Summary
유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.
Abstract
유비퀴틴은 유비퀴틴-프로테솜 시스템의 핵심 성분인 작은 8.6 kDa 단백질이다. 따라서, 그것은 높은 특이성 그러나 낮은 친화력을 가진 단백질의 다양한 배열에 결합할 수 있습니다. 파지 디스플레이를 통해 유비퀴틴 변이체(UbV)는 야생형 유비퀴틴에 비해 친화성을 개선하고 표적 단백질에 대한 결합 특이성을 유지하도록 설계할 수 있다. 파지 디스플레이는 파지미드 라이브러리를 활용하여 필라멘트 M13 박테리오파지의 pIII 코트 단백질(파지 표면에 외부적으로 표시되기 때문에 선택)이 UbV와 융합됩니다. 인간 야생형 유비퀴틴의 특정 잔류물은 부드럽고 무작위화되어(즉, 네이티브 야생형 서열에 대한 편견이 있음) UbV를 생성하여 단백질 형성의 해로운 변화를 피하도록 하는 동시에 표적 단백질과의 새로운 상호 작용을 촉진하는 데 필요한 다양성을 도입한다. 파지 표시 과정에서 이러한 UbV는 파지 코트 단백질에 표현되고 표시되며 관심있는 단백질에 대해 패닝됩니다. 대상 단백질과 유리한 결합 상호 작용을 나타내는 UbV는 유지되지만 가난한 바인더는 세척되어 라이브러리 풀에서 제거됩니다. UbV의 해당 파지미드를 포함하는 파지 입자에 부착된 유지 된 UbV는 다른 파지 디스플레이에서 동일한 표적 단백질에 대해 패닝 될 수 있도록 용출, 증폭 및 농축됩니다. 일반적으로 최대 5라운드의 파지 디스플레이가 수행되며, 이 동안 약하게 결합되는 UbV에 대해 강력한 선택 압력이 부과되어 선호도가 높은 파지 디스플레이가 집중되고 풍부해집니다. 궁극적으로, 그들의 야생형 대조제 보다는 표적 단백질에 대한 더 높은 특이성 및/또는 친화성을 입증하는 UbV는 격리되고 추가 실험을 통해 특징화될 수 있다.
Introduction
단백질-단백질 상호 작용의 분자 세부 사항을 이해하는 것은 생물학적 과정의 신호 변환 메커니즘, 특히 임상적으로 중요한 질병에 기여하는 신호를 파기하는 데 중요합니다. 최근 몇 년 동안 파지 디스플레이는 단백질/펩티드를 원하는 표적 단백질에 훨씬 개선된 결합으로 분리하는 실용적이고 접근 가능한 방법으로 활용되어 왔으며, 이는 단백질 단백질 상호작용의 세포내 프로브로서 사용될 수 있다.
유비퀴티닝은 유비퀴틴(Ub)을 단백질 기판에 곱하게 결합하여 분해또는 세포 신호 변화를 중재하는 효소 활동(E1 활성화 효소 → E2 컨쥬게이팅 효소 → E3 리게아제)의 폭포입니다. 또한, deubiquitinases 단백질에서 유비퀴틴의 제거를 촉매. 따라서, 세포에서는, Ub 의존적인 단백질 단백질 상호 작용의 수천이 있습니다, 대다수는 크고 다양한 표면을 통해 약한 상호 작용을 허용하는 낮은 친화성 그러나 높은 특이성을 가진 일반적인 표면을 인식합니다.
Ernst et al.은 여전히 높은 선택성을 유지하면서 관심있는 단백질에 대한 결합 친화성을 향상시킬 수 있는지 확인하기 위해 Ub의 알려진 결합 영역으로 돌연변이를 도입했습니다5. 알려진 Ub-protein 상호 작용을 중재하는 Ub 표면의 위치에서 돌연변이가 있는 100억 개 이상의 (7.5 x 1010) Ub 변이체(UbV)의 결합 라이브러리가 개발되었습니다. 이 라이브러리는 다양한 UbV에 융합된 M13 박테리오파지 pIII 코트 단백질을 표현하는 파지미드로 구성되었습니다. 따라서, 개별 UbV는 발현 시 코트 단백질을 통해 파지 표면에 표시될 수 있다. 선택 과정에서, 대상 단백질과 상당한 결합 상호 작용을 가진 UbV를 표시하는 파지는 파지 디스플레이의 후속 라운드에서 유지되고 풍부하게 되는 반면, 대상 단백질에 제대로 결합되지 않는 UbV를 표시하는 파지는 파지 풀에서 세척되고 제거됩니다. 유지된 파지 입자는 표시된 UbV에 해당하는 파지미드를 함유하고 있어 한 번 격리된 후 시퀀싱되고 더 많은 특징을 가할 수 있습니다.
이 단백질 엔지니어링 전략을 사용하여, UbV 억제제는 인간 deubiquitinases5 및 바이러스 성 proteases6를 위해 개발되었습니다. 중요한 것은, 우리는 E2 결합 사이트를 납치하고 HECT 도메인7에 Ub 결합 외사이트를 차지하는 UbV를 활성화하여 인간 HECT 가족 E3 리그효소에 대한 억제 UbV를 생성했습니다7. 또한 E2 결합 부위를 대상으로 단황 링 패밀리 E3s를 억제하고 UbV 이압을 유도하여 동종 형 링 E3s8을 활성화할 수 있습니다. 다중 서브유닛 링 E3의 경우, UbV는 링 하위 유닛(예: APC/C 복합체9)을 타겟팅하거나 복잡한 형성(예: SCF E3s10)을 방해하여 억제를 달성할 수 있다. UbV는 UB-proteasome 시스템(UPS)에서 단백질-단백질 상호 작용을 체계적으로 심문하여 UPS 효소의 생화학 적 메커니즘을 더 잘 해독하고 치료 개입을 위한 기능적 부위를 식별하고 검증할 수 있도록 활용할 수 있습니다.
다음 프로토콜은 이전에 생성된 파지를 사용하여 관심 있는 단백질을 타겟팅하는 방법과 연속적인 파지 디스플레이를 통해 대상 단백질과 상호 작용하는 UbV 바인더를 풍부하게 하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
1. 시약 준비
- PBS (인산염 완충식식염수): 10x PBS 용액 50mL을 450mL초퓨어 H2O로 혼합하여 여과하여 살균하고 4°C 또는 실온(~20-25°C)에 보관하십시오.
- 10% BSA (소 혈청 알부민): 천천히 초퓨어 H2O의 7 mL에 BSA의 1 g을 추가하고 완전히 용해 될 때까지 혼합 (덩어리 없음). 최종 부피가 10mL가 될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려보아 보입니다. 여과에 의해 살균하고 4 °C에 보관하십시오.
- PB 버퍼(PBS는 1% BSA로 보충됨): BSA 5g을 초퓨어 H2O 400mL에 천천히 추가하고 PBS 50mL를 완전히 용해할 때까지 섞습니다(덩어리 없음). 최종 볼륨이 500mL가 될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려보아 보입니다. 여과에 의해 살균하고 4 °C에 보관하십시오.
- PBT 버퍼(PBS는 1% BSA 및 0.05% Tween 20으로 보충됨): BSA 5g을 초순수 H2O 400mL에 천천히 추가하고 PBS50mL을 완전히 용해할 때까지 혼합합니다(덩어리 없음). 250 μL의 Tween 20을 추가합니다. 최종 볼륨이 500mL가 될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려보아 보입니다. 여과에 의해 살균하고 4 °C에 보관하십시오.
- PT 버퍼(PBS+0.05% Tween 20): 1mL의 Tween 20을 PBS 400mL로 혼합합니다. 최종 부피가 여과에 의해 살균될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려4°C 또는 실온(~20-25°C)에 보관하십시오.
- 2YT 국물: 트립톤 16g, 효모 추출물 10g, NaCl 5 g ~ 800mL초퓨어 H2O를 넣고 완전히 용해될 때까지 섞습니다(덩어리 없음). 최종 부피가 1L. 소독하여 멸균될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려서 실온(~20-25°C)에 보관하십시오.
- LB/탄수화물 플레이트: 12.5g의 미리 만들어진 LB 혼합물과 7.5 g의 한고를 H2O400mL에 추가합니다. 최종 부피가 500mL가 될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려서 오토클레이빙으로 멸균합니다. 한천이 완전히 용해되어 60°C 이하로 식을 때까지 기다립니다. 100 mg mL 카베니실린의 500 μL을 넣고 잘 섞어서 접시에 붓습니다. 4 °C에 보관하십시오.
- LB/tet 플레이트: 12.5g의 미리 만들어진 LB 혼합물과 7.5 g의 초순수 H2O를 400mL에 추가합니다. 최종 부피가 500mL가 될 때까지 초순수 H2O를 얹고 오토클레이브로 멸균합니다. 한천이 완전히 용해되어 60°C 이하로 식을 때까지 기다립니다. 10 mg mL 테트라사이클린의 500 μL을 넣고 잘 섞어서 접시에 붓습니다. 4 °C에 보관하십시오.
- 20% PEG(폴리에틸렌 글리콜)/2.5M NaCl: PEG-8000 5g과 36.5g의 NaCl을 200mL에 초순수 H2O. 완전히 용해될 때까지 섞어줍니다.
참고: 시간이 걸릴 수 있습니다. 난방이 도움이 될 수 있습니다. 최종 볼륨이 250mL가 될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려보있습니다. 여과 또는 오토클레이브로 살균하십시오. - 0.1 M HCl: 1M HCl의 20mL를 180mL초퓨어 H2O로 혼합하여 여과하여 살균하고 실온(~20-25°C)에서 보관하십시오.
- 1 M Tris (pH 11.0): 6.1 g의 Tris 베이스를 초퓨어 H2O의 40mL에 추가합니다. 최종 볼륨이 50mL가 될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려보있습니다. 여과에 의해 살균하고 실온 (~20-25°C)에서 보관하십시오.
- 100 mg/mL (1000x) 카베니실린: 카베니실린 디나트륨 소금 2 g을 초퓨어 H2O의 20mL에 추가합니다. 여과에 의해 살균하고 -20 °C에 보관하십시오.
- 50 mg /mL (1000x) 카나마이신: 완전히 용해 될 때까지 20 mL의 카나마이신 황산염 1 g을 추가합니다. 여과에 의해 살균하고 -20 °C에 보관하십시오.
- 10 mg/mL (1000x) 테트라사이클린: 테트라사이클린 염산염 0.2g을 70% 에탄올의 20mL에 추가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞습니다. 여과에 의해 살균하고 -20 °C에 보관하십시오.
2. 단백질 제제
- μM에서 표적 단백질 육수의 농도를 결정한다. 단백질 농도를 평가하는 가장 편리한 방법은 280 nm에서 단백질 육수의 흡광도를 측정하는 것입니다. 농도가 mg/mL로 알려진 경우, 표적 단백질의 분자량을 사용하여 μM으로 변환한다. 관심 있는 단백질에 따라 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
참고: 단백질이 잘리거나(특정 단백질 도메인/모티프) 태그가 지정된 경우 mg/mL에서 μM으로 변환할 때 분자량의 이러한 변화를 설명해야 합니다. - "라운드 1", "라운드 2/3", "라운드 4/5"라고 표시된 미세 원심 분리튜브 3개.
- 800 μL PBS에서 1 μM로 희석하는 데 필요한 단백질의 양을 계산하고 PBS를 추가하지 않고 튜브에이 볼륨을 알리쿼트합니다.
참고: 사용 가능한 표적 단백질의 양이 낮으면 농도를 0.25 μM로 낮출 수 있습니다.
- 800 μL PBS에서 1 μM로 희석하는 데 필요한 단백질의 양을 계산하고 PBS를 추가하지 않고 튜브에이 볼륨을 알리쿼트합니다.
3. 선발 1라운드 준비
- 선택 의 두 라운드에 대한 파지 입력을 배양하기위한 종자 문화를 준비합니다.
- 잘 분리 된 대장균 콜로니 와 2YT / tet의 5 mL을 접종하고 200 rpm 궤도 흔들림과 37 ° C에서 하룻밤 배양.
- 선택의 첫 번째 라운드에 대한 접시를 코팅합니다.
- 적절한 양의 PBS 및 알리쿼트 100 μL의 "라운드 1" 튜브에서 표적 단백질을 96웰 결합 플레이트(즉, 대상 플레이트)의 8개의 우물로 희석시 희석합니다.
참고: 파지 디스플레이는 플레이트 모서리에 우물을 코팅하여 단일 플레이트에서 동시에 4개의 서로 다른 단백질을 위해 수행할 수 있습니다. - 선택적 제어: 표적 단백질이 GST 또는 MBP(말토스 결합 단백질)와 같이 태그가 지정되면, 적절한 에피토프 태그를 포함하는 1 μM 용액의 100 μL을 가진 또 다른 96웰 결합 판에 8개의 우물을 코팅합니다. 이 태그에 바인딩 하는 원치 않는 파지를 제거 하는 데 사용 됩니다.이 태그에 바인딩 하는 비구체적으로 사용 됩니다.
- 200 rpm 궤도 흔들림으로 4 °C에서 하룻밤 동안 플레이트를 흔들어줍니다.
- 적절한 양의 PBS 및 알리쿼트 100 μL의 "라운드 1" 튜브에서 표적 단백질을 96웰 결합 플레이트(즉, 대상 플레이트)의 8개의 우물로 희석시 희석합니다.
4. 1라운드 선택
- 2라운드 입력을 준비합니다.
- 3.1 단계에서 종자 배양의 200 μL을 가진 2YT/tet의 30mL 접종.
- 박테리아가 중간 로그 단계 (OD600 0.6 - 0.8)에 될 때까지 200
rpm 궤도 흔들림으로 37 °C에서 배양하십시오. 이 소요 약 3 시간.
- 블록 대상 플레이트.
- 플레이트에서 코팅 용액을 제거하거나 제어 판이 만들어진 경우 싱크대 위로 반전하고 흔들어 두 플레이트를 제거합니다. 종이 타월에 두드려 말리십시오.
- 코팅된 각 버퍼에 300μL의 PB 버퍼를 추가합니다.
- 4.2.1 단계와 같이 PB 버퍼를 제거하고 PB 버퍼의 200 μL을 추가합니다.
- 실온(~20-25°C)에서 300rpm 궤도 흔들림으로 1h로 배양한다.
- 파지 라이브러리를 준비합니다.
- 파지 라이브러리를 얼음 위에 해동하고 PBS의 도서관 다양성을 100배로 희석시킵니다. 예를 들어 라이브러리 다이버시티가 1 x 1010이고 라이브러리 농도가 1 x 1013인 경우 농도가 1 x 1012되도록 라이브러리를 희석합니다. 여기에 사용되는 라이브러리의 경우, PBS의 9mL와 라이브러리의 1mL을 결합하여 PBS에서 10 배 희석.
참고: 라이브러리 를 만드는 동안 라이브러리 의 다양성을 결정해야 하며 그렇지 않으면 쉽게 평가할 수 없습니다. 라이브러리 농도는 중간 로그 단계(OD600 0.6 - 0.8)에서 대장균 세포를 접종하고 LB/탄수화물에 도금하여 결정될 수 있다. - PEG/NaCl의 1/5 볼륨을 추가합니다. 예를 들어 이전에 희석된 라이브러리의 10mL에 대해 PEG/NaCl 2mL를 추가합니다.
- 30 분 동안 얼음에 배양.
- 원심분리기는 4°C에서 30분 동안 11,000 x g 로, 2분 동안 상류체를 폐기하고, 나머지 상체를 끌어내리는 데 2분 동안 최신분리기를 버린다.
참고: 같은 위치에 펠릿을 유지하는 첫 번째와 같은 방향으로 튜브를 두 번째로 같은 방향으로 로터에 넣어, 따라서 쉽게 볼 수 있도록. - 단백질 당 PBT의 1 mL에서 파지 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 4개의 단백질을 위해, PBT의 4 mL에서 펠릿을 재중단합니다.
참고 : 펠릿을 만지지 말고 기포를 도입하지 마십시오.
- 파지 라이브러리를 얼음 위에 해동하고 PBS의 도서관 다양성을 100배로 희석시킵니다. 예를 들어 라이브러리 다이버시티가 1 x 1010이고 라이브러리 농도가 1 x 1013인 경우 농도가 1 x 1012되도록 라이브러리를 희석합니다. 여기에 사용되는 라이브러리의 경우, PBS의 9mL와 라이브러리의 1mL을 결합하여 PBS에서 10 배 희석.
- 대상 단백질(들)에 파지를 표시합니다.
- 선택적 제어: 컨트롤 플레이트에 잘 코팅된 각 파지 라이브러리에 100 μL을 추가합니다. 실온(~20-25°C)에서 300rpm 궤도 흔들림으로 1h에 대해 배양하고 제어판에서 대상 플레이트로 라이브러리를 전송한다. 4.4.2 단계를 건너뜁니다.
- 4.2.1 단계와 같이 대상 플레이트에서 PB 버퍼를 제거하고 파지 라이브러리의 100 μL을 잘 코팅한 각 에 추가합니다.
- 실온(~20-25°C)에서 300rpm 궤도 흔들림으로 1h로 배양한다.
- 엘루테 라운드 1 파지.
- 파지 라이브러리를 제거하고 PT 버퍼로 코팅 된 우물을 네 번 씻으십하십시오. 접시를 반전하고 마지막 방울을 제거하기 위해 종이 타월을 누릅니다.
참고: 여러 표적 단백질이 한 접시에 코팅되어 있는 경우 우물 간의 모든 후속 솔루션의 흐름을 최소화하십시오. - 코팅된 각 웰에 0.1 M HCl의 100 μL을 추가하고 실온에서 300 rpm 궤도 흔들림으로 5분 동안 배양합니다.
- 1M Tris-HCl(pH 11)의 12.5 μL을 각 코팅웰에 추가하여 pH를 중화한다.
- 모든 8 개의 우물에서 eluted 파지를 단일 1.5 mL 마이크로 센트 심분리기 튜브로 당기십시오. 파이펫은 전송 하는 동안 위아래로 파이펫 용액 균질 하 게 하 고 우물에서 모든 액체를 흡인.
- 풀이 된 용출 된 파지에 10 %의 BSA를 추가하여 최종 농도를 1 %로 추가합니다. 950 μL의 일반적인 라운드 1 용출 부피의 경우 10 % BSA의 95 μL을 추가하십시오. 4 °C에 보관하십시오. 이것은 라운드 1 출력입니다.
- 파지 라이브러리를 제거하고 PT 버퍼로 코팅 된 우물을 네 번 씻으십하십시오. 접시를 반전하고 마지막 방울을 제거하기 위해 종이 타월을 누릅니다.
rpm 궤도 흔들림으로 37 °C에서 배양하십시오. 이 소요 약 3 시간.5. 후속 선발 준비
- 3.1 단계에서와 같이 다음 선발 라운드에 대한 파지 입력을 배양하기 위한 종자 문화를 준비한다.
- 아래와 같이 3.2단계와 같이 3라운드 선발플레이트를 코팅합니다.
- 96웰 결합 플레이트에 단백질 당 4개의 우물만 코팅합니다. 적절한 라운드에 "라운드 2/3" 또는 "라운드 4/5" 튜브의 내용의 절반을 사용합니다. 단백질이 용액에서 정착되는 것을 피하기 위해 필요에 따라 이러한 튜브의 내용을 희석시하십시오.
- 다음 선발 라운드에 대한 파지 입력을 준비합니다.
- 4.5.5 단계에서 4.1 단계에서 미드 로그 상 셀의 3mL을 접종하는 단계4.5.5에서 1라운드 출력의 절반을 사용합니다. 일반적인 1라운드 출력의 경우 출력의 500 μL로 접종합니다.
- 37°C에서 30분 동안 200rpm 궤도 흔들림으로 배양합니다.
- M13K07 도우미 파지를 1 x 1010 PFU/mL의 최종 농도에 추가합니다.
- 200 rpm 궤도 흔들림과 1 h에 대한 37 °C에서 인큐베이션.
- 문화의 전체 3mL를 2YT/탄수화물/칸의 30mL로 전송합니다. 200 rpm 궤도 흔들림과 함께 37 °C에서 하룻밤 성장.
- 다음 날, 배양기를 50mL 원심분리기 튜브및 원심분리기로 11,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 전달하여 세포를 침전시한다.
- 새로운 50mL 원심분리기 튜브에 상퍼를 넣고 8mL의 PEG/NaCl과 혼합하여 10분 동안 얼음에 배양합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 11,000 x g 에서, 상류체를 폐기하고, 원심분리기를 다시 2분 동안 폐기한다.
참고: 같은 위치에 펠릿을 유지하는 첫 번째와 같은 방향으로 튜브를 두 번째로 같은 방향으로 로터에 넣어, 따라서 쉽게 볼 수 있도록. - 완전히 균일하고 덩어리가 보이지 않도록 PBT의 800 μL에서 파지 펠릿을 다시 중단합니다.
- 파지 용액을 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브 및 원심분리기16,200 x g 에서 4°C에서 4분 동안 펠릿 이물질을 전달합니다.
- 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송합니다. 다음 선발 라운드의 입력입니다.
- 선택 사항: 입력 및 출력 솔루션을 Titer.
- 대장균 종자 배양500 μL을 사용하여 2YT/tet의 5mL을 접종하고 박테리아가 중간 로그 단계에 될 때까지 200 rpm 궤도 흔들림이 있는 37°C에서 배양한다(OD600 0.6 - 0.8). 이 소요 약 1 시간.
- PBS에서 파지 입력/출력 솔루션을 10-3 - 10-5 로 희석하고 각 희석의 10 μL을 배양 셀의 90 μL에 추가합니다.
참고: 파지 시간이 지남에 따라 튜브에 흡착하고 변환이 거짓 네거티브를 생성할 수 있기 때문에 희석 된 파지 솔루션을 즉시 사용하십시오. - 200 rpm 궤도 흔들림으로 20 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 별도의 LB/탄수화물 플레이트에 5 μL 플레이트.
참고: 도금된 양은 이전 결과/개인 선호도에 따라 변동이 있습니다.
- 대장균 종자 배양500 μL을 사용하여 2YT/tet의 5mL을 접종하고 박테리아가 중간 로그 단계에 될 때까지 200 rpm 궤도 흔들림이 있는 37°C에서 배양한다(OD600
6. 후속 선발 라운드
- 아래와 같은 3단계와 4단계에서 수행된 준비와 함께 모든 후속 라운드를 수행합니다.
- 이전 라운드에서 생성된 입력을 라이브러리 대신 파지 소스로 사용합니다. 이전 라운드에서 획득한 파지 입력의 100 μL을 목표로 단백질 당 4개의 우물을 코팅합니다. 남은 파지 입력을 4°C에 저장합니다.
- 각 라운드마다 4.5.1의 세탁 단계를 더욱 엄격하게 만듭니다. 1라운드는 4번, 2라운드는 6번, 3라운드는 8회, 4라운드와 5라운드모두 10번세탁이 필요합니다.
- 후속 라운드가 8개가 아닌 4개의 우물만 코팅하기 때문에 1라운드에서 사용되는 것과 비교하여 일부 볼륨을 줄입니다. 예를 들어, 단계 4.5.5만 45 μL 의 10% BSA는 파지 출력에 첨가되고, 파지 출력의 단지 250 μL만 을 사용하여 세포를 접종한다.
7. 포스트 선택 처리 및 파지 격리
- 4라운드와 5라운드용 입력 및 출력 솔루션을 티터로 합니다.
- 5.4 단계에서 아직 완료되지 않은 경우 동일한 단계를 수행하여 4라운드와 5개의 파지 출력을 수행하여 몇 플레이트에 걸쳐 30-300개의 콜로니 범위를 이상적으로 생성합니다.
- 문화와 분리 파지.
- 알리쿼트 450 μL 2YT/탄수화물/M13K07은 96개의 미니 튜브 배양 박스의 모든 튜브에 들어갑니다.
- 7.1 단계에서 각 튜브를 접종하는 플레이트중 하나에서 잘 분리된 식민지를 선택합니다.
참고: 4라운드 출력과 하단 5회 출력에 상자의 위쪽 절반을 사용합니다. - 200 rpm 궤도 흔들림과 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 1,200 x g 에서 원심분리기.
- 셀 펠릿을 방해하지 않고 새로운 96 미니 튜브 배양 상자에 가능한 한 많은 상체를 전송하고 이전 하나를 폐기. 4 °C에 보관하십시오.
- 새 상자에서 각 튜브에서 모든 우물에서 50% 글리세롤의 100 μL을 포함하는 96개의 잘 결합되지 않는 플레이트로 100 μL을 전송합니다. 잘 섞어서 -80°C에서 백업 스톡으로 보관하십시오.
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Representative Results
파지 디스플레이에서 생성된 바인더는 여러 가지 방법으로 검증 및 분석할 수 있습니다. 파지미드 라이브러리의 다양한 인서트 측면에 있는 프라이머로 파지를 시퀀싱하는 것이 좋습니다. 이상적인 파지 디스플레이 실험은 여러 시퀀스에 대한 명확한 편향을 표시합니다(그림 1). 다른 시퀀스도 존재하지만 수가 낮을수록 배경 소음으로 더 많이 나타납니다. 제공된 예에서는 유비퀴틴 변종(UbV)과 야생형 UBE4B 사이에 파지 디스플레이가 수행된 경우 시퀀스 #1-4에 대한 특별한 편견이 있습니다. 파일 정리 및 분석을 위한 예제 Python 스크립트가 제공되었습니다("phageDisplaySeqAnalysis.py"). 바인더의 중요성을 확인하기 위해, 효소-연결된 면역흡소분석서(ELISA)는 야생형 표적 단백질, 돌연변이 표적 단백질 뿐만 아니라 오프타겟 단백질에 대한 상대적 결합 친화성의 빠른 척도로 사용될 수 있다(도 1). 새로운 바인더와 야생형 결합 단백질 간의 결합 친화성의 차이는 새로운 바인더가 기반을 두고 있었으며, 바인더의 ELISA 흡광도를 야생형 단백질(도시되지 않음) 또는 표적 단백질과 전혀 이해할 수 없는 결합을 입증하지 못하는 다른 단백질로 정상화함으로써 결정될 수 있다(도 1). 이 예는 타겟 단백질에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는 농축 된 서열의 경향을 보여줍니다. 파일 정리 및 분석을 위한 예제 Python 스크립트가 제공되었습니다("phageDisplayElisaAnalysis.py"). 또한 UbV 결과를 분석하기 위한 예제 Python 스크립트가 제공되었습니다("phageDisplayUbvAnalysis.py"). 이상적으로, 더 많은 바인더 시퀀스는 아마도 배경 잡음인 적은 수의 시퀀스보다 더 높은 상대 적 바인딩 친화성을 보유합니다. 불안정한 바인더는 수량이 낮지만 ELISA를 통해 상당한 결합을 보여 줄 수 있습니다. 이러한 바인더는 ELISA 점수가 유물인지 아니면 실제로 추가 특성화에 합당한 바인더인지 확인하기 위해 추가 조사를 받아야 합니다.
그림 1: UBE4B에 대한 유비퀴틴 변형(UbV) 선택에 대한 대표적인 결과가 가장 높은 주파수에서 가장 낮은 주파수(수)로 정렬되었습니다. 시퀀스는 모든 무작위 잔류물(특히 잔류물 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 및 70-78)와 함께 UbV의 다양한 유비퀴틴 영역을 나타냅니다. 모든 ELISA 흡수는 평균 96개의 BSA ELISA 점수와 96개의 평균 GST ELISA 점수에 대해 정규화되었습니다. 녹색이 더 어둡게 표시됩니다. GST는 표적 단백질이 GST 태그가 지정되어 있기 때문에 비특이적 결합을 위한 대조군으로 포함되었다. (B) 패널 A의 ELISA 결과에 대한 그래픽 요약은 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2. 파지 디스플레이를 수행하기 위한 권장 단계 순서입니다. 대선은 다음 날 또는 전날까지 이월되는 프로세스를 나타냅니다. 3라운드 이후의 모든 라운드는 3라운드와 비슷하게 진행되며, 더 많은 라운드가 진행되지 않는 한 파지 입력 준비가 필요하지 않은 5라운드를 제외하면 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 파지 디스플레이 실험을 설정하기 위한 권장 랩웨어 및 라벨입니다. 프로토콜의 목적 및 관련 단계가 표시됩니다. R: 라운드; I: 입력; O: 출력. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 파지 표시 절차 중에 발생하는 전형적인 펠릿의 출현. 파지 라이브러리 펠릿은 튜브의 측면을 따라 줄무늬로 제시하고 최근 튜브의 바닥에 펠릿을 집중시키기 위해 미리 분리 될 수 있습니다. 파지 입력 펠릿과 파편 펠릿은 더 전형적인 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
2.1 단계 (단백질 제제)에서 언급했듯이, 다양한 방법으로 단백질 농도를 평가할 수 있으며, 각 방법은 파지 디스플레이에 사용되는 특정 표적 단백질에 기초하여 독특한 이점과 단점을 가질 것이다. 인기 있는 메서드에 대 한 자세한 설명 및 프로토콜의 소스는 이전에 제공 되었습니다11.
후속 라운드에 대한 입력으로 파지 디스플레이의 이전 라운드에 의해 유지 파지를 사용하면 약하게, 일시적으로 또는 우연히 결합된 바인더를 점차적으로 제거하여 좋은 바인더를 풍부하게 합니다. 4라운드와 5라운드에 의하면 이상적으로 표적 단백질의 결합 선호도를 입증하는 작고 구체적인 펩티드 서열 집합을 향한 명확한 편견이 있을 것이다.
이 프로토콜은 UbV 라이브러리에서 사용하도록 최적화되었습니다. 이러한 단계는 일반적으로 다른 종류의 라이브러리(예: 펩타이드, 항체 등)에 적용될 수 있지만, 이러한 비UbV 라이브러리를 수용하기 위해 적응해야 할 가능성이 높습니다. 4.3.1 단계에서 언급했듯이, 파지 디스플레이를 진행하기 전에 도서관의 다양성과 농도를 알려야 한다. 이러한 라이브러리 특성의 결정 방식에 대한 자세한 내용은 이 절차12에 사용되는 UbV 라이브러리를 만드는 데 사용되는 프로토콜을 참조하십시오.
파지 디스플레이 결과는 매우 명확컷이 될 수 있으며, 추가 특성화를 추구하기 위해 명백한 후보 바인더를 제시할 수 있다. 예를 들어, ELISA에서 측정한 바와 같이 매우 빈번하고 결합력이 상당히 높은 바인더는 추가 연구를 위한 명확한 후보자입니다. 그러나 특정 바인더의 빈도가 ELISA 데이터와 긍정적으로 상관관계가 없는 경우 흥미로운 바인더를 골라내는 방법에 대한 혼란이 있을 수 있습니다. 제공된 예제(그림 1)에서는 바인딩 선호도가 낮더라도 가장 일반적인 바인더와 바인딩 선호도가 높은 바인더의 조합을 선택하는 것이 좋습니다. ELISA 점수가 높은 드문 바인더는 파지 디스플레이 중 불안정으로 인해 일반적이지 않을 수 있으며, 이는 이 최종 데이터의 유병률에 부정적인 영향을 미칩니다. 따라서, 이들은 매우 빈번한 바인더만큼 조사 가치가있다.
격리된 파지 용액은 쉽게 오염될 수 있습니다. 다양 한 펩 티 드의 영역 을 측면에 프라이머를 사용 하 여 가능한 한 빨리 DNA 시퀀싱진행 하는 것이 좋습니다. 또 다른 대표적인 디스플레이 후 분석은 표적 단백질을 가진 바인더의 ELISA를 수행하는 것입니다. 또한, ELISA는 그들의 가능한 결합 모드의 대략적인 아이디어를 줄 수 있는 그들의 표적 단백질의 바인더 및 돌연변이/잘린 버전으로 수행될 수 있습니다. 파지 솔루션은 잠시 동안 앉아 있는 경우 어떤 실험에서 사용 하기 전에 잘 혼합 되어야 한다는 것을 주의 하는 것이 매우 중요 하다. 파지는 튜브의 벽에 흡착하거나 용액에서 정착 할 수 있으며 거짓 네거티브를 생성 할 수 있습니다.
이 절차를 수행하는 가장 시간 효율적인 방법은 그림 2에 설명되어 있습니다. 다음 날 후속 라운드에 대한 파지 입력을 성장하는 데 필요한 세균 문화를 준비하여 모든 라운드를 시작합니다. 이 문화가 성장하는 동안 코팅 된 플레이트를 차단 할 수 있습니다. 플레이트가 차단되는 동안 라이브러리(1라운드) 또는 파지 입력을 준비할 수 있습니다(후속 라운드용). 4라운드 당일에는 시드 문화를 준비할 필요가 없으므로 5라운드 당일에는 5라운드 이상의 선발을 계획하지 않는 한 다음 라운드의 파지 입력을 준비할 필요가 없습니다. 시간을 더 경제화하기 위해 제안된 labware 설정도 제공되었습니다(그림 3). 또한 파지 펠릿은 항상 구별되지 않으므로이 절차 중에 발생하는 일반적인 펠릿 모양의 사진이 제공되었습니다 (그림 4).
후속 라운드에 대한 입력을 준비하는 동안 파지를 펠릿하는 데 문제가 있는 경우, 새로운 파지가 커지는 동안 실험을 하루 동안 중단해야 할 수도 있다. 이러한 라운드에 대 한 입력에 대 한 튜브에 저장 된 파지로 돌아가서 복구 할 수 있습니다. 예를 들어, 세 번째 디스플레이에 필요한 파지는 어떤 이유로 펠릿렛할 수 없는 경우, 3라운드에 대한 400μL의 파지 입력이 포함된 "R3I" 튜브로 돌아갈 수 있다. 이것은 100 μL로 4 개의 우물을 코팅하는 경우에만 한 번만 반복 할 수 있습니다.
4~5라운드의 출력 파지의 티터는 일반적으로 106 ~108 PFU/mL 의 범위에 있습니다. 티터링이 관심이 없다면, 단순히 96 튜브 미니 문화 상자를 채우기 에 충분한 식민지를 갖는 것은 파지 다양성과 티터의 정확한 표현을 제공하기에 충분해야한다 반드시 중요하지 않습니다. 그러나 출력 파지의 티터가 낮고 더 많은 식민지가 원하는 경우, 파지는 5.3 단계를 반복하여 재증폭될 수 있다. 본질적으로, 파지는 원하는 선택 라운드에 대한 출력을 복용하여 증폭 될 수있다, 중간 로그 상 세포를 접종, 도우미 파지 와 카베니실린을 추가, 하룻밤 문화를 성장, 그리고 이전에 설명된 바와 같이 PEG 강수화를 통해 파지를 수확.
다른 디스플레이 방법이 존재하며 각 메서드는 파지 디스플레이에 비해 고유한 장점과 단점을 가지고 있습니다. 세포 표면 디스플레이와 같은 생체 내 디스플레이 방법에서 적절한 단백질 접이식 가능성을 높이고 번역 후 변형이 발생할 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 상당히 작은 라이브러리 크기를 사용 하 여 제약13 단백질을 다원적으로 표현. 다원적 발현은 새로운 바인더를 생성할 때 더 큰 관심사인 펩티드의 본질적인 친화력을 방해하고 마스크하는 열렬한 효과를 소개합니다. 파지 디스플레이는 단일 형 디스플레이에 맞게 조정되었기 때문에이 문제를 우회하여 진정으로 개선 된 친화성14,15,16을 가진 바인더 선택을 용이하게합니다. 다른 시험관 내 디스플레이 방법은 생체 내 디스플레이 방법의 한계에 의해 방해되지 않고 자신의 독특한 문제를 제시한다. 예를 들어, 리보솜 디스플레이는 더 큰 라이브러리(1013-14)17을 프로브하는 데 사용될 수 있지만, 선택의 출력은 파지 디스플레이의 파지 캡슐화된 DNA 출력보다 본질적으로 덜 안정되는 mRNA 분자의 형태로 된다18. mRNA/cDNA 디스플레이, 시스 활성 기반 디스플레이(CIS) 및 공유 항체 디스플레이(CAD)와 같은 다른 시험관내 디스플레이 방법은 효율성, 안정성 및 불일치에 대한 문제점을 입증하였다19,20,21,22,23.
파지 디스플레이 자체는 세균 변환의 효율성에 의해 제한되는 라이브러리 크기에 의해 제한되고 파지 / 세균 성장을 방해하는 서열 라이브러리를 허용하지 않음으로써, 그러나 일반적으로, 이러한 한계는 무시할 수 있으며, 파지 디스플레이는 대상 단백질의 매우 구체적이고 강력한 바인더를 생산하는 데 성공했다2,5,10,24, 25. 이것은 새로운 치료법을 개발하기 위해 의학 연구에서 활용 될뿐만 아니라 단백질과 효소 특성을 해명하고 중요한 생물학적 경로에 관련된 단백질 상호 작용에 대해 자세히 알아볼 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
유비퀴틴 변종 기술은 닥터 Sachdev Sidhu (토론토 대학)의 실험실에서 고안되었습니다. WZ는 현재 인간 및 미생물군유전체 프로그램의 CIFAR 아즈리엘리 글로벌 학자입니다. 이 연구는 WZ (RGPIN-2019-05721)에 수여 NSERC 디스커버리 보조금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
References
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