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Biochemistry

Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

Ubiquitinierung ist eine kritische posttranslationale Proteinmodifikation, deren Dysregulation mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Phagenanzeige verwendet werden kann, um neuartige Ubiquitin-Varianten zu isolieren, die die Aktivität von E3-Ligasen binden und modulieren können, die die Spezifität, Effizienz und Muster der Ubiquitinierung steuern.

Abstract

Ubiquitin ist ein kleines 8,6 kDa-Protein, das ein Kernbestandteil des Ubiquitin-Proteasom-Systems ist. Folglich kann es an eine Vielzahl von Proteinen mit hoher Spezifität, aber geringer Affinität binden. Durch phagenanzeige können Ubiquitinvarianten (UbVs) so konstruiert werden, dass sie eine verbesserte Affinität gegenüber Wildtyp-Ubiquitin aufweisen und die Bindungsspezifität an Zielproteine beibehalten. Die Phagenanzeige verwendet eine Phagemidenbibliothek, wobei das pIII-Mantelprotein eines filamentösen M13-Bakteriophagen (ausgewählt, weil es äußerlich auf der Phagenoberfläche angezeigt wird) mit UbVs verschmolzen wird. Spezifische Reste von menschlichem Wildtyp-Ubiquitin sind weich und randomisiert (d.h. es gibt eine Verzerrung hin zur nativen Wildtypsequenz), um UbVs zu erzeugen, so dass schädliche Veränderungen in der Proteinkonformation vermieden werden und gleichzeitig die Vielfalt eingeführt wird, die für die Förderung neuartiger Interaktionen mit dem Zielprotein erforderlich ist. Während des Phagenanzeigeprozesses werden diese UbVs exprimiert und auf Phagenmantelproteinen angezeigt und gegen ein Protein von Interesse geschwenkt. UbVs, die günstige Bindungswechselwirkungen mit dem Zielprotein aufweisen, bleiben erhalten, während schlechte Bindemittel weggespült und aus dem Bibliothekspool entfernt werden. Die zurückgehaltenen UbVs, die an das Phagenpartikel gebunden sind, das das entsprechende Phagemid des UbV enthält, werden eluiert, amplifiziert und konzentriert, so dass sie in einer weiteren Runde der Phagenanzeige gegen dasselbe Zielprotein geschwenkt werden können. Typischerweise werden bis zu fünf Runden Phagendarstellung durchgeführt, in denen ein starker Selektionsdruck gegen UbVs ausgeübt wird, die schwach und / oder promiskuitiv binden, so dass diejenigen mit höheren Affinitäten konzentriert und angereichert werden. Letztendlich werden UbVs, die eine höhere Spezifität und/oder Affinität für das Zielprotein aufweisen als ihre Wildtyp-Pendants, isoliert und können durch weitere Experimente charakterisiert werden.

Introduction

Das Verständnis der molekularen Details von Protein-Protein-Interaktionen ist entscheidend für die Abgrenzung der Signaltransduktionsmechanismen biologischer Prozesse, insbesondere solcher, die zu klinisch wichtigen Krankheiten beitragen. In den letzten Jahren wurde die Phagenanzeige als praktische und zugängliche Methode zur Isolierung von Proteinen/Peptiden mit deutlich verbesserter Bindung an ein gewünschtes Zielprotein1,2,3,4 eingesetzt, das wiederum als intrazelluläre Sonden für Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden kann.

Die Ubiquitinierung ist eine Kaskade enzymatischer Aktivitäten (E1-aktivierendes Enzym → E2-konjugierendes Enzym → E3-Ligasen), die Ubiquitin (Ub) kovalent an Proteinsubstrate konjugieren, um sie für den Abbau oder die Vermittlung von Zellsignaländerungen anzusprechen. Darüber hinaus katalysieren Deubiquitinasen die Entfernung von Ubiquitin aus Proteinen. Daher gibt es in Zellen Tausende von Ub-abhängigen Protein-Protein-Interaktionen, von denen die überwiegende Mehrheit eine gemeinsame Oberfläche mit geringer Affinität, aber hoher Spezifität erkennt, um schwache Wechselwirkungen durch große und vielfältige Oberflächen zu ermöglichen.

Ernst et al. führten Mutationen in bekannte Bindungsregionen von Ub ein, um zu sehen, ob sie die Bindungsaffinität für ein Protein von Interesse verbessern und gleichzeitig eine hohe Selektivität beibehalten könnten5. Es wurde eine kombinatorische Bibliothek von über 10 Milliarden (7,5 x 1010) Ub-Varianten (UbVs) mit Mutationen an Positionen über die Ub-Oberfläche entwickelt, die die bekannten Ub-Protein-Interaktionen vermitteln. Diese Bibliothek bestand aus Phagenmiden, die das M13-Bakteriophagen-pIII-Mantelprotein exprimieren, das zu diversifizierten UbVs fusioniert wurde. Daher können einzelne UbVs über das Mantelprotein bei der Expression auf der Phagenoberfläche dargestellt werden. Während des Auswahlprozesses werden Phagen, die UbVs mit erheblichen Bindungsinteraktionen mit dem Zielprotein aufweisen, in nachfolgenden Runden der Phagenanzeige zurückgehalten und angereichert, während Phagen mit UbVs, die schlecht an das Zielprotein binden, weggewaschen und aus dem Phagenpool entfernt werden. Die zurückgehaltenen Phagenpartikel enthalten das Phagemid, das ihrem angezeigten UbV entspricht, so dass sie nach der Isolierung sequenziert und weiter charakterisiert werden können.

Mit dieser Protein-Engineering-Strategie wurden UbV-Inhibitoren für humane Deubiquitinasen5 und virale Proteasen6 entwickelt. Wichtig ist, dass wir hemmende UbVs für menschliche E3-Ligasen der HECT-Familie erzeugt haben, indem wir die E2-Bindungsstelle entführt und UbVs aktiviert haben, die einen Ub-bindenden Exositen auf der HECT-Domäne besetzen7. Wir können auch monomere E3 der RING-Familie hemmen, indem wir auf die E2-Bindungsstelle abzielen und eine UbV-Dimerisierung induzieren, um den homodimeren RING E3s8 zu aktivieren. Bei Ring E3s mit mehreren Untereinheiten können UbVs eine Hemmung erreichen, indem sie auf die RING-Untereinheit abzielen (z. B. für APC/C-Komplex9) oder die Komplexbildung stören (z. B. für SCF E3s10). Insgesamt können UbVs genutzt werden, um Protein-Protein-Interaktionen im Ub-Proteasom-System (UPS) systematisch zu untersuchen, so dass wir biochemische Mechanismen von USV-Enzymen besser entschlüsseln und funktionelle Stellen für therapeutische Interventionen identifizieren und validieren können.

Das folgende Protokoll beschreibt, wie eine zuvor generierte Phagen-displayte UbV-Bibliothek verwendet wird, um auf ein Protein von Interesse abzuzielen, und wie die UbV-Bindemittel, die mit dem Zielprotein interagieren, durch aufeinanderfolgende Runden der Phagenanzeige angereichert werden.

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Protocol

1. Vorbereitung des Reagenzes

  1. PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung): Mischen Sie 50 ml 10x PBS-Lösung mit 450 ml hochreinem H2O. Sterilisieren Sie durch Filtration und lagern Sie es bei 4 ° C oder Raumtemperatur (~ 20-25 ° C).
  2. 10% BSA (Rinderserumalbumin): Langsam 1 g BSA zu 7 ml ultrareinem H2O hinzufügen und mischen, bis es vollständig gelöst ist (keine Klumpen). Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 10 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 °C.
  3. PB-Puffer (PBS ergänzt mit 1% BSA): Langsam 5 g BSA auf 400 ml hochreines H2O und 50 ml PBS geben und mischen, bis es vollständig gelöst ist (keine Klumpen). Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 500 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 °C.
  4. PBT-Puffer (PBS ergänzt mit 1% BSA und 0,05% Tween 20): Langsam 5 g BSA auf 400 ml hochreines H2O und 50 ml PBS geben und mischen, bis es vollständig gelöst ist (keine Klumpen). Fügen Sie 250 μL Tween 20 hinzu. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 500 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 °C.
  5. PT-Puffer (PBS ergänzt mit 0,05% Tween 20): Mischen Sie 1 ml Tween 20 mit 400 ml PBS. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 2 L beträgt. Sterilisieren Sie durch Filtration und lagern Sie es bei 4 °C oder Raumtemperatur (~20-25 °C).
  6. 2YT Brühe: 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt und 5 g NaCl auf 800 ml hochreines H2O geben und bis zur vollständigen Auflösung mischen (keine Klumpen). Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 1 L beträgt. Autoklavieren und bei Raumtemperatur (~20-25 °C) lagern.
  7. LB / Carb-Platten: Fügen Sie 12,5 g vorgefertigte LB-Mischung und 7,5 g Agar zu 400 ml H2O hinzu. Füllen Sie mit hochreinem H2O auf, bis das endgültige Volumen 500 ml beträgt, und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren. Stellen Sie sicher, dass Agar vollständig gelöst ist und warten Sie, bis es auf unter 60 °C abgekühlt ist. Fügen Sie 500 μL 100 mg ml Carbenicillin hinzu, mischen Sie gut und gießen Sie es in die Platte. Bei 4 °C lagern.
  8. LB/tet-Platten: 12,5 g vorgefertigte LB-Mischung und 7,5 g Agar auf 400 ml hochreines H2O geben. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 500 ml beträgt, und durch Autoklavieren sterilisieren. Stellen Sie sicher, dass Agar vollständig gelöst ist und warten Sie, bis es auf unter 60 °C abgekühlt ist. Fügen Sie 500 μL 10 mg ml Tetracyclin hinzu, mischen Sie gut und gießen Sie es in die Platte. Bei 4 °C lagern.
  9. 20% PEG (Polyethylenglykol)/2,5 M NaCl: 50 g PEG-8000 und 36,5 g NaCl auf 200 ml hochreines H2O geben.
    HINWEIS: Dies kann eine Weile dauern; Heizung kann helfen. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 250 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration oder Autoklavieren.
  10. 0,1 M HCl: Mischen Sie 20 mL 1 M HCl mit 180 mL ultrareinem H2O. Sterilisieren Sie durch Filtration und lagern Sie es bei Raumtemperatur (~ 20-25 ° C).
  11. 1 M Tris (pH 11,0): 6,1 g Tris-Base auf 40 ml hochreines H2O geben. Mit HCl auf 11,0 einstellen und mischen, bis Tris vollständig gelöst ist. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 50 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei Raumtemperatur (~20-25 °C).
  12. 100 mg/ml (1000x) Carbenicillin: 2 g des Carbenicillin-Dinatriumsalzes auf 20 mL hochreines H2O geben. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei -20 °C.
  13. 50 mg/ml (1000x) Kanamycin: 1 g Kanamycinsulfat auf 20 ml hochreines H2O geben. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei -20 °C.
  14. 10 mg/ml (1000x) Tetracyclin: 0,2 g Tetracyclinhydrochlorid zu 20 mL 70% Ethanol zugeben. Mischen, bis es vollständig aufgelöst ist. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei -20 °C.

2. Proteinzubereitung

  1. Bestimmen Sie die Konzentration des Zielproteinstocks in μM. Der bequemste Weg, die Proteinkonzentration zu beurteilen, besteht darin, die Absorption des Proteinbestands bei 280 nm zu messen. Wenn die Konzentration in mg/ml bekannt ist, wandeln Sie sie unter Verwendung des Molekulargewichts des Zielproteins in μM um. Eine Reihe von Methoden kann abhängig vom Protein von Interesse verwendet werden; Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion.
    HINWEIS: Wenn das Protein abgeschnitten (spezifische Proteindomäne/-motiv) oder markiert ist, denken Sie daran, diese Änderungen des Molekulargewichts bei der Umwandlung von mg/ml in μM zu berücksichtigen.
  2. Bereiten Sie drei Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift "rund 1", "rund 2/3" und "rund 4/5" vor.
    1. Berechnen Sie das Proteinvolumen, das notwendig ist, um es auf 1 μM in 800 μL PBS zu verdünnen, und aliquotieren Sie dieses Volumen in die Röhrchen, ohne PBS hinzuzufügen.
      HINWEIS: Wenn die Menge des verfügbaren Zielproteins gering ist, kann die Konzentration auf nur 0,25 μM gesenkt werden.

3. Vorbereitung auf die erste Auswahlrunde

  1. Bereiten Sie eine Samenkultur vor, um den Phageneintrag für die zweite Auswahlrunde zu kultivieren.
    1. Impfen Sie 5 ml 2YT/tet mit einer gut isolierten Escherichia coli-Kolonie und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C mit 200 U / min Orbitalschütteln.
  2. Beschichten Sie den Teller für die erste Auswahlrunde.
    1. Verdünnen Sie das Zielprotein im "runden 1" Röhrchen mit der entsprechenden Menge pbS und aliquot 100 μL in acht Vertiefungen einer 96-Well-Bindungsplatte (d. h. der Zielplatte).
      HINWEIS: Die Phagenanzeige kann für vier verschiedene Proteine gleichzeitig auf einer einzigen Platte durchgeführt werden, indem die Vertiefungen in den Ecken der Platte beschichtet werden.
    2. Optionale Kontrolle: Wenn das Zielprotein markiert ist, z. B. mit GST oder MBP (Maltose Binding Protein), beschichten Sie acht Vertiefungen in einer anderen 96-Well-Bindungsplatte mit 100 μL einer 1 μM-Lösung, die das entsprechende Epitop-Tag enthält. Dies wird verwendet, um unerwünschte Phagen zu entfernen, die unspezifisch an das Tag binden.
    3. Platte(n) über Nacht bei 4 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln schütteln.

4. Auswahlrunde

  1. Bereiten Sie die Eingabe der zweiten Runde vor.
    1. Impfen Sie 30 ml 2YT/tet mit 200 μL der Samenkultur aus Schritt 3.1.
    2. Bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Dies dauert ungefähr drei Stunden.
  2. Zielplatte blockieren.
    1. Entfernen Sie die Beschichtungslösung von der Platte oder von beiden Platten, wenn eine Steuerplatte hergestellt wurde, indem Sie sie umkehren und über eine Spüle schütteln. Tätscheln Sie trocken auf Papiertücher.
    2. Fügen Sie 300 μL PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu.
    3. Entfernen Sie den PB-Puffer wie in Schritt 4.2.1 und fügen Sie weitere 200 μL PB-Puffer hinzu.
    4. Bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln inkubieren.
  3. Bereiten Sie die Phagenbibliothek vor.
    1. Tauen Sie die Phagenbibliothek auf Eis auf und verdünnen Sie sie auf das 100-fache der Bibliotheksvielfalt in PBS. Wenn beispielsweise die Bibliotheksvielfalt 1 x 1010 und die Bibliothekskonzentration 1 x 1013 beträgt, verdünnen Sie die Bibliothek so, dass die Konzentration 1 x 1012 beträgt. Verdünnen Sie die hier verwendeten Bibliotheken 10-fach in PBS, indem Sie 1 ml der Bibliothek mit 9 ml PBS kombinieren.
      HINWEIS: Die Vielfalt der Bibliothek sollte bei der Erstellung der Bibliothek festgestellt worden sein und kann nicht ohne weiteres beurteilt werden. Die Bibliothekskonzentration kann durch Impfung von E. coli-Zellen in der mittleren Log-Phase (OD600 0,6Equation 1 - 0,8) und Beschichtung auf LB / Carb bestimmt werden.
    2. Fügen Sie 1/5 Volumen PEG/NaCl hinzu. Fügen Sie beispielsweise für 10 ml der zuvor verdünnten Bibliothek 2 ml PEG/NaCl hinzu.
    3. 30 Min auf Eis inkubieren.
    4. Zentrifugiere bei 11.000 x g für 30 min bei 4 °C, verwerfe den Überstand und rezentriere für 2 min, um den verbleibenden Überstand abzureißen.
      HINWEIS: Legen Sie das Rohr beim zweiten Mal in die gleiche Ausrichtung in den Rotor, als es das erste Mal war, um das Pellet an der gleichen Stelle zu halten, so dass es leichter zu sehen ist.
    5. Resuspenieren Sie das Phagenpellet vorsichtig in 1 ml PBT pro Protein. Für vier Proteine resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml PBT.
      HINWEIS: Versuchen Sie, das Pellet nicht zu berühren und keine Luftblasen einzuführen.
  4. Zeigen Sie den Phagen dem Zielprotein (den Zielproteinen) an.
    1. Optionale Steuerung: Fügen Sie 100 μL Phagenbibliothek zu jeder beschichteten Vertiefung in der Steuerplatte hinzu. Bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln inkubieren und die Bibliothek von der Steuerplatte auf die Zielplatte übertragen. Überspringen Sie Schritt 4.4.2.
    2. Entfernen Sie den PB-Puffer von der Zielplatte wie in Schritt 4.2.1 und fügen Sie 100 μL der Phagenbibliothek zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu.
    3. Bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln inkubieren.
  5. Elute runde einphage.
    1. Entfernen Sie die Phagenbibliothek und waschen Sie die beschichteten Vertiefungen viermal mit PT-Puffer. Drehen Sie den Teller um und klopfen Sie auf ein Papiertuch, um die letzten Tropfen zu entfernen.
      HINWEIS: Wenn mehrere Zielproteine auf einer Platte beschichtet sind, versuchen Sie, den Fluss aller nachfolgenden Lösungen zwischen den Vertiefungen zu minimieren.
    2. Fügen Sie 100 μL 0,1 M HCl zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min mit 300 U / min Orbitalschütteln.
    3. Neutralisieren Sie den pH-Wert, indem Sie 12,5 μL 1 M Tris-HCl (pH 11) zu jeder beschichteten Vertiefung hinzufügen.
    4. Bündeln Sie den eluierten Phagen aus allen 8 Vertiefungen in einem einzigen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Während des Transfers auf und ab pipettieren, um die Lösungen homogen zu machen und die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen abzusaugen.
    5. 10% BSA zum gepoolten eluierten Phagen bis zu einer Endkonzentration von 1% geben. Für ein typisches rundes Elutionsvolumen von 950 μL fügen Sie 95 μL 10% BSA hinzu. Bei 4 °C lagern. Dies ist die runde eins Ausgabe.

5. Vorbereitung auf nachfolgende Auswahlrunden

  1. Bereiten Sie eine Samenkultur vor, um den Phageneintrag für die nächste Auswahlrunde wie in Schritt 3.1 zu kultivieren.
  2. Beschichten Sie die Platte für die dritte Auswahlrunde wie in Schritt 3.2 mit den unten aufgeführten Änderungen.
    1. Beschichten Sie nur vier Vertiefungen pro Protein in einer 96-Well-Bindungsplatte. Verwenden Sie die Hälfte des Inhalts der "runden 2/3" oder "runden 4/5" Rohre für die entsprechende Runde. Verdünnen Sie den Inhalt dieser Röhrchen nach Bedarf, um zu vermeiden, dass sich Proteine aus der Lösung absetzen.
  3. Bereiten Sie die Phageneingabe für die nächste Auswahlrunde vor.
    1. Verwenden Sie die Hälfte des Round-One-Ausgangs aus Schritt 4.5.5, um 3 ml Mid-Log-Phasenzellen aus Schritt 4.1 zu impfen. Für einen typischen Round-One-Ausgang impfen Sie mit 500 μL des Ausgangs.
    2. Bei 37 °C für 30 min mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.
    3. M13K07 Helferphagen in eine Endkonzentration von 1 x 1010 PFU/ml geben.
    4. Bei 37 °C für 1 h mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.
    5. Übertragen Sie die gesamten 3 ml Kultur auf 30 ml 2YT / Carb / kan. Über Nacht bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln wachsen.
    6. Am nächsten Tag wird die Kultur in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 11.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zellen auszufällen.
    7. Den Überstand in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen und mit 8 ml PEG/NaCl mischen und 10 min auf Eis inkubieren.
    8. Zentrifugiere bei 11.000 x g für 10 min bei 4 °C, verwerfen den Überstand und zentrifugieren erneut für 2 min.
      HINWEIS: Legen Sie das Rohr beim zweiten Mal in die gleiche Ausrichtung in den Rotor, als es das erste Mal war, um das Pellet an der gleichen Stelle zu halten, so dass es leichter zu sehen ist.
    9. Resuspendieren Sie das Phagenpellet in 800 μL PBT, so dass es vollständig homogen ist und keine Klumpen sichtbar sind.
    10. Die Phagenlösung in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 16.200 x g für 4 min bei 4 °C auf Pelletablagerungen zentrifugieren.
    11. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist der Input für die nächste Auswahlrunde.
  4. Optional: Titer der Ein- und Ausgangslösungen.
    1. Verwenden Sie 500 μL einer E. coli-Samenkultur , um 5 ml 2YT/tet zu impfen und bei 37 °C mit 200 U / min orbitalem Schütteln zu inkubieren, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Dies dauert ca. 1 h.
    2. Verdünnen Sie Phagen-Input/Output-Lösungen auf 10-3 - 10-5 in PBS und fügen Sie 10 μL jeder Verdünnung zu 90 μL kultivierter Zellen hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie sofort verdünnte Phagenlösungen, da Phagen im Laufe der Zeit an die Tube adsorbieren und Transformationen falsch negative Ergebnisse erzeugen können.
    3. Bei 37 °C für 20 min mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.
    4. Platte 5 μL auf separaten LB/Carb-Platten.
      HINWEIS: Die plattierte Menge ist variabel und hängt von früheren Ergebnissen / persönlichen Vorlieben ab.

6. Nachfolgende Auswahlrunden

  1. Führen Sie alle nachfolgenden Runden zusammen mit der Vorbereitung durch, wie in den Schritten 3 bzw. 4 ausgeführt, mit den unten aufgeführten Unterschieden.
    1. Verwenden Sie die in der vorherigen Runde erzeugte Eingabe als Phagenquelle anstelle einer Bibliothek. Beschichten Sie 4 Vertiefungen pro Zielprotein mit 100 μL des Phageneintrags aus der vorherigen Runde. Verbleibende Phageneingänge bei 4 °C lagern.
    2. Machen Sie den Waschschritt in 4.5.1 mit jeder Auswahlrunde strenger. Runde eins erfordert 4 Mal Waschen, Runde zwei erfordert 6 Mal, Runde drei erfordert 8 Mal und Runde vier und Fünf erfordern beide 10 Mal Waschen.
    3. Reduzieren Sie einige Volumina im Vergleich zu denen, die in Runde eins verwendet werden, da nachfolgende Runden nur vier statt acht Vertiefungen beschichten. Zum Beispiel werden in Schritt 4.5.5 nur 45 μL von 10% BSA zum Phagenausgang hinzugefügt, und in Schritt 5.3.1 werden nur 250 μL des Phagenausgangs zur Impfung von Zellen verwendet.

7. Nachauswahlbearbeitung und Phagenisolierung

  1. Titeren Sie die Ein- und Ausgangslösungen für die Runden vier und fünf.
    1. Wenn nicht bereits in Schritt 5.4 ausgeführt, befolgen Sie die gleichen Schritte, um die Runden vier und fünf Phagenausgänge zu titern, wobei idealerweise ein Bereich von 30-300 Kolonien über einige Platten erzeugt wird.
  2. Kultivieren und isolieren Sie Phagen.
    1. Aliquot 450 μL 2YT/Carb/M13K07 in jede Tube einer 96 Mini Tuben Kulturbox.
    2. Wählen Sie gut isolierte Kolonien aus einer der Platten aus Schritt 7.1, um jedes Röhrchen zu impfen.
      HINWEIS: Verwenden Sie die obere Hälfte des Feldes für die Ausgabe der vierten Runde und die untere Hälfte für die Ausgabe der fünften Runde.
    3. Über Nacht bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.
    4. Zentrifuge bei 1.200 x g für 10 min bei 4 °C.
    5. Übertragen Sie so viel Überstand wie möglich in eine neue 96 Mini-Röhrenkulturbox, ohne das Zellpellet zu stören, und entsorgen Sie das alte. Bei 4 °C lagern.
    6. Übertragen Sie aus der neuen Box 100 μL von jedem Röhrchen auf eine 96 Well non-binding Platte, die 100 μL 50% Glycerin in allen Vertiefungen enthält. Gut mischen und bei -80 °C als Backup-Bestand lagern.

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Representative Results

Bindemittel, die aus der Phagenanzeige hergestellt werden, können auf vielfältige Weise verifiziert und analysiert werden. Es wird empfohlen, zuerst mit der Sequenzierung des Phagen mit Primern fortzufahren, die das diversifizierte Insert in der Phagemidenbibliothek flankieren. Ein ideales Phagen-Display-Experiment zeigt eine klare Verzerrung zu mehreren Sequenzen (Abbildung 1). Andere Sequenzen werden ebenfalls vorhanden sein, jedoch mit einer niedrigeren Anzahl, die eher als Hintergrundgeräusche erscheinen. In dem bereitgestellten Beispiel, in dem die Phagenanzeige zwischen Ubiquitin-Varianten (UbVs) und Wildtyp UBE4B durchgeführt wurde, gibt es eine besondere Verzerrung gegenüber den Sequenzen # 1-4. Ein Python-Beispielskript zum Organisieren und Analysieren von Sequenzierungsdateien wurde bereitgestellt ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). Um die Signifikanz der Bindemittel zu bestätigen, können enzymgebundene Immunosorbent-Assays (ELISA) als schnelles Maß für die relative Bindungsaffinität zum Wildtyp-Zielprotein, zum mutierten Zielprotein sowie zu Off-Target-Proteinen verwendet werden (Abbildung 1). Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen den neuen Bindemitteln und dem Wildtyp-bindenden Protein, auf dem die neuen Bindemittel basierten, können bestimmt werden, indem die ELISA-Absorption der Bindemittel auf die des Wildtypproteins (nicht gezeigt) oder anderer Proteine, die keine nennenswerte Bindung mit dem Zielprotein aufweisen, normalisiert wird (Abbildung 1). Dieses Beispiel zeigt die Tendenz der angereicherten Sequenzen, eine höhere Bindungsaffinität für das Zielprotein zu haben. Ein Python-Beispielskript zum Organisieren und Analysieren von Sequenzierungsdateien wurde bereitgestellt ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Zusätzlich wurde ein Python-Beispielskript speziell für die Analyse von UbV-Ergebnissen bereitgestellt ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Im Idealfall besitzen Bindersequenzen, die zahlreicher sind, eine höhere relative Bindungsaffinität als weniger zahlreiche Sequenzen, bei denen es sich vermutlich um Hintergrundgeräusche handelt. Es ist möglich, dass instabile Bindemittel in der Anzahl niedrig sind, aber eine nennenswerte Bindung durch ELISAs aufweisen. Diese Bindemittel sollten weiter untersucht werden, um festzustellen, ob es sich bei den ELISA-Scores um Artefakte handelt oder ob es sich tatsächlich um Bindemittel handelt, die einer weiteren Charakterisierung würdig sind.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse für eine Selektion einer Ubiquitin-Variante (UbV) gegen UBE4B. (A) UbVs wurden von höchster bis niedrigster Frequenz (Zählungen) geordnet. Sequenzen stellen die diversifizierte Ubiquitinregion im UbV mit allen randomisierten Resten dar (insbesondere die Reste 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 und 70-78). Alle ELISA-Absorptionen wurden gegen 96 gemittelte BSA-ELISA-Scores und 96 gemittelte GST-ELISA-Scores normalisiert. Dunkleres Grün steht für eine stärkere relative Bindung. GST wurde als Kontrolle für die unspezifische Bindung aufgenommen, da das Zielprotein GST-markiert ist. (B) Grafische Zusammenfassung der ELISA-Ergebnisse aus Panel A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Empfohlene Reihenfolge der Schritte für die Durchführung der Phagenanzeige. Gestrichelte Linien zeigen Prozesse an, die auf den nächsten Tag oder vom Vortag übertragen werden. Alle nachfolgenden Runden nach Der dritten Runde verlaufen ähnlich wie die dritte Runde, mit Ausnahme der fünften Runde, in der keine Vorbereitung auf die Phageneingabe erforderlich ist, es sei denn, es werden mehr Runden durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Empfohlene Laborware und Etiketten zum Einrichten eines Phagen-Display-Experiments. Zweck und relevante Schritte im Protokoll werden angegeben. R: rund; I: Eingabe; O: Ausgabe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Auftreten typischer Pellets, die während des Phagenanzeigeverfahrens auftreten. Das Phagenbibliothekspellet präsentiert sich als Streifen entlang der Seite des Röhrchens und kann rezitriugiert werden, um das Pellet im Boden des Röhrchens zu konzentrieren. Phageneinsatzpellets und Trümmerpellets erscheinen typischer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Python-Skripts. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Wie in Schritt 2.1 (Proteinpräparation) erwähnt, kann eine Vielzahl von Methoden verwendet werden, um die Proteinkonzentration zu bewerten, und jede hat einzigartige Vor- und Nachteile, basierend auf dem spezifischen Zielprotein, das für die Phagenanzeige verwendet wird. Eine Quelle detaillierter Beschreibungen und Protokolle für gängige Methoden wurde bereits bereitgestellt11.

Die Verwendung des Phagen, der von einer vorherigen Phagenrunde zurückgehalten wird, als Eingabe für eine nachfolgende Runde bereichert die guten Bindemittel, indem sie allmählich Bindemittel entfernt, die schwach, vorübergehend oder zufällig gebunden sind. In den Runden vier und fünf wird es idealerweise eine klare Tendenz zu einem kleinen und spezifischen Satz von Peptidsequenzen geben, was die Bindungspräferenzen des Zielproteins zeigt.

Dieses Protokoll wurde für die Verwendung mit einer UbV-Bibliothek optimiert. Während diese Schritte im Allgemeinen für andere Arten von Bibliotheken (z. B. Peptid, Antikörper usw.) gelten können, müssen sie wahrscheinlich angepasst werden, um solche Nicht-UbV-Bibliotheken aufzunehmen. Wie in Schritt 4.3.1 erwähnt, sollten die Vielfalt und Konzentration der Bibliotheken bekannt sein, bevor mit der Phagenanzeige fortgefahren wird. Weitere Informationen zur Bestimmung dieser Bibliotheksattribute finden Sie im Protokoll zum Erstellen der in diesem Verfahren verwendeten UbV-Bibliotheken12.

Die Ergebnisse der Phagendarstellung können sehr eindeutig sein und offensichtliche Kandidatenbindemittel für die weitere Charakterisierung darstellen. Zum Beispiel sind Bindemittel, die sowohl hochhäufig sind als auch eine signifikant höhere Bindung aufweisen, gemessen durch ELISA, klare Kandidaten für weitere Studien. Wenn jedoch die Häufigkeit eines bestimmten Bindemittels nicht positiv mit den ELISA-Daten korreliert, kann dies zu Verwirrung darüber führen, wie interessante Bindemittel herausgegriffen werden können. Im bereitgestellten Beispiel (Abbildung 1) wird empfohlen, eine Kombination aus den gängigsten Bindemitteln auszuwählen, auch wenn sie eine geringe Bindungsaffinität aufweisen, und solchen mit höherer Bindungsaffinität, auch wenn sie selten auftreten. Seltene Bindemittel mit hohen ELISA-Werten sind aufgrund von Instabilität während der Phagenanzeige möglicherweise nicht so häufig, was ihre Prävalenz in diesen endgültigen Daten negativ beeinflussen würde. Daher sind diese ebenso untersuchenswert wie die hochfrequenten Bindemittel.

Isolierte Phagenlösungen können leicht kontaminiert werden. Es wird empfohlen, so schnell wie möglich mit der DNA-Sequenzierung fortzufahren, wobei Primer verwendet werden, die die Region des diversifizierten Peptids flankieren. Eine weitere typische Post-Display-Analyse ist die Durchführung von ELISAs der Bindemittel mit ihrem Zielprotein. Zusätzlich können ELISAs mit den Bindemitteln und mutierten/abgeschnittenen Versionen ihrer Zielproteine durchgeführt werden, was eine grobe Vorstellung von ihrem wahrscheinlichen Bindungsmodus geben kann. Es ist sehr wichtig zu beachten, dass Phagenlösungen vor der Verwendung in jedem Experiment gut gemischt werden sollten, wenn sie eine Weile gesessen haben. Der Phagen kann an den Wänden der Röhre adsorbieren oder sich aus der Lösung absetzen und falsch negative Ergebnisse produzieren.

Die zeiteffizienteste Durchführung dieses Verfahrens ist in Abbildung 2 dargestellt. Beginnen Sie jede Runde mit der Vorbereitung der Bakterienkultur, die für das Wachstum des Phageneintrags für die nachfolgende Runde am nächsten Tag erforderlich ist. Während diese Kultur wächst, können beschichtete Platten blockiert werden. Während die Platten blockiert werden, kann die Bibliothek vorbereitet werden (für die erste Runde) oder die Phageneingabe (für nachfolgende Runden). Am Tag der vierten Runde ist es nicht notwendig, eine Samenkultur vorzubereiten, und so besteht am Tag der fünften Runde keine Notwendigkeit, Vorbereitungen für den Phagen-Input der nächsten Runde zu treffen, es sei denn, man beabsichtigt, mehr als fünf Auswahlrunden durchzuführen. Um weiter Zeit zu sparen, wurde auch eine vorgeschlagene Labware-Einrichtung bereitgestellt (Abbildung 3). Darüber hinaus sind Phagenpellets nicht immer unterscheidbar, so dass Bilder von typischen Pelleterscheinungen, die während dieses Verfahrens auftreten, bereitgestellt wurden (Abbildung 4).

Wenn es Probleme mit der Pelletierung des Phagen während der Vorbereitung des Inputs für eine nachfolgende Runde gibt, muss das Experiment möglicherweise für einen Tag gestoppt werden, während neue Phagen gezüchtet werden. Diese können zurückgewonnen werden, indem sie zu dem phagen zurückkehren, der in den Röhren für die Eingabe für diese Runde gespeichert ist. Wenn beispielsweise der für die dritte Anzeigerunde erforderliche Phagen aus irgendeinem Grund nicht pelletiert werden kann, können Sie zum "R3I" -Röhrchen zurückkehren, das 400 μL Phageneingabe für die dritte Runde enthält. Dies kann nur einmal wiederholt werden, wenn vier Vertiefungen mit 100 μL beschichtet werden.

Der Titer des Ausgangsphagen für die Runden vier bis fünf liegt typischerweise im Bereich von 106 bis 108 PFU/ ml. Wenn das Titeren nicht von Interesse ist, sollte es ausreichen, einfach genügend Kolonien vorhanden zu haben, um eine Mini-Kulturbox mit 96 Tuben zu füllen, um eine genaue Darstellung der Phagenvielfalt zu erhalten, und der Titer spielt nicht unbedingt eine Rolle. Wenn jedoch der Titer des Ausgangsphagen niedrig ist und mehr Kolonien gewünscht werden, kann der Phagen durch Wiederholung von Schritt 5.3 erneut verstärkt werden. Im Wesentlichen kann der Phagen neu vermehrt werden, indem die Ausgabe für die gewünschte Selektionsrunde genommen wird, Zellen der mittleren Log-Phase geimpft, Helferphagen und Carbenicillin hinzugefügt werden, die Kultur über Nacht gezüchtet und der Phagen über PEG-Fällung geerntet wird, wie zuvor beschrieben.

Es gibt andere Anzeigemethoden, und jede hat ihre eigenen Vor- und Nachteile in Bezug auf die Phagenanzeige. In-vivo-Display-Methoden, wie die Zelloberflächendarstellung, können die Wahrscheinlichkeit einer ordnungsgemäßen Proteinfaltung erhöhen und auch posttranslationale Modifikationen ermöglichen; Diese Methoden sind jedoch dadurch eingeschränkt, dass wesentlich kleinere Bibliotheksgrößen13 verwendet werden müssen und Proteine polyvalent exprimiert werden. Die polyvalente Expression führt zu Aviditätseffekten, die die intrinsische Affinität des Peptids stören und maskieren, was bei der Erzeugung neuartiger Bindemittel von größerem Interesse ist. Die Phagenanzeige umgeht dieses Problem, da sie für die monovalente Anzeige angepasst wurde, wodurch die Auswahl von Bindemitteln mit wirklich verbesserten Affinitäten erleichtert wird14,15,16. Andere In-vitro-Display-Methoden werden ebenfalls nicht durch die Einschränkungen von In-vivo-Display-Methoden behindert, sondern stellen ihre eigenen einzigartigen Herausforderungen dar. Zum Beispiel kann die Ribosomenanzeige verwendet werden, um größere Bibliotheken zu untersuchen (1013-14)17, jedoch liegt die Ausgabe der Selektionen in Form von mRNA-Molekülen vor, die von Natur aus weniger stabil sind als die phagenverkapselte DNA-Ausgabe von Phagenanzeige18. Andere In-vitro-Display-Methoden wie mRNA/cDNA-Display, cis-Aktivitäts-basierte Anzeige (CIS) und kovalente Antikörper-Anzeige (CAD) haben Probleme mit Effizienz, Stabilität und Inkonsistenz gezeigt19,20,21,22,23.

Die Phagenanzeige selbst ist dadurch begrenzt, dass die Bibliotheksgrößen durch die Effizienz der bakteriellen Transformation eingeschränkt sind und bibliotheken mit Sequenzen, die das Phagen- / Bakterienwachstum beeinträchtigen, nicht zugelassen werden16, aber im Allgemeinen sind diese Einschränkungen vernachlässigbar, und die Phagenanzeige war erfolgreich bei der Herstellung hochspezifischer und potenter Bindemittel von Zielproteinen2,5,10,24, 25. Auflage. Dies kann nicht nur in der medizinischen Forschung genutzt werden, um neue Therapeutika zu entwickeln, sondern auch, um Protein- und Enzymeigenschaften aufzuklären und mehr über Proteininteraktionen zu erfahren, die an wichtigen biologischen Signalwegen beteiligt sind.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Die Ubiquitin-Varianten-Technologie wurde im Labor von Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto) entwickelt. WZ ist derzeit CIFAR Azrieli Global Scholar im Humans & The Microbiome Program. Diese Forschung wurde durch NSERC Discovery Grants finanziert, die dem WZ verliehen wurden (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

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References

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Biochemie Heft 174
Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen
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Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

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