Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle critique de la protéine, dont le dérèglement a été impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Ce protocole détaille comment l’affichage des phages peut être utilisé pour isoler de nouvelles variantes d’ubiquitine qui peuvent lier et moduler l’activité des ligas E3 qui contrôlent la spécificité, l’efficacité et les modèles d’ubiquitination.

Abstract

L’ubiquitine est une petite protéine de 8,6 kDa qui est un composant central du système ubiquitine-protéasome. Par conséquent, il peut se lier à un large éventail de protéines avec une spécificité élevée mais une faible affinité. Grâce à l’affichage des phages, les variantes de l’ubiquitine (UbV) peuvent être conçues de manière à présenter une affinité améliorée par rapport à l’ubiquitine de type sauvage et à maintenir une spécificité de liaison aux protéines cibles. L’affichage des phages utilise une bibliothèque de phagémides, dans laquelle la protéine de la couche pIII d’un bactériophage filamenteux M13 (choisie parce qu’elle est affichée à l’extérieur sur la surface du phage) est fusionnée avec des UbV. Les résidus spécifiques de l’ubiquitine de type sauvage humain sont mous et randomisés (c.-à-d. qu’il existe un biais vers la séquence de type sauvage indigène) pour générer des UbV afin d’éviter les changements délétères dans la conformation des protéines tout en introduisant la diversité nécessaire pour promouvoir de nouvelles interactions avec la protéine cible. Au cours du processus d’affichage des phages, ces UbV sont exprimés et affichés sur les protéines de la couche de phage et placés contre une protéine d’intérêt. Les UbV qui présentent des interactions de liaison favorables avec la protéine cible sont conservés, tandis que les liants pauvres sont emportés et retirés du pool de la bibliothèque. Les UbV retenus, qui sont attachés à la particule de phage contenant le phagémide correspondant de l’UbV, sont élués, amplifiés et concentrés de sorte qu’ils puissent être placés contre la même protéine cible dans une autre série d’affichage de phages. En règle générale, jusqu’à cinq cycles d’affichage de phages sont effectués, au cours desquels une forte pression de sélection est imposée contre les UbV qui se lient faiblement et / ou promiscuité afin que ceux ayant des affinités plus élevées soient concentrés et enrichis. En fin de compte, les UbV qui démontrent une spécificité et/ou une affinité plus élevée pour la protéine cible que leurs homologues de type sauvage sont isolés et peuvent être caractérisés par d’autres expériences.

Introduction

Comprendre les détails moléculaires des interactions protéine-protéine est essentiel pour délimiter les mécanismes de transduction du signal des processus biologiques, en particulier ceux qui contribuent à des maladies cliniquement importantes. Au cours des dernières années, l’affichage des phages a été utilisé comme une méthode pratique et accessible pour isoler les protéines / peptides avec une liaison beaucoup améliorée à une protéine cible souhaitée1,2,3,4, qui à son tour peut être utilisée comme sonde intracellulaire des interactions protéine-protéine.

L’ubiquitination est une cascade d’activités enzymatiques (enzyme activatrice E1 → enzyme conjuguante E2 → ligas E3) qui conjuguent de manière covalente l’ubiquitine (Ub) aux substrats protéiques pour les cibler pour la dégradation ou pour arbitrer les changements de signalisation cellulaire. De plus, les déubiquitinases catalysent l’élimination de l’ubiquitine des protéines. Par conséquent, dans les cellules, il existe des milliers d’interactions protéine-protéine dépendantes de l’Ub, dont la grande majorité reconnaît une surface commune avec une faible affinité mais une spécificité élevée pour permettre des interactions faibles à travers des surfaces grandes et diverses.

Ernst et al. ont introduit des mutations dans des régions de liaison connues d’Ub afin de voir si elles pouvaient améliorer l’affinité de liaison pour une protéine d’intérêt tout en maintenant une sélectivité élevée5. Une bibliothèque combinatoire de plus de 10 milliards (7,5 x 1010) de variantes Ub (UbV) avec des mutations à des positions à travers la surface Ub qui médient les interactions Ub-protéine connues a été développée. Cette bibliothèque était composée de phagémides qui expriment la protéine de la couche de bactériophage PIII M13 fusionnée à des UbV diversifiés. Par conséquent, les UbV individuels peuvent être affichés à la surface du phage via la protéine de la couche lors de l’expression. Au cours du processus de sélection, les phages qui présentent des UbV avec des interactions de liaison considérables avec la protéine cible seront conservés et enrichis dans les cycles suivants d’affichage des phages, tandis que les phages affichant des UbV qui se lient mal à la protéine cible sont lavés et retirés du pool de phages. Les particules de phage retenues contiennent le phagémide correspondant à leur UbV affiché, ce qui leur permet d’être séquencées et caractérisées une fois isolées.

En utilisant cette stratégie d’ingénierie des protéines, des inhibiteurs de l’UbV ont été développés pour les déubiquitinases5 humaines et les protéases virales6. Il est important de noter que nous avons généré des UbV inhibiteurs pour les ligas E3 de la famille HECT humaine en détournant le site de liaison E2 et en activant les UbV qui occupent un exosite de liaison Ub sur le domaine HECT7. Nous pouvons également inhiber les E3 monomères de la famille RING en ciblant le site de liaison E2 et induire la dimérisation UbV pour activer l’anneau homodimérique E3s8. Pour les RING E3 multi-sous-unités, les UbV peuvent provoquer une inhibition en ciblant la sous-unité RING (par exemple, pour le complexe APC/C9) ou en perturbant la formation de complexes (par exemple, pour SCF E3s10). Collectivement, les UbV peuvent être exploités pour interroger systématiquement les interactions protéine-protéine dans le système Ub-protéasome (UPS) afin que nous puissions mieux déchiffrer les mécanismes biochimiques des enzymes UPS et identifier et valider les sites fonctionnels pour une intervention thérapeutique.

Le protocole suivant décrit comment utiliser une bibliothèque UbV affichée par un phage précédemment générée pour cibler une protéine d’intérêt et comment enrichir les liants UbV qui interagissent avec la protéine cible à travers des cycles successifs d’affichage des phages.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation du réactif

  1. PBS (solution saline tamponnée au phosphate) : Mélanger 50 mL de solution 10x PBS avec 450 mL de H2O ultrapur. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C ou température ambiante (~20-25 °C).
  2. 10% de BSA (albumine sérique bovine) : Ajouter lentement 1 g de BSA à 7 mL de H2O ultrapur et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 10 mL. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C.
  3. Tampon PB (PBS complété par 1% de BSA): Ajouter lentement 5 g de BSA à 400 mL de H2O ultrapur et 50 mL de PBS et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C.
  4. Tampon PBT (PBS complété par 1% de BSA et 0,05% Tween 20): Ajouter lentement 5 g de BSA à 400 mL de H2O ultrapur et 50 mL de PBS et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Ajouter 250 μL de Tween 20. Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C.
  5. Tampon PT (PBS complété par 0,05% Tween 20): Mélanger 1 mL de Tween 20 avec 400 mL de PBS. Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 2 L. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C ou à température ambiante (~20-25 °C).
  6. Bouillon 2YT : Ajouter 16 g de tryptone, 10 g d’extrait de levure et 5 g de NaCl à 800 mL de H2O ultrapur et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 1 L. Stériliser par autoclavage et conserver à température ambiante (~20-25 °C).
  7. Plaques LB/carb : Ajouter 12,5 g de mélange LB préfabriqué et 7,5 g de gélose à 400 mL de H2O. Compléter avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL et stériliser par autoclavage. Assurez-vous que la gélose est complètement dissoute et attendez qu’elle refroidisse en dessous de 60 °C. Ajouter 500 μL de 100 mg mL de carbénicilline, bien mélanger et verser dans la plaque. Conserver à 4 °C.
  8. Plaques LB/tet : Ajouter 12,5 g de mélange LB préfabriqué et 7,5 g de gélose à 400 mL de H2O ultrapur. Compléter avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL et stériliser par autoclavage. Assurez-vous que la gélose est complètement dissoute et attendez qu’elle refroidisse en dessous de 60 °C. Ajouter 500 μL de 10 mg mL de tétracycline, bien mélanger et verser dans la plaque. Conserver à 4 °C.
  9. 20 % de PEG (polyéthylène glycol)/2,5 M de NaCl : Ajouter 50 g de PEG-8000 et 36,5 g de NaCl à 200 mL de H2O ultrapur. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
    REMARQUE: Cela peut prendre un certain temps; le chauffage peut aider. Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 250 mL. Stériliser par filtration ou autoclavage.
  10. 0,1 M HCl: Mélanger 20 mL de 1 M HCl avec 180 mL de H2O ultrapur. Stériliser par filtration et conserver à température ambiante (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11,0) : Ajouter 6,1 g de base Tris à 40 mL de H2O ultrapur. Ajuster le pH à 11,0 avec HCl et mélanger jusqu’à ce que Tris soit complètement dissous. Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 50 mL. Stériliser par filtration et conserver à température ambiante (~20-25 °C).
  12. 100 mg/mL (1000x) de carbenicilline : Ajouter 2 g de sel disodique de carbénicilline à 20 mL de H2O ultrapur. Mélanger jusqu’à dissolution complète. Stériliser par filtration et conserver à -20 °C.
  13. 50 mg/mL (1000x) de kanamycine : Ajouter 1 g de sulfate de kanamycine à 20 mL de H2O ultrapur. Mélanger jusqu’à dissolution complète. Stériliser par filtration et conserver à -20 °C.
  14. 10 mg/mL (1000x) de tétracycline : Ajouter 0,2 g de chlorhydrate de tétracycline à 20 mL d’éthanol à 70 %. Mélanger jusqu’à dissolution complète. Stériliser par filtration et conserver à -20 °C.

2. Préparation des protéines

  1. Déterminer la concentration du stock protéique cible en μM. Le moyen le plus pratique d’évaluer la concentration en protéines est de mesurer l’absorbance du stock protéique à 280 nm. Si la concentration est connue en mg/mL, convertissez-la en μM en utilisant le poids moléculaire de la protéine cible. Une gamme de méthodes peut être utilisée en fonction de la protéine d’intérêt; voir la section Discussion pour plus de détails.
    REMARQUE: Si la protéine est tronquée (domaine / motif protéique spécifique) ou étiquetée, n’oubliez pas de tenir compte de ces changements de poids moléculaire lors de la conversion de mg / mL en μM.
  2. Préparez trois tubes de microcentrifugation étiquetés « round 1 », « round 2/3 » et « round 4/5 ».
    1. Calculer le volume de protéine nécessaire pour le diluer à 1 μM dans 800 μL pbS et aliquoter ce volume dans les tubes sans ajouter de PBS.
      REMARQUE: Si la quantité de protéine cible disponible est faible, la concentration peut être réduite à aussi peu que 0,25 μM.

3. Préparation au premier tour de sélection

  1. Préparez une culture de graines pour la culture de l’entrée de phages pour la deuxième ronde de sélection.
    1. Inoculer 5 mL de 2YT/tet avec une colonie d’Escherichia coli bien isolée et incuber pendant la nuit à 37 °C avec des secousses orbitales à 200 tr/min.
  2. Enduire l’assiette pour le premier tour de sélection.
    1. Diluer la protéine cible dans le tube « rond 1 » avec la quantité appropriée de PBS et aliquoter 100 μL dans huit puits d’une plaque de liaison de 96 puits (c.-à-d. la plaque cible).
      REMARQUE: L’affichage des phages peut être effectué pour quatre protéines différentes simultanément sur une seule plaque en recouvrant les puits dans les coins de la plaque.
    2. Contrôle facultatif : Si la protéine cible est marquée, par exemple avec la TPS ou la MBP (protéine de liaison au maltose), recouvrir huit puits d’une autre plaque de liaison de 96 puits avec 100 μL d’une solution de 1 μM contenant l’étiquette d’épitope appropriée. Cela sera utilisé pour supprimer les phages indésirables qui se lient à la balise de manière non spécifique.
    3. Agiter la ou les plaques pendant la nuit à 4 °C avec une secousse orbitale de 200 tr/min.

4. Premier tour de sélection

  1. Préparez les entrées de la deuxième ronde.
    1. Inoculer 30 mL de 2YT/tet avec 200 μL de la culture de semences de l’étape 3.1.
    2. Incuber à 37 °C avec une agitation orbitale de 200 tr/min jusqu’à ce que les bactéries soient en phase mi-logarithmique (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Cela prend environ trois h.
  2. Plaque cible de bloc.
    1. Retirez la solution de revêtement de la plaque, ou des deux plaques si une plaque de contrôle a été fabriquée, en inversant et en secouant sur un évier. Sécher sur des serviettes en papier.
    2. Ajouter 300 μL de tampon PB à chaque puits revêtu.
    3. Retirez le tampon PB comme à l’étape 4.2.1 et ajoutez 200 μL supplémentaires de tampon PB.
    4. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec une secousse orbitale de 300 tr/min.
  3. Préparez la bibliothèque de phages.
    1. Décongelez la bibliothèque de phages sur de la glace et diluez-la à 100 fois la diversité de la bibliothèque dans PBS. Par exemple, si la diversité de la bibliothèque est de 1 x 1010 et que la concentration de la bibliothèque est de 1 x 1013, diluez la bibliothèque de sorte que la concentration soit de 1 x 1012. Pour les bibliothèques utilisées ici, diluez-les 10 fois dans PBS en combinant 1 mL de la bibliothèque avec 9 mL de PBS.
      REMARQUE : La diversité des bibliothèques aurait dû être déterminée lors de la création de la bibliothèque et ne peut pas être facilement évaluée autrement. La concentration de la bibliothèque peut être déterminée en inoculant des cellules d’E. coli en phase mi-logarithmique (OD600Equation 1 0,6 - 0,8) et en plaquant sur LB / carb.
    2. Ajouter 1/5 volume de PEG/NaCl. Par exemple, pour 10 mL de la bibliothèque précédemment diluée, ajoutez 2 mL de PEG/NaCl.
    3. Incuber sur de la glace pendant 30 min.
    4. Centrifuger à 11 000 x g pendant 30 min à 4 °C, jeter le surnageant et le recentrifuge pendant 2 min pour tirer vers le bas le surnageant restant.
      REMARQUE: Placez le tube dans le rotor dans la même orientation la deuxième fois que c’était la première pour garder la pastille au même endroit, ce qui la rend plus facile à voir.
    5. Resuspendez doucement la pastille de phage dans 1 mL de PBT par protéine. Pour quatre protéines, remettez en suspension la pastille dans 4 mL de PBT.
      REMARQUE: Essayez de ne pas toucher la pastille et n’introduisez pas de bulles d’air.
  4. Afficher le phage à la ou aux protéines cibles.
    1. Contrôle en option : Ajoutez 100 μL de bibliothèque de phages à chaque puits revêtu dans la plaque de contrôle. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec une secousse orbitale de 300 tr/min et transférer la bibliothèque de la plaque de commande à la plaque cible. Ignorez l’étape 4.4.2.
    2. Retirez le tampon PB de la plaque cible comme à l’étape 4.2.1 et ajoutez 100 μL de la bibliothèque de phages à chaque puits revêtu.
    3. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec une secousse orbitale de 300 tr/min.
  5. Elute autour d’un phage.
    1. Retirez la bibliothèque de phages et lavez les puits enduits quatre fois avec un tampon PT. Inversez la plaque et tapotez sur une serviette en papier pour retirer les dernières gouttes.
      REMARQUE: Si plusieurs protéines cibles sont recouvertes sur une plaque, essayez de minimiser le flux de toutes les solutions ultérieures entre les puits.
    2. Ajouter 100 μL de 0,1 M HCl à chaque puits revêtu et incuber à température ambiante pendant 5 min avec une secousse orbitale de 300 tr/min.
    3. Neutraliser le pH en ajoutant 12,5 μL de 1 M de Tris-HCl (pH 11) à chaque puits revêtu.
    4. Regrouper le phage élué des 8 puits dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Pipette de haut en bas pendant le transfert pour rendre les solutions homogènes et aspirer tout le liquide des puits.
    5. Ajouter 10 % de BSA au phage élué groupé à une concentration finale de 1 %. Pour un volume d’élution rond typique de 950 μL, ajoutez 95 μL de 10 % de BSA. Conserver à 4 °C. Il s’agit de la sortie du premier tour.

5. Préparation des rondes de sélection suivantes

  1. Préparer une culture de semences pour la culture de l’apport de phages pour le prochain tour de sélection comme à l’étape 3.1.
  2. Enduire la plaque pour le troisième tour de sélection comme à l’étape 3.2 avec les changements notés ci-dessous.
    1. Ne recouvrez que quatre puits par protéine dans une plaque de liaison de 96 puits. Utilisez la moitié du contenu des tubes « ronds 2/3 » ou « ronds 4/5 » pour le tour approprié. Diluer le contenu de ces tubes au besoin, afin d’éviter que les protéines ne se déposent hors de la solution.
  3. Préparez l’entrée de phage pour le prochain tour de sélection.
    1. Utilisez la moitié de la sortie de la première ronde de l’étape 4.5.5 pour inoculer 3 mL de cellules de phase à mi-log de l’étape 4.1. Pour une sortie ronde typique, inoculez avec 500 μL de la sortie.
    2. Incuber à 37 °C pendant 30 min avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
    3. Ajouter le phage auxiliaire M13K07 à une concentration finale de 1 x 1010 PFU/mL.
    4. Incuber à 37 °C pendant 1 h avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
    5. Transférer la totalité des 3 mL de culture à 30 mL de 2YT/glucides/kan. Croître pendant la nuit à 37 °C avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
    6. Le lendemain, transférer la culture dans un tube centrifuge de 50 mL et centrifuger à 11 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour précipiter les cellules.
    7. Décanter le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 mL et mélanger avec 8 mL de PEG/NaCl et incuber sur de la glace pendant 10 min.
    8. Centrifuger à 11 000 x g pendant 10 min à 4 °C, jeter le surnageant et centrifuger à nouveau pendant 2 min.
      REMARQUE: Placez le tube dans le rotor dans la même orientation la deuxième fois que c’était la première pour garder la pastille au même endroit, ce qui la rend plus facile à voir.
    9. Remettre en suspension la pastille de phage dans 800 μL de PBT afin qu’elle soit totalement homogène et qu’aucune touffe ne soit visible.
    10. Transférer la solution de phage dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 16 200 x g pendant 4 min à 4 °C pour les débris de granulés.
    11. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Il s’agit de l’entrée pour le prochain tour de sélection.
  4. Facultatif : Titez les solutions d’entrée et de sortie.
    1. Utiliser 500 μL d’une culture de graines d’E. coli pour inoculer 5 mL de 2YT/tet et incuber à 37 °C avec une agitation orbitale de 200 tr/min jusqu’à ce que la bactérie soit en phase médiane log (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Cela prend approximativement 1 h.
    2. Diluer les solutions d’entrée/sortie de phages à 10-3-10-5 dans pbS et ajouter 10 μL de chaque dilution à 90 μL de cellules cultivées.
      REMARQUE: Utilisez immédiatement des solutions de phages diluées, car les phages s’adsorbent dans le tube au fil du temps et les transformations peuvent produire des faux négatifs.
    3. Incuber à 37 °C pendant 20 min avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
    4. Plaque 5 μL sur des plaques LB/carb séparées.
      REMARQUE: La quantité plaquée est variable dépend des résultats précédents / préférence personnelle.

6. Tours de sélection ultérieurs

  1. Effectuez tous les tours suivants avec la préparation comme cela a été fait aux étapes 3 et 4, respectivement, avec les différences notées ci-dessous.
    1. Utilisez l’entrée produite lors du tour précédent comme source de phage au lieu d’une bibliothèque. Enduire 4 puits par protéine cible avec 100 μL de l’apport de phages acquis lors du tour précédent. Conserver les entrées de phages restantes à 4 °C.
    2. Rendez l’étape de lavage dans 4.5.1 plus stricte à chaque tour de sélection. Le premier tour nécessite un lavage 4 fois, le deuxième tour nécessite 6 fois, le troisième tour nécessite 8 fois et les tours quatre et cinq nécessitent tous deux un lavage 10 fois.
    3. Réduisez certains volumes par rapport à ceux utilisés dans la première ronde, car les rondes suivantes ne recouvrent que quatre puits au lieu de huit. Par exemple, à l’étape 4.5.5, seulement 45 μL de 10 % de BSA sont ajoutés à la sortie du phage, et à l’étape 5.3.1, seulement 250 μL de la sortie du phage sont utilisés pour inoculer les cellules.

7. Traitement post-sélection et isolation des phages

  1. Titez les solutions d’entrée et de sortie pour les rondes quatre et cinq.
    1. Si ce n’est pas déjà fait à l’étape 5.4, suivez les mêmes étapes pour filtrer les sorties de phages quatre et cinq, produisant idéalement une gamme de 30 à 300 colonies sur quelques plaques.
  2. Cultiver et isoler les phages.
    1. Aliquote 450 μL de 2YT/carb/M13K07 dans chaque tube d’une boîte de culture de 96 mini tubes.
    2. Choisissez des colonies bien isolées dans l’une des plaques à partir de l’étape 7.1 pour inoculer chaque tube.
      REMARQUE: Utilisez la moitié supérieure de la boîte pour les sorties rondes quatre et la moitié inférieure pour les sorties rondes cinq.
    3. Incuber toute la nuit à 37 °C avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
    4. Centrifuger à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
    5. Transférez autant de surnageant que possible dans une nouvelle boîte de culture de 96 mini-tubes sans déranger la pastille cellulaire et jetez l’ancienne. Conserver à 4 °C.
    6. À partir de la nouvelle boîte, transférer 100 μL de chaque tube vers une plaque non contraignante de 96 puits contenant 100 μL de glycérol à 50% dans tous les puits. Bien mélanger et conserver à -80 °C comme stock de secours.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les liants produits à partir de l’affichage des phages peuvent être vérifiés et analysés de plusieurs façons. Il est recommandé de procéder d’abord au séquençage du phage avec des amorces qui flanquent l’insert diversifié dans la bibliothèque de phagémides. Une expérience d’affichage de phages idéale montrera un biais clair vers plusieurs séquences (Figure 1). D’autres séquences seront également présentes mais avec un nombre plus faible, apparaissant davantage comme bruit de fond. Dans l’exemple fourni, où l’affichage des phages a été effectué entre les variantes de l’ubiquitine (UbV) et le type sauvage UBE4B, il existe un biais particulier en faveur des séquences #1-4. Un exemple de script Python pour l’organisation et l’analyse des fichiers de séquençage a été fourni (« phageDisplaySeqAnalysis.py »). Pour confirmer l’importance des liants, les tests immuno-enzymatiques (ELISA) peuvent être utilisés comme mesure rapide de l’affinité de liaison relative à la protéine cible wildtype, à la protéine cible mutée, ainsi qu’aux protéines hors cible (Figure 1). Les différences d’affinités de liaison entre les nouveaux liants et la protéine de liaison de type sauvage, sur laquelle les nouveaux liants étaient basés, peuvent être déterminées en normalisant l’absorbance ELISA des liants à celle de la protéine de type sauvage (non montrée) ou d’autres protéines qui ne présentent aucune liaison appréciable avec la protéine cible (Figure 1). Cet exemple montre la tendance des séquences enrichies à avoir une affinité de liaison plus élevée pour la protéine cible. Un exemple de script Python pour l’organisation et l’analyse des fichiers de séquençage a été fourni (« phageDisplayElisaAnalysis.py »). En outre, un exemple de script Python spécifiquement pour l’analyse des résultats UbV a été fourni (« phageDisplayUbvAnalysis.py »). Idéalement, les séquences de liant plus nombreuses posséderont une affinité de liaison relative plus élevée que les séquences moins nombreuses, qui sont probablement du bruit de fond. Il est possible que les liants instables soient peu nombreux mais démontrent une liaison appréciable par le biais d’ELISA. Ces liants devraient faire l’objet d’une étude plus approfondie pour déterminer si les scores ELISA sont des artefacts ou s’ils sont effectivement des liants dignes d’une caractérisation plus approfondie.

Figure 1
Figure 1 : Résultats représentatifs pour une sélection d’une variante de l’ubiquitine (UbV) par rapport à UBE4B. (A) Les UbV ont été classés de la fréquence la plus élevée à la plus basse (nombres). Les séquences représentent la région diversifiée de l’ubiquitine dans l’UbV avec tous les résidus randomisés (en particulier, les résidus 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 et 70-78). Toutes les absorbances ELISA ont été normalisées par rapport à 96 scores ELISA BSA moyens et 96 scores ELISA GST moyens. Le vert foncé représente une liaison relative plus forte. La TPS a été incluse comme contrôle de la liaison non spécifique en raison du fait que la protéine cible est marquée par la TPS. (B) Résumé graphique des résultats ELISA du panel A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Ordre suggéré des étapes pour effectuer l’affichage des phages. Les lignes pointillées indiquent les processus qui sont reportés au lendemain ou de la veille. Tous les tours suivants après le troisième tour se déroulent de la même manière que le troisième tour, à l’exception du cinquième tour où aucune préparation d’entrée de phage n’est nécessaire à moins que d’autres tours ne soient effectués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Suggestions de matériel de laboratoire et d’étiquettes pour la mise en place d’une expérience d’affichage de phages. L’objectif et les étapes pertinentes du protocole sont indiqués. R: rond; I: entrée; O: sortie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Apparitions de granulés typiques rencontrés lors de la procédure d’affichage des phages. La pastille de la bibliothèque de phages se présente sous la forme d’une traînée le long du côté du tube et peut être recentrifugée pour concentrer la pastille dans le fond du tube. Les granulés d’entrée de phages et les granulés de débris semblent plus typiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Scripts Python. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Comme mentionné à l’étape 2.1 (préparation des protéines), une variété de méthodes peuvent être utilisées pour évaluer la concentration en protéines, et chacune aura des avantages et des inconvénients uniques en fonction de la protéine cible spécifique utilisée pour l’affichage des phages. Une source de descriptions détaillées et de protocoles pour les méthodes populaires a déjà été fournie11.

L’utilisation du phage retenu par un affichage de phages précédent comme entrée pour un tour suivant enrichit les bons liants en supprimant progressivement les liants qui se liaient faiblement, transitoirement ou par hasard. D’ici les quatrième et cinquième tours, il y aura idéalement un biais clair vers un petit ensemble spécifique de séquences peptidiques, démontrant les préférences de liaison de la protéine cible.

Ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec une bibliothèque UbV. Bien que ces étapes puissent généralement s’appliquer à d’autres types de bibliothèques (par exemple, peptide, anticorps, etc.), elles devront probablement être adaptées pour s’adapter à ces bibliothèques non UbV. Comme mentionné à l’étape 4.3.1, la diversité et la concentration de la bibliothèque doivent être connues avant de procéder à l’affichage des phages. Pour plus d’informations sur la façon dont ces attributs de bibliothèque sont déterminés, consultez le protocole utilisé pour créer les bibliothèques UbV utilisées dans cette procédure12.

Les résultats de l’affichage des phages peuvent être très clairs et présenter des liants candidats évidents pour poursuivre la caractérisation. Par exemple, les liants qui sont à la fois très fréquents et ont une liaison significativement plus élevée, tels que mesurés par ELISA, sont des candidats clairs pour une étude plus approfondie. Cependant, lorsque la fréquence d’un liant particulier n’est pas positivement corrélée avec les données ELISA, cela peut présenter une certaine confusion quant à la façon de distinguer les liants intéressants. Dans l’exemple fourni (Figure 1), il serait recommandé de choisir une combinaison des liants les plus courants, même s’ils ont une faible affinité de liaison, et ceux ayant une affinité de liaison plus élevée, même s’ils semblent peu fréquents. Les liants peu fréquents avec des scores ELISA élevés peuvent ne pas être aussi fréquents en raison de l’instabilité lors de l’affichage des phages, ce qui influencerait négativement leur prévalence dans ces données finales. En tant que tels, ceux-ci valent la peine d’être étudiés autant que les liants très fréquents.

Les solutions de phages isolées peuvent être facilement contaminées. Il est recommandé de procéder au séquençage de l’ADN dès que possible à l’aide d’amorces qui flanquent la région du peptide diversifié. Une autre analyse post-affichage typique consiste à effectuer des ELISA des liants avec leur protéine cible. De plus, les ELISA peuvent être effectués avec les liants et les versions mutées / tronquées de leurs protéines cibles, ce qui peut donner une idée approximative de leur mode de liaison probable. Il est très important de noter que les solutions de phages doivent être bien mélangées avant d’être utilisées dans toute expérience si elles sont assises depuis un certain temps. Le phage peut s’adsorber sur les parois du tube ou se déposer hors de la solution et peut produire des faux négatifs.

La façon la plus rapide d’effectuer cette procédure est illustrée à la figure 2. Commencez chaque tour par la préparation de la culture bactérienne nécessaire à la croissance de l’apport de phages pour le tour suivant le lendemain. Pendant que cette culture se développe, les plaques revêtues peuvent être bloquées. Pendant que les plaques sont bloquées, la bibliothèque peut être préparée (pour le premier tour) ou l’entrée de phage peut être préparée (pour les tours suivants). Le jour de la quatrième ronde, il n’est pas nécessaire de préparer une culture de semences et, par conséquent, le jour de la cinquième ronde, il n’est pas nécessaire de se préparer pour l’entrée de phages de la ronde suivante, sauf si l’on a l’intention de faire plus de cinq rondes de sélection. Pour économiser davantage de temps, une configuration de labware suggérée a également été fournie (Figure 3). De plus, les granulés de phage ne sont pas toujours distincts, de sorte que des images des apparences typiques des granulés rencontrés au cours de cette procédure ont été fournies (Figure 4).

S’il y a des problèmes avec l’agglomération du phage pendant la préparation de l’entrée pour un tour ultérieur, l’expérience peut devoir être interrompue pendant une journée pendant que de nouveaux phages sont cultivés. Ceux-ci peuvent être récupérés en retournant au phage enregistré dans les tubes pour l’entrée de ce tour. Par exemple, si le phage nécessaire pour le troisième tour d’affichage ne peut pas être granulé pour une raison quelconque, vous pouvez revenir au tube « R3I » qui contient 400 μL d’entrée de phage pour le troisième tour. Cela ne peut être répété qu’une seule fois si vous recouvrez quatre puits de 100 μL.

Le titre du phage de sortie pour les rondes quatre à cinq est généralement compris entre 106 et 108 PFU / mL. Si le titrage n’est pas intéressant, le simple fait d’avoir suffisamment de colonies présentes pour remplir une mini boîte de culture de 96 tubes devrait suffire à fournir une représentation précise de la diversité des phages et le titre n’a pas nécessairement d’importance. Cependant, si le titre du phage de sortie est faible et que davantage de colonies sont souhaitées, le phage peut être réamplifié en répétant l’étape 5.3. Essentiellement, le phage peut être réamplifié en prenant la sortie pour le tour de sélection souhaité, en inoculant des cellules de phase mi-logarithmique, en ajoutant du phage auxiliaire et de la carbénicilline, en cultivant la culture pendant la nuit et en récoltant le phage via la précipitation PEG comme décrit précédemment.

D’autres méthodes d’affichage existent, et chacune possède ses propres avantages et inconvénients par rapport à l’affichage des phages. Les méthodes d’affichage in vivo, telles que l’affichage de la surface cellulaire, peuvent augmenter la probabilité d’un repliement approprié des protéines et permettre également des modifications post-traductionnelles; cependant, ces méthodes sont limitées par le fait qu’il faut utiliser des tailles de bibliothèque considérablement plus petites13 et exprimer les protéines de manière polyvalente. L’expression polyvalente introduit des effets d’avidité qui interfèrent avec et masquent l’affinité intrinsèque du peptide, ce qui est d’un plus grand intérêt lors de la génération de nouveaux liants. L’affichage phage contourne ce problème car il a été adapté pour l’affichage monovalent, facilitant ainsi la sélection de liants avec des affinités véritablement améliorées14,15,16. D’autres méthodes d’affichage in vitro ne sont pas non plus entravées par les limites des méthodes d’affichage in vivo, mais présentent leurs propres défis uniques. Par exemple, l’affichage des ribosomes peut être utilisé pour sonder des bibliothèques plus grandes (1013-14)17, cependant, la sortie des sélections se présente sous la forme de molécules d’ARNm qui sont intrinsèquement moins stables que la sortie d’ADN encapsulée par les phages de l’affichage des phages18. D’autres méthodes d’affichage in vitro, telles que l’affichage de l’ARNm/ADNc, l’affichage basé sur l’activité cis (CIS) et l’affichage des anticorps covalents (CAD) ont démontré des problèmes d’efficacité, de stabilité et d’incohérence19,20,21,22,23.

L’affichage des phages lui-même est limité par la taille des bibliothèques étant limité par l’efficacité de la transformation bactérienne et en n’autorisant pas les bibliothèques avec des séquences qui interfèrent avec la croissance des phages / bactériens16, mais généralement, ces limitations sont négligeables, et l’affichage des phages a réussi à produire des liants très spécifiques et puissants des protéines cibles2,5,10,24, 25. Cela peut non seulement être utilisé dans la recherche médicale pour développer de nouvelles thérapies, mais aussi pour élucider les caractéristiques des protéines et des enzymes et en apprendre davantage sur les interactions protéiques impliquées dans d’importantes voies biologiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

La technologie de la variante de l’ubiquitine a été conçue dans le laboratoire du Dr Sachdev Sidhu (Université de Toronto). WZ est actuellement boursier mondial cifar Azrieli dans le cadre du programme Humans & The Microbiome. Cette recherche a été financée par des subventions de découverte du CRSNG accordées à WZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Tags

Biochimie numéro 174
Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter