çoğunluğu büyük ve çeşitli yüzeylerde zayıf etkileşimlere izin vermek için düşük benzeşimli ancak yüksek özgüllüğe sahip ortak bir yüzeyi tanıyan binlerce Ub bağımlı protein-protein etkileşimi vardır.

Ernst ve arkadaşları, Ub'in bilinen bağlayıcı bölgelerine mutasyonlar getirdi ve hala yüksek seçiciliği korurken ilgi çekici bir protein için bağlayıcı yakınlığı artırıp artıramayacağını görmek için5. Bilinen Ub-protein etkileşimlerine aracılık eden Ub yüzeyindeki pozisyonlarda mutasyonlara sahip 10 milyardan fazla (7,5 x 1010) Ub varyantından (UbV) oluşan bir kombinatoryal kütüphane geliştirildi. Bu kütüphane, çeşitlendirilmiş UbV'lere kaynaşmış M13 bakteriyofaj pIII kat proteinini ifade eden fajmidlerden oluşuyordu. Bu nedenle, bireysel UbV'ler ifade üzerine kat proteini aracılığıyla faj yüzeyinde görüntülenebilir. Seçim sürecinde, hedef proteinle önemli bağlayıcı etkileşimlere sahip UbV'leri görüntüleyen fajlar sonraki faj görüntüleme turlarında tutulacak ve zenginleştirilecek, hedef proteine zayıf bağlanan UbV'leri gösteren faj ise yıkanarak faj havuzundan çıkarılacaktır. Tutulan faj parçacıkları, görüntülenen UbV'lerine karşılık gelen fajmidi içerir ve izole edildikten sonra sıralanmalarını ve daha fazla karakterize olmalarını sağlar.

Bu protein mühendisliği stratejisi kullanılarak, UbV inhibitörleri insan deubiquitinases5 ve viral proteazes6 için geliştirilmiştir. Daha da önemlisi, E2-bağlama sitesini ele geçirerek ve HECT etki alanında Ub bağlayıcı bir dış kaplamayı işgal eden UbV'leri etkinleştirerek insan HECT ailesi E3 bağları için inhibitör UbV'ler oluşturduk7. Ayrıca E2 bağlama bölgesini hedefleyerek monomerik RING ailesi E3'leri inhibe edebilir ve homodimerik RING E3s8'i etkinleştirmek için UbV dimerizasyonunu teşvik edebiliriz. Çok alt üne sahip RING E3'ler için, UbV'ler RING alt birimini (örneğin, APC/C kompleksi9 için) hedef alarak veya karmaşık oluşumu bozarak (örneğin, SCF E3s10 için) inhibisyon elde edebilir. Toplu olarak, UbV'ler, Ub-proteazom sistemindeki (UPS) protein-protein etkileşimlerini sistematik olarak sorgulamak için kullanılabilir, böylece UPS enzimlerinin biyokimyasal mekanizmalarını daha iyi deşifre edebilir ve terapötik müdahale için fonksiyonel bölgeleri belirleyebilir ve doğrulayabiliriz.

Aşağıdaki protokol, ilgi çekici bir proteini hedeflemek için daha önce oluşturulmuş bir faj görüntülenen UbV kütüphanesinin nasıl kullanılacağını ve ardışık faj görüntüleme turları aracılığıyla hedef proteinle etkileşime giren UbV bağlayıcılarının nasıl zenginleştirilerek zenginleştirilmeyi açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reaktif hazırlama

  1. PBS (fosfat tamponlu salin): 50 mL 10x PBS çözeltiyi 450 mL ultra saf H2O ile karıştırın.
  2. %10 BSA (sığır serum albümini): 7 mL ultra saf H2O'ya yavaşça 1 g BSA ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). Son ses seviyesi 10 mL olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  3. PB tamponu (%1 BSA ile desteklenmiş PBS): Yavaşça 400 mL ultra saf H2O'ya 5 g BSA ve 50 mL PBS ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). Son ses seviyesi 500 mL olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  4. PBT tamponu (PBS% 1 BSA ve% 0.05 Ara 20 ile desteklenmiş): Yavaşça 400 mL ultra saf H2O'ya 5 g BSA ve 50 mL PBS ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). 250 μL ara 20 ekleyin. Son ses seviyesi 500 mL olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  5. PT tamponu (PBS% 0.05 Ara 20 ile desteklenmiş): 1 mL Ara 20'yi 400 mL PBS ile karıştırın. Son ses seviyesi 2 L olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yapın, filtrasyonla sterilize edin ve 4 °C veya oda sıcaklığında (~20-25 °C) saklayın.
  6. 2YT suyu: 800 mL ultra saf H2O'ya 16 g tripon, 10 g maya özü ve 5 g NaCl ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). Son ses seviyesi 1 L olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yapın, otomatik olarak sterilize edin ve oda sıcaklığında (~20-25 °C) saklayın.
  7. LB/karbonhidrat plakaları: 400 mL H2O'ya 12,5 g önceden yapılmış LB karışımı ve 7,5 g agar ekleyin. Agarın tamamen çözüldüğünden emin olun ve 60 ° C'nin altına soğumasını bekleyin. 500 μL 100 mg mL karbenisilin ekleyin, iyice karıştırın ve plakaya dökün. 4 °C'de saklayın.
  8. LB/tet plakaları: 400 mL ultra saf H2O'ya 12,5 g önceden yapılmış LB karışımı ve 7,5 g agar ekleyin. Agar'ın tamamen çözüldüğüne emin olun ve 60 °C'nin altına soğumasını bekleyin. 500 μL 10 mg mL tetrasiklin ekleyin, iyice karıştırın ve tabağa dökün. 4 °C'de saklayın.
  9. %20 PEG (polietilen glikol)/2,5 M NaCl: 200 mL ultra saf H2O'ya 50 g PEG-8000 ve 36,5 g NaCl ekleyin.
    NOT: Bu biraz zaman alabilir; ısıtma yardımcı olabilir. Son ses seviyesi 250 mL olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yap. Filtrasyon veya otoklavlama ile sterilize edin.
  10. 0,1 M HCl: 20 mL 1 M HCl'yi 180 mL ultra saf H2O ile karıştırın.
  11. 1 M Tris (pH 11.0): 40 mL ultra saf H2O'ya 6.1 g Tris tabanı ekleyin. Son ses seviyesi 50 mL olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize uğrayın ve oda sıcaklığında (~20-25 °C) saklayın.
  12. 100 mg/mL (1000x) karbenisilin: 20 mL ultra saf H2O'ya 2 g karbenisilin disodium tuzu ekleyin. Filtrasyon ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.
  13. 50 mg/mL (1000x) kanamycin: 20 mL ultra saf H2O'ya 1 g kanamycin sülfat ekleyin. Filtrasyon ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.
  14. 10 mg/mL (1000x) tetrasiklin: %70 etanol 20 mL'ye 0,2 g tetrasiklin hidroklorür ekleyin. Tamamen çözünene kadar karıştırın. Filtrasyon ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.

2. Protein hazırlama

  1. Hedef protein stoğunun μM'deki konsantrasyonunu belirleyin. Protein konsantrasyonunu değerlendirmenin en uygun yolu, protein stoğunun emiciliğini 280 nm olarak ölçmektir. Konsantrasyon mg/mL olarak biliniyorsa, hedef proteinin moleküler ağırlığını kullanarak μM'ye dönüştürün. İlgi proteinine bağlı olarak bir dizi yöntem kullanılabilir; ayrıntılar için Tartışma bölümüne bakın.
    NOT: Protein kesilirse (spesifik protein etki alanı/motifi) veya etiketlenmişse, mg/mL'den μM'ye dönüştürürken moleküler ağırlıktaki bu değişiklikleri hesaba katmayı unutmayın.
  2. "Yuvarlak 1", "yuvarlak 2/3" ve "yuvarlak 4/5" etiketli üç mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
    1. 800 μL PBS'de 1 μM'ye seyreltmek için gerekli protein hacmini hesaplayın ve pbs eklemeden bu hacmi tüplere aliquot.
      NOT: Mevcut hedef protein miktarı düşükse, konsantrasyon 0,25 μM'ye kadar düşürülebilir.

3. Seçimin birinci turuna hazırlık

  1. İkinci tur seçim için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın.
    1. İyi izole edilmiş bir Escherichia coli kolonisi ile 5 mL 2YT / tet aşılayın ve 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 37 ° C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  2. İlk seçim turu için plakayı kapla.
    1. "Yuvarlak 1" tüpteki hedef proteini uygun miktarda PBS ve aliquot 100 μL ile 96 kuyulu bir bağlayıcı plakanın sekiz kuyusuna (yani hedef plakaya) seyreltin.
      NOT: Faya göstergesi, plakanın köşelerindeki kuyular kaplanarak tek bir plaka üzerinde aynı anda dört farklı protein için yapılabilir.
    2. İsteğe bağlı kontrol: Hedef protein GST veya MBP (maltoz bağlayıcı protein) gibi etiketlenmişse, sekiz kuyuyu uygun epitop etiketini içeren 1 μM çözeltinin 100 μL'si ile başka bir 96 kuyu bağlama plakasında kaplar. Bu, özellikle etikete bağlanan istenmeyen fajı kaldırmak için kullanılacaktır.
    3. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 4 °C'de gece boyunca sallama plakaları.

4. Seçimin birinci turu

  1. İkinci raundu hazırlayın.
    1. Adım 3.1'den itibaren 200 μL tohum kültürü ile 30 mL 2YT / tet aşıla.
    2. Bakteriler orta kütük fazında olana kadar 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 37 °C'de kuluçkaya yaslanın (OD600Equation 1 0.6 - 0.8). Bu yaklaşık üç saat sürer.
  2. Hedef plakayı engelle.
    1. Kaplama solüsyonunun plakadan veya bir kontrol plakası yapılmışsa her iki plakayı da bir lavabonun üzerine ters çevirip sallayarak çıkarın. Kağıt havluları kurulayın.
    2. Her iyi kaplanmış kuyuya 300 μL PB tampon ekleyin.
    3. PB arabelleği adım 4.2.1'deki gibi çıkarın ve 200 μL daha PB arabelleği ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında (~20-25 °C) 1 saat boyunca 300 rpm yörüngesel sarsıntı ile kuluçkaya yaslanın.
  3. Faj kütüphanesini hazırlayın.
    1. Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün ve PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katını seyreltin. Örneğin, kitaplık çeşitliliği 1 x 1010 ve kitaplık konsantrasyonu 1 x 1013 ise, konsantrasyon 1 x 1012 olacak şekilde kitaplığı seyreltin. Burada kullanılan kütüphaneler için, kütüphanenin 1 mL'si ile 9 mL PBS'yi birleştirerek PBS'de 10 kat seyreltin.
      NOT: Kütüphane çeşitliliği kütüphane oluşturma sırasında belirlenmeliydi ve başka türlü kolayca değerlendirilemez. Kütüphane konsantrasyonu, E. coli hücrelerinin orta kütük fazında (OD600 0.6Equation 1 - 0.8) aşılanması ve LB/karbonhidrat üzerine kaplama yapılmasıyla belirlenebilir.
    2. 1/5 cilt PEG/NaCl ekleyin. Örneğin, daha önce seyreltilmiş kitaplığın 10 mL'si için 2 mL PEG /NaCl ekleyin.
    3. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
    4. 4 °C'de 30 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüj, süpernatantı atın ve kalan süpernatantı aşağı çekmek için 2 dakika boyunca son santrifüj.
      NOT: Tüpü, peleti aynı yerde tutan ilk tüp olduğu gibi ikinci kez aynı yönde rotora koyun, bu nedenle görmeyi kolaylaştırın.
    5. Faj peletini protein başına 1 mL PBT'de hafifçe yeniden diriltin. Dört protein için peleti 4 mL PBT'de yeniden diritin.
      NOT: Pelene dokunmamaya çalışın ve hava kabarcıkları sokmayın.
  4. Fajı hedef proteinlere görüntüleyin.
    1. İsteğe bağlı kontrol: Kontrol plakasındaki her kaplamalı kuyuya 100 μL faj kütüphanesi ekleyin. 300 rpm yörüngesel sarsıntı ile 1 saat boyunca oda sıcaklığında (~20-25 °C) kuluçkaya yaslayın ve kütüphaneyi kontrol plakasından hedef plakaya aktarın. Adım 4.4.2'ye atlayın.
    2. PB tamponunu adım 4.2.1'de olduğu gibi hedef plakadan çıkarın ve her bir iyi kaplanmış kuyuya 100 μL faj kütüphanesi ekleyin.
    3. Oda sıcaklığında (~20-25 °C) 1 saat boyunca 300 rpm yörüngesel sarsıntı ile kuluçkaya yaslanın.
  5. Bir faj yuvarlak elute.
    1. Faj kütüphanesini çıkarın ve kaplamalı kuyuları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Tabağı ters çevirin ve son damlaları çıkarmak için bir kağıt havluya dokunun.
      NOT: Birden fazla hedef protein tek bir plaka üzerine kaplanmışsa, kuyular arasındaki sonraki tüm çözümlerin akışını en aza indirmeye çalışın.
    2. Her kaplamalı kuyuya 100 μL 0,1 M HCl ekleyin ve 300 rpm yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yaslayın.
    3. Her kaplamalı kuyuya 12,5 μL 1 M Tris-HCl (pH 11) ekleyerek pH'ı nötralize edin.
    4. 8 kuyunun tamamından elde edilen fajı tek bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne bir şekilde bir edin. Çözeltileri homojen hale getirmek ve kuyulardan gelen tüm sıvıyı aspire etmek için aktarım sırasında pipet yukarı ve aşağı.
    5. Havuzalanmış eluted faj için% 10 BSA'yı% 1'lik son konsantrasyona ekleyin. 950 μL'lik tipik bir yuvarlak bir elüasyon hacmi için% 10 BSA'nın 95 μL'sini ekleyin. 4 °C'de saklayın. Bu birinci raunt çıktısı.

5. Sonraki seçim turları için hazırlık

  1. Adım 3.1'de olduğu gibi bir sonraki seçim turu için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın.
  2. Üçüncü seçim turu için plakayı adım 3.2'de olduğu gibi aşağıda belirtilen değişikliklerle kaplayın.
    1. Protein başına sadece dört kuyuyu 96 kuyu bağlayıcı bir plakada kaplar. Uygun tur için "yuvarlak 2/3" veya "yuvarlak 4/5" tüplerin içeriğinin yarısını kullanın. Proteinlerin çözeltiden çıkmasını önlemek için bu tüplerin içeriğini gerektiği gibi seyreltin.
  3. Faj girişini bir sonraki seçim turu için hazırlayın.
    1. 4.1 adımından 3 mL orta günlük faz hücrelerini aşılamak için 4.5.5 adımından birinci tur çıkışın yarısını kullanın. Tipik bir yuvarlak birinci tur çıkış için, 500 μL çıkış ile aşılanın.
    2. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    3. 1 x 1010 PFU/mL'lik son konsantrasyona M13K07 yardımcı faj ekleyin.
    4. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    5. 3 mL'lik kültürün tamamını 30 mL 2YT/karbonhidrat/kan'a aktarın. 200 rpm yörünge sarsıntısı ile 37 °C'de bir gecede büyüyün.
    6. Ertesi gün, hücreleri çökeltmek için kültürü 4 °C'de 10 dakika boyunca 11.000 x g'da 50 mL santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.
    7. Süpernatantı yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne ayırın ve 8 mL PEG / NaCl ile karıştırın ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
    8. 4 °C'de 10 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüj, süpernatantı atın ve 2 dakika boyunca tekrar santrifüj.
      NOT: Tüpü, peleti aynı yerde tutan ilk tüp olduğu gibi ikinci kez aynı yönde rotora koyun, bu nedenle görmeyi kolaylaştırın.
    9. Faj peletini 800 μL PBT'de tamamen homojen olacak ve kümelenme olmayacak şekilde yeniden sakla.
    10. Faj çözeltisini pelet kalıntılarına 4 °C'de 4 dakika boyunca 16.200 x g'da 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.
    11. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu, bir sonraki seçim turu için giriştir.
  4. İsteğe bağlı: Giriş ve çıkış çözümlerini titer edin.
    1. 500 μL E. coli tohum kültürünü kullanarak 5 mL 2YT/tet aşılayıp 37 °C'de bakteriler orta kütük evresine gelene kadar 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile kuluçkaya yatırın (OD600Equation 1 0.6 - 0.8). Bu yaklaşık 1 saat sürer.
    2. PBS'de 10-3 - 10-5'e faj giriş/çıkış çözeltilerini seyreltin ve 90 μL kültürlü hücrelere her seyreltmenin 10 μL'sini ekleyin.
      NOT: Faj zamanla tüpe adsorbe olacağından ve dönüşümler yanlış negatifler üretebileceğinden, seyreltilmiş faj çözeltilerini hemen kullanın.
    3. 200 rpm yörünge sarsıntısı ile 20 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.
    4. Ayrı LB/karbonhidrat plakalarında plaka 5 μL.
      NOT: Kaplanır miktar değişkendir, önceki sonuçlara/kişisel tercihe bağlıdır.

6. Sonraki seçim turları

  1. Sonraki tüm turları, sırasıyla 3 ve 4 adımlarında yapıldığı gibi hazırlıkla birlikte gerçekleştirin ve aşağıda farklılıklar dikkate alındı.
    1. Önceki turda üretilen girişi kitaplık yerine faj kaynağı olarak kullanın. Hedef protein başına 4 kuyuyu, önceki turdan elde edilen faj girişinin 100 μL'si ile kapla. Kalan faj girişlerini 4 °C'de saklayın.
    2. Yıkama adımını 4.5.1'de her seçim turunda daha sıkı hale getirin. Birinci raunt 4 kez yıkamayı gerektirir, ikinci tur 6 kez, üçüncü tur 8 kez ve dört ve beş rauntlar 10 kez yıkanması gerekir.
    3. Birinci turda kullanılanlara kıyasla bazı hacimleri azaltın, çünkü sonraki turlar sekiz yerine sadece dört kuyu kaplar. Örneğin, adım 4.5.5'te faj çıkışına sadece %10 BSA'nın 45 μL'si eklenir ve adım 5.3.1'de hücreleri aşılamak için faj çıkışının sadece 250 μL'si kullanılır.

7. Seçim sonrası işleme ve faj İzolasyonu

  1. Dördüncü ve beşinci rauntlar için giriş ve çıkış çözümlerini titr.
    1. 5.4. adımda henüz yapılmamışsa, dört ve beş faj çıkışını titer etmek için aynı adımları izleyin ve ideal olarak birkaç plakada 30-300 koloni aralığı üretin.
  2. Kültür ve izole faj.
    1. Aliquot 450 μL 2YT / karbonhidrat / M13K07 bir 96 mini tüp kültür kutusunun her tüpüne.
    2. Her tüpü aşılamak için 7.1 adımından plakaların herhangi birinden iyi izole edilmiş koloniler seçin.
      NOT: Dördüncü tur çıkışlar için kutunun üst yarısını ve beşinci tur çıkışları için alt yarısını kullanın.
    3. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
    4. 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüj.
    5. Hücre peletini bozmadan yeni bir 96 mini tüp kültür kutusuna mümkün olduğunca fazla süpernatant aktarın ve eskisini atın. 4 °C'de saklayın.
    6. Yeni kutudan, her tüpten 100 μL'yi tüm kuyularda 100 μL% 50 gliserol içeren 96 kuyu bağlayıcı olmayan bir plakaya aktarın. İyice karıştırın ve yedek stok olarak -80 °C'de saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Faj ekranından üretilen bağlayıcılar birçok şekilde doğrulanabilir ve analiz edilebilir. Öncelikle fajmid kütüphanesindeki çeşitlendirilmiş kesici ucun yanında bulunan astarlarla fajın dizilimine devam etmeniz önerilir. İdeal bir faj görüntüleme deneyi, çeşitli dizilere karşı net bir önyargı gösterecektir (Şekil 1). Diğer diziler de mevcut olacak, ancak daha düşük bir sayıyla, daha çok arka plan gürültüsü olarak görünecektir. Faj görüntüsünün ubiquitin varyantları (UbVs) ve wildtype UBE4B arasında gerçekleştirildiği örnekte, #1-4 dizilerine karşı belirli bir önyargı vardır. Sıralama dosyalarını düzenlemek ve çözümlemek için örnek bir Python komut dosyası sağlanmıştır ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). Bağlayıcıların önemini doğrulamak için enzime bağlı immünorbent tahlilleri (ELISA), wildtype hedef proteinine, mutasyona uğramış hedef proteine ve hedef dışı proteinlere göreli bağlayıcı benzeşimin hızlı bir ölçüsü olarak kullanılabilir (Şekil 1). Yeni bağlayıcılar ile yeni bağlayıcıların dayandığı wildtype bağlayıcı protein arasındaki bağlayıcılıklardaki farklılıklar, bağlayıcıların ELISA emilimini wildtype proteininin (gösterilmeyen) veya hedef proteinle kayda değer bir bağlayıcılığı olmayan diğer proteinlerinkine normalleştirilerek belirlenebilir (Şekil 1). Bu örnek, zenginleştirilmiş dizilerin hedef protein için daha yüksek bağlama benzeşimine sahip olma eğilimini gösterir. Sıralama dosyalarını düzenlemek ve çözümlemek için örnek bir Python komut dosyası sağlanmıştır ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Ayrıca, özellikle UbV sonuçlarını analiz etmek için bir örnek Python komut dosyası sağlanmıştır ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). İdeal olarak, daha çok sayıda olan bağlayıcı dizileri, muhtemelen arka plan gürültüsü olan daha az sayıda diziden daha yüksek bağıl bağlama benzeşimine sahip olacaktır. Kararsız bağlayıcıların sayısı düşük olabilir, ancak ELISA'lar aracılığıyla önemli bağlamalar gösterebilir. Bu bağlayıcılar, ELISA puanlarının yapı olup olmadığını veya gerçekten daha fazla karakterizasyona layık bağlayıcılar olup olmadığını belirlemek için daha fazla araştırılmalıdır.

Figure 1
Şekil 1: UBE4B'ye karşı her yerde bulunan varyant (UbV) seçimi için temsili sonuçlar. (A) UbV'ler en yüksek frekanstan en düşük frekansa (sayımlar) sipariş edildi. Diziler, UbV'deki çeşitlendirilmiş her yerde bulunan bölgeyi tüm randomize kalıntılarla temsil eder (özellikle kalıntılar 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 ve 70-78). Tüm ELISA absorbansları 96 ortalama BSA ELISA puanına ve 96 ortalama GST ELISA puanına göre normalleştirildi. Koyu yeşil daha güçlü göreli bağlamayı temsil eder. Hedef proteinin GST etiketli olması nedeniyle GST spesifik olmayan bağlama için bir kontrol olarak dahil edildi. (B) A panelinden ELISA sonuçlarının grafiksel özeti.

Figure 2
Şekil 2. Faj görüntüleme gerçekleştirmek için önerilen adım sırası. Kesikli çizgiler, ertesi güne veya önceki güne taşınan işlemleri gösterir. Üçüncü turdan sonraki tüm turlar, daha fazla tur gerçekleştirilmediği sürece faj giriş hazırlığının gerekli olmadığı beşinci raunt hariç, üçüncü tura benzer şekilde ilerler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Faj görüntüleme denemesi kurmak için önerilen laboratuvar gereçleri ve etiketler. Protokoldeki amaç ve ilgili adımlar belirtilir. R: yuvarlak; I: giriş; O: çıkış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. Faj görüntüleme prosedürü sırasında karşılaşılan tipik peletlerin görünümleri. Faj kütüphanesi pelet, tüpün yan tarafında bir çizgi olarak sunar ve peletin tüpün dibinde yoğunlaşması için yakın zamanda kullanılabilir. Faj giriş peletleri ve döküntü peletleri daha tipik görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Python Komut Dosyaları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adım 2.1'de (protein hazırlama) belirtildiği gibi, protein konsantrasyonunu değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve her birinin faj görüntüleme için kullanılan belirli hedef proteine dayanarak benzersiz yararları ve dezavantajları olacaktır. Daha önce popüler yöntemler için ayrıntılı açıklamalar ve protokoller kaynağı sağlanmıştır11.

Sonraki bir tur için giriş olarak önceki bir faj ekranı tarafından tutulan fajı kullanmak, zayıf, geçici veya şans eseri bağlanan bağlayıcıları kademeli olarak kaldırarak iyi bağlayıcıları zenginleştirir. Dördüncü ve beşinci rauntlara kadar, hedef proteinin bağlayıcı tercihlerini gösteren küçük ve spesifik bir peptit dizisi kümesine karşı ideal olarak açık bir önyargı olacaktır.

Bu protokol bir UbV kitaplığıyla kullanılmak üzere en iyi duruma getirilmiştir. Bu adımlar genellikle diğer kütüphane türleri (örneğin peptit, antikor vb.) için geçerli olsa da, büyük olasılıkla bu tür UbV olmayan kütüphanelere uyum sağlayacak şekilde uyarlanmaları gerekecektir. Adım 4.3.1'de belirtildiği gibi, faj ekranına geçmeden önce kütüphane çeşitliliği ve konsantrasyonu bilinmelidir. Bu kitaplık özniteliklerinin nasıl belirlendiği hakkında daha fazla bilgi için, lütfen bu yordamda kullanılan UbV kitaplıklarını oluşturmak için kullanılan protokole bakın12.

Faj görüntüleme sonuçları çok net kesilebilir ve daha fazla karakterizasyonu takip etmek için bariz aday bağlayıcılar sunabilir. Örneğin, ELISA tarafından ölçüldüğü gibi hem son derece sık hem de önemli ölçüde daha yüksek bağlamaya sahip bağlayıcılar, daha fazla çalışma için açık adaylardır. Ancak, belirli bir bağlayıcının sıklığı ELISA verileriyle pozitif olarak ilişkili olmadığında, bu ilginç bağlayıcıların nasıl seçılacağı konusunda bazı karışıklıklar ortaya çıkabilir. Sağlanan örnekte (Şekil 1), düşük bağlama benzeşimine sahip olsalar bile en yaygın bağlayıcıların ve seyrek görünseler bile daha yüksek bağlama benzeşimi olanların bir birleşimini seçmeniz önerilir. Yüksek ELISA puanlarına sahip seyrek bağlayıcılar, faj görüntüleme sırasındaki kararsızlık nedeniyle yaygın olmayabilir ve bu da bu son verilerdeki yaygınlıklarını olumsuz yönde etkiler. Bu nedenle, bunlar çok sık ciltler kadar araştırmaya değer.

İzole faj çözeltileri kolayca kontamine olabilir. Çeşitlendirilmiş peptit bölgesini kuşayan astarlar kullanılarak mümkün olan en kısa sürede DNA dizilimine devam etmeniz önerilir. Bir diğer tipik görüntü sonrası analiz, bağlayıcıların ELISA'larını hedef proteinleriyle gerçekleştirmektir. Ek olarak, ELISA'lar hedef proteinlerinin bağlayıcıları ve mutasyona uğramış/kesilmiş versiyonları ile gerçekleştirilebilir, bu da olası bağlama modları hakkında kabaca bir fikir verebilir. Faj çözeltilerinin bir süredir oturuyorlarsa herhangi bir deneyde kullanılmadan önce iyi karıştırılması gerektiğini belirtmek çok önemlidir. Faj, tüpün duvarlarına adsorbe edebilir veya çözeltinin dışına yerleşebilir ve yanlış negatifler üretebilir.

Bu prosedürü gerçekleştirmenin en verimli yolu Şekil 2'de gösterilmiştir. Her tura ertesi gün sonraki tur için faj girişini büyütmek için gerekli bakteri kültürünü hazırlamakla başlayın. Bu kültür büyürken, kaplamalı plakalar engellenebilir. Plakalar bloke edilirken, kütüphane (birinci tur için) veya faj girişi (sonraki turlar için) hazırlanabilir. Dördüncü raunt gününde bir tohum kültürü hazırlamaya gerek yoktur ve bu nedenle beşinci turun gününde, beş turdan fazla seçim yapmak niyetinde olmadığı sürece bir sonraki turun faj girişi için herhangi bir hazırlık yapmaya gerek yoktur. Zamanı daha da ilerletmek için önerilen bir labware kurulumu da sağlanmıştır (Şekil 3). Ek olarak, faj peletleri her zaman farklı değildir, bu nedenle bu işlem sırasında karşılaşılan tipik pelet görünümlerinin resimleri sağlanmıştır (Şekil 4).

Bir sonraki tur için girişin hazırlanması sırasında fajın peletlemesiyle ilgili herhangi bir sorun varsa, yeni faj yetiştirilirken deneyin bir gün boyunca durdurulması gerekebilir. Bunlar, o mermi için giriş için tüplere kaydedilen fajlara geri dönerek kurtarılabilir. Örneğin, üçüncü ekran turu için gerekli faj her nedense peletlenemiyorsa, üçüncü tur için 400 μL faj girişi içeren "R3I" tüpüne dönebilirsiniz. Bu, dört kuyuyu 100 μL ile kaplarsa sadece bir kez tekrarlanabilir.

Dört ila beş rauntlar için çıkış fajının titresi tipik olarak 106 ila 108 PFU/mL aralığındadır. Titering ilgi çekici değilse, sadece bir 96 tüp mini kültür kutusunu doldurmak için yeterli koloniye sahip olmak, faj çeşitliliğinin doğru bir temsilini sağlamak için yeterli olmalıdır ve titre mutlaka önemli değildir. Bununla birlikte, çıkış fajının titresi düşükse ve daha fazla koloni isteniyorsa, faj 5.3 adım tekrarlanarak yeniden örneklenebilir. Esasen, faj, istenen seçim turu için çıktı alınarak, orta kütük faz hücrelerini aşılayarak, yardımcı faj ve karbenisilin eklenerek, kültürü bir gecede büyüterek ve daha önce açıklandığı gibi PEG yağışı yoluyla fajı toplayarak yeniden örneklenebilir.

Diğer görüntüleme yöntemleri vardır ve her biri faj ekranına göre kendi avantajlarına ve dezavantajlarına sahiptir. Hücre yüzeyi görüntüleme gibi in vivo ekran yöntemleri, uygun protein katlama olasılığını artırabilir ve ayrıca çeviri sonrası değişikliklerin yapılmasına izin verebilir; ancak bu yöntemler oldukça küçük kütüphane boyutları13 kullanmak zorunda kalarak ve proteinleri çok değerli olarak ifade ederek kısıtlanır. Çok değerli ifade, yeni bağlayıcılar oluştururken daha fazla ilgi çekici olan peptitin içsel benzeşimine müdahale eden ve maskeleyen avidite etkileri sunar. Faj ekranı, monovalent ekran için uyarlandığı için bu sorunu atlar, böylece gerçekten geliştirilmiş benzeşimlere sahip bağlayıcıların seçimini kolaylaştırır14,15,16. Diğer in vitro ekran yöntemleri de benzer şekilde in vivo ekran yöntemlerinin sınırlamaları tarafından engellenmez, ancak kendi benzersiz zorluklarını sunar. Örneğin, ribozom gösterimi daha büyük kütüphaneleri araştırmak için kullanılabilir (1013-14)17, ancak seçimlerin çıktısı, faj ekranının faj kapsüllenmiş DNA çıktısından doğal olarak daha az kararlı olan mRNA molekülleri şeklindedir18. mRNA/cDNA ekran, cis aktivite tabanlı ekran (CIS) ve kovalent antikor görüntüleme (CAD) gibi diğer in vitro görüntüleme yöntemleri verimlilik, stabilite ve tutarsızlık sorunları göstermiştir19,20,21,22,23.

Faj ekranının kendisi, kütüphane boyutlarının bakteriyel dönüşümün verimliliği ile kısıtlanması ve faj/ bakteri üremesine müdahale eden dizilere sahip kütüphanelere izin verilmemesi ile sınırlıdır16, ancak genellikle bu sınırlamalar ihmal edilebilir ve faj ekranı hedef proteinlerin son derece spesifik ve güçlü bağlayıcılarını üretmede başarılı olmuştur2,5,10,24, 25. Bu sadece tıbbi araştırmalarda yeni terapötikler geliştirmek için değil, aynı zamanda protein ve enzim özelliklerini aydınlatmak ve önemli biyolojik yollarda yer alan protein etkileşimleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

Ubiquitin varyant teknolojisi Dr. Sachdev Sidhu 'nun (Toronto Üniversitesi) laboratuvarında tasarlanmıştır. WZ şu anda İnsanlar ve Mikrobiyom Programı'nda CIFAR Azrieli Global Scholar'dır. Bu araştırma WZ'ye (RGPIN-2019-05721) verilen NSERC Discovery Grants tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Tags

Biyokimya Sayı 174
E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter