Summary
תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.
Abstract
מיקרוגליה, כמקרופאגים תושבי המוח, הם חיוניים למספר תפקודים, כולל תגובה ללחץ סביבתי והומאוסטזיס מוחי. מיקרוגליה יכולה לאמץ ספקטרום גדול של פנוטיפים של הפעלה. יתר על כן, מיקרוגליה התומכת בפנוטיפ מרובה דלקת קשורה הן להפרעות נוירו-התפתחותיות והן להפרעות נוירודגנרטיביות. מחקרים במבחנה נמצאים בשימוש נרחב במחקר להערכת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות בסוגי תאים ספציפיים. בהקשר זה חקר הפעלה מיקרוגליאלית ודלקת עצבית במבחנה באמצעות תרביות מיקרוגליאליות ראשוניות רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מיקרוגליאליים או מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע. עם זאת, השימוש בכמה תרבויות ראשוניות עלול לסבול מחוסר שכפול. פרוטוקול זה מציע שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים. הפעלה מיקרוגליאלית באמצעות מספר גירויים לאחר 4 שעות ו-24 שעות על ידי כימות ביטוי mRNA ובדיקה פאגוציטית של חרוזי Cy3 מודגמת כאן. העבודה הנוכחית צפויה לספק טכניקה הניתנת לשחזור בקלות לבידוד מיקרוגליה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית משלבי התפתחות צעירים.
Introduction
מיקרוגליה (Microglia) הם תאים דמויי מקרופאגים של מערכת העצבים המרכזית, שמקורם במבשרים אריתרופוייטיים של שק החלמון הנודדים לנוירואפיתל במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת1. מלבד תפקודי החסינות שלהם, הם גם ממלאים תפקיד משמעותי במהלך התפתחות עצבית, במיוחד עבור סינפטוגנזה, הומאוסטזיס עצבי ומיאלינציה2. בבגרות, מיקרוגליה מפתחת תהליכים תאיים ארוכים כדי לסרוק את הסביבה ברציפות. במקרה של קרעים הומאוסטזיס כגון פגיעה מוחית או מחלת מוח, מיקרוגליה יכולה לשנות את המראה המורפולוגי שלהם כדי לאמץ צורה אמבואידית, לנדוד לאזור הפגוע, להגדיל ולשחרר גורמים ציטולוגיים או ציטוטוקסיים רבים. למיקרוגליה יש מצבי הפעלה הטרוגניים בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם ולסוג הפציעהשספג 3,4,5. במחקר זה, מצבי הפעלה אלה מסווגים באופן נרחב לשלושה פנוטיפים שונים: פרו-דלקתיים/פאגוציטיים, נוגדי דלקת ואימונו-רגולטוריים, תוך התחשבות בכך שבמציאות, המצב צפוי להיות מורכב יותר6.
חקר ההפעלה המיקרוגליאלית in vivo וסינון אחר אסטרטגיות הגנה עצבית בשלבים מוקדמים של התפתחות המוח יכול להיות מאתגר בשל (1) שבריריותם של בעלי חיים לפני הגמילה ו-(2) המספר הנמוך של תאים מיקרוגליאליים. לכן מחקרים במבחנה על מיקרוגליה נמצאים בשימוש נרחב לרעילות 7,8,9, אסטרטגיות הגנה עצבית5,10,11,12,13,14, ותרביות משותפות 15,16,17,18,19,20,21 . מחקרים במבחנה יכולים להשתמש בקווי תאים מיקרוגליאליים, במיקרוגליה שמקורה בתאי גזע או בתרבית מיקרוגליה ראשונית. לכל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות, והבחירה תלויה בשאלה הביולוגית הראשונית. היתרונות של שימוש בתרביות מיקרוגליה ראשוניות הם הרקע הגנטי ההומוגני, היסטוריה נטולת פתוגנים ושליטה בזמן שבו המיקרוגליה מגורה לאחר מות בעלי חיים22.
במהלך השנים פותחו שיטות שונות (ציטומטריה של זרימה, טלטול או תיוג מגנטי) לגידול מיקרוגליה ראשונית ממכרסמים, הן יילודים והן בוגרים 23,24,25,26,27,28,29. בעבודה הנוכחית, בידוד מיקרוגליה מגורי עכברים מבוצע באמצעות טכנולוגיית מיון תאים המופעלים על ידי מגנט שתוארה קודם לכן באמצעות CD11b 25,27,29 מצופה מיקרובאד נגד עכברים. CD11b הוא קולטן אינטגרין המתבטא על פני השטח של תאים מיאלואידים, כולל מיקרוגליה. כאשר אין אתגר דלקתי במוח, כמעט כל תאי CD11b+ הם מיקרוגליה30. בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו בעבר 23,24,25,26,27,28,29, הפרוטוקול הנוכחי מאזן ניתוחי הפעלה מיקרוגליאליים מיידיים ex vivo ותרבית מיקרוגליאלית ראשונית נפוצה במבחנה. לפיכך, מיקרוגליה (1) מבודדת ביום שלאחר הלידה (P)8 ללא הסרת מיאלין, (2) מבודדת ללא סרום, ו-(3) נחשפת ל-siRNA, miRNA, תרכובת פרמקולוגית ו/או גירויים דלקתיים רק 48 שעות לאחר בידוד המוח. כל אחד משלושת ההיבטים הללו הופך את הפרוטוקול הנוכחי לרלוונטי ומהיר. ראשית, השימוש במיקרוגליה ילדים מאפשר קבלת תאים בני קיימא דינמיים ותגובתיים בתרבית ללא צורך בצעד נוסף של דה-מיאלינציה שעשוי לשנות את תגובתיות המיקרוגליה במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי נועד להתקרב ככל האפשר לסביבה הפיזיולוגית של המיקרוגליה. ואכן, מיקרוגליה לעולם אינה נתקלת בסרום, וגם פרוטוקול זה אינו דורש שימוש בסרום. יתר על כן, חשיפת מיקרוגליה כבר 48 שעות לאחר התרבית מונעת מהם לאבד את יכולותיהם הפיזיולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול אושר, וכל בעלי החיים טופלו על פי ההנחיות המוסדיות של המכון הלאומי למחקרי ביטחון לאומי (Inserm, צרפת). בידוד מגנטי של מיקרוגליה ממוחם של 24 גורי עכברי OF1 (זכר ונקבה כאחד) ב-P8, המחולק לצלחות של 6 בארות, 12 בארות, או 96 בארות. העבודה הניסיונית בוצעה מתחת למכסה מנוע כדי לשמור על תנאים סטריליים.
1. הכנת תמיסות סטריליות לבידוד ותרבית תאים
- הכן 50 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס ללא Ca 2+ ו-Mg2+ (HBSS-/-) מתמיסת 10x הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- הכינו תערובת דיסוציאציה בהתאם להרכב המופיע בטבלה 1 באמצעות ערכת דיסוציאציה מסחרית של רקמות (ראו טבלת חומרים).
- הכן 200 מ"ל של HBSS אחד עם Ca 2+ ו-Mg2+ (HBSS+/+) מפתרון 10x הזמין מסחרית.
- הכן 200 מ"ל של 1x PBS + 0.5% BSA (המכונה מאגר מיון תאים).
- הכן CD11b-microads לפי טבלה 2.
- הכינו 500 מ"ל של מדיום תרבית ללא סרום מקרופאגים (SFM) + 1% של פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). לעשות aliquots של צינורות 50 מ"ל ולאחסן אותם ב 4 °C (60 °F). זה מכונה מדיום המיקרוגליה בהמשך הטקסט.
הערה: כל תמיסות הבידוד חייבות להיות מוכנות טריות בתנאים סטריליים ביום הניסוי ולהישמר על קרח. ניתן להכין מדיום של תרבית תאי מיקרוגליה, להתרומם בצינורות של 50 מ"ל, ולהישמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. אין צורך בסינון.
2. דיסקציה מוחית
- ערפו את ראשו של הגור באמצעות מספריים גדולים ללא הרדמה כללית קודמת.
- חתכו את העור מהצוואר לאף בעקבות התפר הסגיטלי (15-20 מ"מ) בעזרת מספריים קטנים (איור 1A-C).
- הכנס קצה מספריים קטן בתוך מגנום פורמן במקביל לגולגולת. חותכים מכל צד בזהירות לעיניים (איור 1D,E).
- חתכו בין העיניים עם מספריים קטנים כדי לנתק את הגולגולת והמוח מהראש (איור 1F).
- בעזרת שני מלקחיים, תפסו את הגולגולת קרוב לנורות חוש הריח וקרעו את הגולגולת בזהירות, תוך הקפדה שלא לפגוע במוח שמתחתיה (איור 1G-I).
- הסירו את המוח הקטן ואת הנורה האולפת בעזרת סכין גילוח וחתכו את המוח לשני חלקים (איור 1J).
- הניחו את חלקי המוח בצלחת פטרי המכילה 30-40 מ"ל של HBSS-/- (איור 1K).
3. דיסוציאציה מוחית ובידוד מיקרוגליאלי מגנטי
הערה: כל המניפולציות והחידושים של התאים חייבים להתבצע עם פיפטה של 1,000 μL בזהירות רבה. הפעלת פעולה מכנית גבוהה עלולה להפעיל או להרוג תאי מיקרוגליה.
- העבר 12 חתיכות מוח (~ 1.2 גרם) לכל צינור דיסוציאציה המכיל תערובת דיסוציאציה לפי טבלה 1. עבור 24 גורים היה צורך בארבע צינורות C (איור 2A-B).
- מניחים צינורות C על הדיסוציאטור (עם מצב חימום). הפעל את תוכנית NTDK הממוטבת בציוד בהתאם להוראת היצרן (איור 2D).
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 20 שניות (ב 4 מעלות צלזיוס) כדי לאסוף את כל התאים. השלם את הדיסוציאציה המכנית על-ידי פיפטה שלוש פעמים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 1,000 μL (איור 2E).
- מעבירים את התאים לארבעה צינורות 15 מ"ל + מסננים. שטפו את המסננים ב-10 מ"ל של HBSS+/+ (איור 2F).
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם 10 מ"ל של HBSS+/+ (איור 2G).
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם מאגר מיון של 6 מ"ל (שלב 1.4) (איור 2H).
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μL של תמיסת CD11b-microbead (שלב 1.5) לכל צינור והשהה מחדש בזהירות (איור 2I).
- לדגור את הצינורות במשך 15-20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. החזירו בזהירות את הכדור עם מאגר מיון של 6 מ"ל (איור 2I-J).
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם חיץ מיון של 8 מ"ל (איור 2K).
- עקוב אחר תוכנית POSSEL על המפריד (ראה טבלת חומרים) כדי להכין שמונה עמודות. העבר תאים 1 מ"ל על 1 מ"ל בעמודה. המתן עד שכל התאים יעברו לפני הוספת מ"ל נוסף. תאי CD11b+ אלוטים על צלחת אלוציה סטרילית עם מאגר מיון של 1 מ"ל (איור 2L).
- מאגר תאי CD11b+ בצינור חדש של 50 מ"ל (איור 2M).
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם 10 מ"ל של מדיום מיקרוגליה קרה (שלב 1.6) (איור 2N).
- ספירת תאי CD11b+ . ב-P8 יש להשיג ~650,000 תאים לכל מוח.
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, התאים נספרו באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים). - יש לתלות את התאים במדיום מיקרוגליה קרה לריכוז סופי של 650,000-700,000 תאים/מ"ל ולוותר על צלחות תרבית תאים.
הערה: לוחות 6 באר הם עבור כתם מערבי (2 מ"ל לכל באר); לוחות 12 הבאר מיועדים לניתוח RT-qPCR (1 מ"ל לבאר), ולוחות 96 הבאר מיועדים לבדיקה פאגוציטית (250 מיקרול לבאר); כל השלושה שימשו לעבודה זו. עם זאת, בכתב יד זה, התוצאות מניתוח הכתם המערבי אינן מוצגות, אך ניתן לבצע עם פרוטוקול זה. - מניחים את הצלחות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך הלילה. החלף את המדיום בזהירות עם פיפטה של 1,000 μL עם מדיום מיקרוגליה מחומם מראש.
- מניחים את הצלחות על 37°C עם 5% CO2 לילה לפני הגירוי.
הערה: בידוד מיקרוגליה מיותר מ-36 גורים ולאחר P9 אינו מומלץ. זה יגביר את הסיכון של זיהום והצטברות של פסולת תאים כדי להפעיל microglia.
4. גירויים תאיים
- הכינו ריאגנטים לגירוי לפי טבלה 3 באמצעות הריאגנטים הזמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים).
- הוסף את הנפח המתאים בכל מגורה היטב.
הערה: הנפח המתאים תלוי בריכוז הגירוי ובגודל הבאר. - מניחים את הצלחות על 37°C עם 5% CO2עד סוף הגירוי ב-6 שעות, 24 שעות או 48 שעות.
- לניתוח הכתם המערבי, שאפו את הסופר-נאטנט והוסיפו 50 מיקרון ליטר של חיץ תזה חלבונית (ראו טבלת חומרים) עם פיפטה. באמצעות טיפים, לגרד את החלק התחתון של הצלחת כדי לנתק את התאים lysed ולהעביר אותם 1.5 מ"ל צינורות. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.
הערה: ניתן לאחסן את לוחות התרבית במשך שנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס אם הסופר-נטנט שואף כראוי. - עבור ניתוח RT-qPCR 6,31, שאפו את הסופר-נטנט ואחסנו את לוחות התרבית ישירות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי mRNA (שלב 5).
- עבור הבדיקה הפאגוציטית, ראה שלב 6.
5. מיצוי mRNA וניתוח RT-qPCR
- בצע מיצוי RNA, RT-PCR ו- RT-qPCR בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). עיין בטבלה 4 עבור רצפי הפריימרים 5,6,31.
- בצע ניתוח RT-qPCR על-ידי ביצוע הדוחשפורסם בעבר 5.
6. בדיקה פאגוציטית
- לעורר את התאים ולבצע בדיקה phagocytic במהלך 3 השעות האחרונות של הגירוי. לדוגמה, עבור גירוי של 6 שעות, להתחיל את הבדיקה phagocytic לאחר 3 שעות של גירוי; ולגירוי של 12 שעות, התחל את הבדיקה הפאגוציטית 9 שעות לאחר תחילת הגירוי.
- חשב את מספר החרוזים הדרושים להכנה בהתחשב ביחס (1 תא: 50 חרוזים). עבור באר אחת של צלחת 96 באר, 8.1 x 106 חרוזים נדרשים. מכינים את תערובת החרוזים לפי טבלה 5.
הערה: מערבבים בזהירות את בקבוקון מלאי החרוזים לפני הוספתם לתערובת PBS/FBS. - דגירה במשך שעה אחת באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. מערבולת כל 10 דקות.
- חשב את נפח הפתרון כדי להוסיף לכל באר. מוסיפים את הפתרון ומדגרים במשך 3 שעות.
- שטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBS אחד. קרא את פליטת הפליטה הפלואורסצנטית ב-550 ננומטר (אורך גל פליטת Cy3).
7. בקרת איכות טוהר
- הערך את טוהר הבידוד המגנטי של CD11b על-ידי ציטומטריה של זרימה (FACS) (לפני ואחרי מיון תאים), ולאחר מכן בצע את RT-qPCR.
- לספור את התאים ולחזור במאגר FACS (PBS + 2 mM של EDTA + 0.5% של אלבומין בסרום בקר) על מנת לקבל דילול של 10 x 106 תאים / מ"ל לאחר שלב 3.5 ושלב 3.14.
- לאחר 15 דקות של חסימת Fc קונבנציונלית 32,33, דגירה של התאים למשך 15 דקות עם בדיקת כדאיות (FVS780) ונוגדנים מצומדים לפלואורופור נגד עכבר CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 או איזוטיפים בקרה מתאימים שלהם32,33 בריכוז המומלץ על ידי היצרנים (ראה טבלת חומרים).
- שטפו את התאים באמצעות מאגר FACS, תיקון וחדירה באמצעות ערכת חלחול זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים).
- בצע שוב חסימת Fc על התאים המחלחלים, ולאחר מכן דגירה עם נוגדן מצומד פלואורופור נגד NeuN (ראה טבלת חומרים) או איזוטיפ הבקרה שלו במשך 15 דקות.
- בצע ניתוח FACS לאחר כביסה עם מאגר FACS.
- לאחר אי הכללת הכפילים והתאים המתים בהתבסס על פרמטרים מורפולוגיים וכתם FVS780, בהתאמה, בחר את אסטרטגיית ההטיה לביטוי פני השטח של CX3CR1 (מיקרוגליה), ACSA-2 (אסטרוציטים), O4 (אוליגודנדרוציטים), ונוכחות תוך תאית של NeuN (נוירונים) לניתוח אחוז התאים החיוביים.
- לאחר שלב 5, חלץ mRNA ובצע RT-qPCR כדי לכמת את Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin ו- Gfap mRNA. נרמל את Cq באמצעות Rpl13a mRNA כמדווח, ובצע ביטוי יחסי ל- Itgam mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוגליה היא מקרופאג' תושב CNS שמופעל כאשר הוא נחשף לאתגרים סביבתיים (טראומה, מולקולות רעילות, דלקת)4,5,6,34 (איור 3A). מחקרים במבחנה על מיקרוגליה משמשים בדרך כלל להערכת מנגנונים אוטונומיים תאיים הקשורים לאותם אתגרים סביבתיים ולאפיון מצב ההפעלה לאחר מניפולציה פרמקולוגית או גנטית. כאן מוצגת גישה לבידוד מיקרוגליה ראשונית בשלב הנעורים באמצעות חרוזים מצומדים מגנטיים.
קריאה קלה להפעלה מיקרוגליאלית במבחנה היא לכמת ביטוי mRNA של מספר סמני תגובתיות מיקרוגליאליים הקשורים לפנוטיפ ממוקד דלקת (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) או פנוטיפ אנטי דלקתי (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3)5,6,31. פנוטיפים אלה תוארו בהתאם לביטוי mRNA לאחר גירוי פרו-דלקתי (IL-1β, LPS) או אנטי-דלקתי (IL-4 או IL-10). סמנים מסוימים מסווגים כסמנים אימונו-רגולטוריים מאחר שהם מווסתים באמצעות גירוי פרו-דלקתי ואנטי-דלקתי (איור 3A). סיווג זה תואר קודם לכן על ידי הצוות שלנו 5,6,31. לאחר 48 שעות, מיקרוגליאל מבודד היה מגורה עם גירוי פרו ואנטי דלקתי במשך 4 שעות או 24 שעות. mRNA הוצא, ו- RT-qPCR כימת את ביטוי הגנים. ב 4 שעות ו 24 שעות, סמנים פרו דלקתיים וחיסוניים רגולטוריים מושרים על ידי IL-1β, IL-1β + IFN-γ, ו- LPS 5,6,31. בשעה 4 שעות, גירוי IL-4 גם משרה את הסמן החיסוני-רגולטורי Il-1rn6. הם מושרים בחוזקה ב 4 שעות לאחר גירוי IL-4 לגבי סמנים אנטי דלקתיים. באופן מעניין, Cd206 גם מווסת באופן משמעותי 24 שעות לאחר גירויIL-1β 6 (איור 3B).
כדי להעריך את הפעילות הפאגוציטית של מיקרוגליה במבחנה, נעשה שימוש בחרוזי Cy3 PVC פלואורסצנטיים. הם טופלו מראש בסרום בקר עוברי (FBS) כדי להקל על הפאגוציטוזה שלהם על ידי מיקרוגליה. מיקרוגליה קוטבה לפנוטיפ ממוקד דלקת על ידי גירוי עם IL-1β + IFN-γ או LPS במשך 3 שעות או 21 שעות. שלוש שעות לפני סיום הגירוי, חרוזי Cy3 הודגמו בתאים מיקרוגליאליים. לאחר שטיפה עם 1x PBS, עוצמת הפלואורסצנציה בכל באר כומתה. הובע כימות ביחס לבארות ללא חרוזים, ותמונות מייצגות צולמו (איור 4). לאחר גירוי של 6 שעות, מיקרוגליה מתחילה לפאגוציטים Cy3-חרוזים רק תחת IL-1β + IFN-γ. לאחר גירוי של 24 שעות, יש עלייה של Cy3 פלואורסצנטיות לשני סוגי הגירוי. העלייה הזו של פלואורסצנציה של Cy3 מדגישה פעילות פאגוציטית מוגברת (איור 4C).
ציטומטריה של זרימה (FACS) ו-RT-qPCR בוצעו כדי להעריך את טוהר התרבית המיקרוגליאלית. ניתן להבחין בין אוכלוסיות שונות של תאי מוח על ידי ציטומטריה של זרימה: CX3CR1 35 עבור מיקרוגליה, O4 עבור אוליגודנדרוציטים36, NeuN עבור נוירונים 37, ו- ACSA-2 עבור אסטרוציטים38. לאחר דיסוציאציה, כל תאי המוח נוכחים; עם זאת, לאחר מיון תאים באמצעות נוגדן CD11b, רק מיקרוגליה וכמויות קטנות של תאי O4 נמצאים (איור 5A). 48 שעות לאחר תרבית תאים ראשונית, רק סמני מיקרוגליה נמצאים כפי שהוערכו על-ידי RT-qPCR (איור 5B).
איור 1: ייצוג שלב אחר שלב שמראה את הסרת המוח מהגולגולת. (A-C) מספריים קטנים שימשו לחיתוך העור מהצוואר לאף לאחר התפר הסגיטלי. (ד-ה) קצות המספריים הקטנים הוכנסו לתוך מגנום פורמן במקביל לגולגולת, ומכל צד לעיניים נחתכו בקפידה. (F) הגולגולת והמוח נותקו מהראש על ידי חיתוך בין העיניים במספריים קטנים. (ז-י) הגולגולת נתפסה קרוב לנורות האולפקטיביות עם שני מלקחיים ונקרעה בזהירות כדי לא לפגוע במוח שמתחת. (J) המוח הקטן והנורה האולפקטית הוסרו באמצעות סכין גילוח, והמוח נחתך לשתי חתיכות. (K) חלקי המוח הונחו בצלחת פטרי המכילה 30-40 מ"ל של HBSS-/-. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ייצוג סכמטי של דיסוציאציות מוחיות ובידוד תאים מיקרוגליאליים. (A-C) לאחר כריתת מוח של עכבר P8 והסרת נורות אולפקטיביות והמוח הקטן, המוחות הועברו תחילה לצלחת פטרי עם HBSS+/+, ולאחר מכן לצינורות דיסוציאציה המכילים את תערובת הדיסוציאציה. צינורות C הונחו על הדיסוציאטור (עם מצב החימום), ותוכנית NTDK הופעלה (D). (E) בסוף התוכנית, צינורות היו צנטריפוגה ב 300 x g במשך 20 שניות ב 4 מעלות צלזיוס; הדיסוציאציה הושלמה אז על ידי פיפטינג שלוש פעמים למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 μL. (F) לאחר מכן הועברו התאים לצינורות של 15 מ"ל + מסננים של 70 מיקרומטר ונשטפו ב-10 מ"ל של HBSS+/+. (G) לאחר מכן הדגימות עברו צנטריפוגה בעוצמה של 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הסופר-נאטנט הוסר, והכדור הוחזר עם 10 מ"ל של HBSS+/+. (H) צינורות היו שוב צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס; את supernatant הוסר, ולאחר מכן את הכדור היה resuspended ב 6 מ"ל של חיץ מיון. (I) צינורות עברו צנטריפוגה בעוצמה של 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הוסר הסופר-נטנט, ותמיסת המיקרובאד CD11b (200 μL) נוספה. צינורות היו דגירה במשך 15-20 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן החייאה ב 6 מ"ל של חיץ מיון (J) וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C. (K) supernatant הוסר, ואת הכדור היה מחדש בזהירות 8 מ"ל של חיץ מיון. (L) לאחר מכן, הפעל את תוכנית POSSEL על המפריד כדי להכין עמודות. התאים הועברו 1 מ"ל על 1 מ"ל על העמודה, ותאי CD11b הועתקו על צלחת אלוציה סטרילית עם 1 מ"ל של חיץ מיון. (M) תאי CD11b אוחדו בצינור חדש של 50 מ"ל וצנטריפוגה בעוצמה של 300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופר-נאטנט הוסר. (N) הכדור הוחזר בזהירות ב-10 מ"ל של מדיום מיקרוגליה קר בשלב האחרון. התאים נספרו ודוללו בתווך המיקרוגליאלי לריכוז סופי של 650,000-700,000 תאים/מ"ל שחולקו בלוחות תרבית תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הפעלה מיקרוגליאלית בעקבות חשיפה לאתגרים סביבתיים. (A) ייצוג סכמטי פשוט יותר של ספקטרום ההפעלה המיקרוגליאלית. (B) כימות יחסי של סמני הפעלה מיקרוגליאליים לאחר גירוי של 4 שעות או 24 שעות. ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דנט39 (n = 5-15); קווי שגיאה מייצגים SEM; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הערכת הפעילות הפאגוציטית של מיקרוגליה במבחנה. (A) תמונות מייצגות של מיקרוגליה Cy3-חרוזים (באדום) phagocytosis לאחר גירוי של 6 שעות או 24 שעות. התמונות נרכשו באמצעות מטרה של פי 20 מהמיקרוסקופ הפלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) כימות יחסי של פלואורסצנציה פולט לכל באר. הסטטיסטיקה בוצעה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דנט (n = 4-7); קווי שגיאה מייצגים SEM; *p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001. (C) תמונה מייצגת של מיקרוגליה (IBA-1 + תאים בירוק) Cy3-חרוזים (באדום) פאגוציטוזה לאחר גירוי של 6 שעות. התמונות נרכשות באמצעות מטרה של פי 40 מהמיקרוסקופ הקונפוקלי. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הערכה של טוהר הבידוד המגנטי של CD11b על-ידי ציטומטריה של זרימה לפני ואחרי מיון תאים. (A) מדווח על דוגמאות ממונה התאים לפני ואחרי מיון תאים, תוך הדגשת ריכוז התאים וכדאיותו. (B) ציר ה-x מייצג את ריכוז התאים (תא/מ"ל) ואת הכדאיות (%) לאחר מיון תאי CD11b. גרף עמודות עמודה; קווי שגיאה מייצגים SEM (n = 16). ניתוח פנוטיפי וביטוי גנים של סמני אוכלוסיית תאים לפני ואחרי מיון תאים CD11b+. לאחר הדיסוציאציה, תאי CD11b+ ממוחות של עכברי P8 מוינו באופן מגנטי. ביטוי של סמני מיקרוגליה (CX3CR1), אוליגודנדרוציטים (O4 או Olig2 mRNA), נוירונים (NeuN או Synaptophysin mRNA)) ואסטרוציטים (ACSA-2 או Gfap mRNA) נותח לפני ואחרי המיון. (C) ניתוח FACS של ביטוי CX3CR1, O4, NeuN ו-ACSA-2. ציר ה-x מייצג את אחוז התאים החיים ומספרי התאים. (D) כימות יחסי של ביטוי תאי CD11b+ של Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin ו-Gfap mRNA (ציר x מייצג ביטוי mRNA של מטרה יחסית ל-Itgam mRNA). גרף עמודות עמודה; קווי שגיאה מייצגים SEM (n = 7). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| תמיסה | עבור צינור C אחד (μL) | עבור ארבע צינורות C (μL) |
| מאגר X | 2850 | 11400 |
| אנזים P (פפאין) | 75 | 300 |
| אנזים A (DNAse) | 15 | 60 |
| חיץ Y | 30 | 120 |
| סך | 2970 | 11880 |
טבלה 1: הכנת תערובת הדיסוציאציה.
| תמיסה | עבור צינור אחד (μL) | עבור ארבעה צינורות (μL) |
| CD11b מיקרובים | 20 | 80 |
| מאגר מיון | 180 | 720 |
| סך | 200 | 800 |
טבלה 2: הכנת תמיסת מיקרובאד CD11b.
| גירוי | ריכוז (ng/mL) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
טבלה 3: ריאגנטים לגירוי.
| גנים | חלבון | קדימה | הפוך |
| ארג1 | ארגינאז 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| Cd206 | אשכול בידול 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA AT | תג AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| cd32 | אשכול בידול 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| CD86 | אשכול הבחנה 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | חלבון חומצי פיברילרי גליאלי | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | אינסולין כמו גורם גדילה 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | אנטגוניסט לקולטן אינטרלוקין 1 | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| איל4-רה | אנטגוניסט לקולטן אינטרלוקין 4 | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | מעשה CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| איטגם | אינטגרין אלפא מ | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | לקטין גלקטוזיד מסיס 3 | גת קאק אט חתול GGG CAC AG AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| נוס2 | סינתאז תחמוצת החנקן 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| אוליג2 | גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | פרוסטגלנדין אנדופרוקסיד סינתאז 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | חלבון ריבוזומלי L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| סוכס3 | מדכא ציטוקינים 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG AT |
| Sphk1 | ספינגוזין קינאז 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| סיפ | סינפטופיזין | ATCTCAGTCCCGATCCCA | GCTGTCTCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | גורם נמק הגידול α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
טבלה 4: רצפי פריימר RT-qPCR.
| גירוי | לבאר אחת | עבור n-wells |
| Cy3 חרוזים (1 תא : 50 חרוזים) | 8, 100, 000 | X = (8, 100, 000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
טבלה 5: הכנת תערובת החרוזים לבדיקה פאגוציטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העבודה הנוכחית מציגה תרבית תאים מיקרוגליאלית ראשונית באמצעות תאי CD11b+ ממוינים מגנטית. בנוסף להערכה התפקודית המיקרוגליאלית (RT-qPCR ומבחני פאגוציטים), נקבע גם טוהר התרבית המיקרוגליאלית.
תרביות תאי מיקרוגליה קלאסיות נוצרות בדרך כלל ממוח ילודים של מכרסם P1 או P2 ומתרבית משותפת עם אסטרוציטים למשך 10 ימים לפחות. לאחר מכן מפרידים את המיקרוגליה באופן מכני באמצעות שייקר מסלולי. השיטה לבידוד ותרבית של מיקרוגליה במבחנה תוארה לראשונה בסוף שנות ה-90 ממוחם של חולדות ילודים40,41. מאז, נעשה בו שימוש נרחב לניתוח פנוטיפים מיקרוגליאליים כגון מיקרוגליה פעילה/מנוחה או מיקרוגליה פרו-דלקתית/אנטי-דלקתית. יתר על כן, ניסוי זה היה בסיסי להגדרת מיקרוגליה כתאים נוירוטוקסיים בתרבית משותפת עם נוירונים. עם זאת, בשנת 2014, ביבר ומשתפי פעולה תיארו שלושה חסרונות משמעותיים של חקר מיקרוגליה במבחנה בשיטות קלאסיות42. (1) הניסוי משתמש במוחות של חולדה/עכבר (P1/P2), ותאים אלה לא עברו את כל תהליכי ההבשלה שיכולים להתרחש in vivo. (2) במדיום התרבות המשותפת נעשה שימוש ב-10% FBS; עם זאת, In Vivo, מיקרוגליה לעולם לא נתקלת ברכיבים כאלה בסביבה "רגילה". (3) מחקרים אחרונים מראים כי מיקרוגליה in vivo מרוסנת על ידי מספר מרכיבים מעכבים שאינם קיימים בתרבית43,44. יתר על כן, מחקרים רבים (אלקטרופיזיולוגית45 ותעתיק46,47) תיארו מיקרוגליה ראשונית לא מגורה כ"מופעלת".
השיטה הנוכחית מציעה שיטה חלופית ליצירת תרביות מיקרוגליה באמצעות טכנולוגיה ממוינת תאים מגנטית. עם פרוטוקול זה, microglia נקטפים רק כמה שעות לאחר החיה מתה ללא כל שלב תרבית משותפת. יתר על כן, מיקרוגליה מתורבתת רק יומיים במבחנה (DIV) לפני גירוי בהשוואה ל-10-14 DIV, כולל תרבית משותפת בפרוטוקולים אחרים. זה מאפשר להתקרב לתנאים הפיזיולוגיים המיקרוגליאליים. הליך זה של גידול מיקרוגליה במבחנה פורסם בעבר 25,26,27,28,29. העבודה הנוכחית הציגה פרוטוקול מותאם לעכברים יילודים, סטנדרטי להפחתת מספר בעלי החיים המשמשים וללא שלב הסרת מיאלין.
כדי להפחית את מספר העכברים המשמשים לתרבית מיקרוגליה ראשונית, החלטנו לעבוד ב-P8 בזן OF1. בשלב זה של התפתחות המוח בזן OF1, התקבלו עד 750,000 תאים מיקרוגליאליים לכל מוח, לעומת 500,000 תאים מיקרוגליאליים לכל מוח עכבר זן C57BL6/J באותו גיל. זן C57BL6/J פורסם בשלב התפתחותי שונה עבור תרבית מיקרוגליה27,28. הפרוטוקול הנוכחי שימש גם עם עכבריFmr1 KO להערכת תכונות פאגוציטיות של מיקרוגליה הקשורה למוטציה זו ועכברי LysMCre:Dicer fl/+ להערכת פנוטיפים של הפעלת מיקרוגליה על ידי RT-qPCR. לפיכך, עבודה עם זן עכבר C57BL/6 J היא קצת יותר מאתגרת מאשר עבודה על זן OF1 בשל (1) פחות תאים מיקרוגליאליים לכל מוח באותו שלב התפתחותי ו-(2) שבריריות של מיקרוגליה שנוטים יותר למות עקב הפעלה מכנית (עיין בסעיף פתרון בעיות).
בהתאם לשלב ההתפתחותי שנבחר לתרבית מיקרוגליה ראשונית, יש לשקול מיאלינציה מכיוון שהיא מתחילה בסביבות P5. בתרבות מיקרוגליאלית קלאסית (ב-P0-2), מיאלינציה אינה בעיה; עם זאת, בשיטות אחרות שפורסמו לבידוד מיקרוגליה, המיאלין מוסר באמצעות נוגדנים הדרגתיים של Percoll או נוגדנים נגד מיאלין25,26,28,29. בפרוטוקול הנוכחי, בעלי חיים מורדמים ב-P8 כאשר המיאלינציה כבר החלה; נפחים גדולים משמשים לשטיפת כדורים, ואת המיאלין החדש שנוצר ניתן להסיר ללא כל הליך נוסף. זו יכולה להיות שיטה אחת לפתרון בעיות (עיין בסעיף פסולת).
היצרן והבידוד המגנטי המיקרוגליאלי שפורסם בעבר השתמשו במדיית DMEM F-12 בתוספת 10% FBS - 1% P/S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 תיארו כי מיקרוגליה כמעט ולא יוצרת מגע עם סרום in vivo. ואכן, הנוזל החוץ-תאי של מערכת העצבים המרכזית כמעט ולא מכיל חלבונים וגורמים ביו-אקטיביים29. זו הסיבה שמקרופאג' ללא סרום (SFM) בינוני + 1% P/S משמש בפרוטוקול הנוכחי.
פרוטוקול מיון תאים המופעל על ידי מגנט (MACS) יכול גם לבודד ולתרבת מיקרוגליה של חולדות לאחר הלידה עם כמה שינויים25,29. מיקרוגליה של חולדות אכן מבודדת באמצעות CD11b/c נגד חולדות מצופות מיקרוביד. עם זאת, מכיוון שגודל המוח גדול יותר מעכברי P8, יש להשתמש רק במוח אחד לכל צינור דיסוציאציה לכל עמודה. מיקרוגליה בודדה ממוחות של חולדות P10-14 בפרוטוקולים שפורסמו בעבר, כולל שלב29 להסרת המיאלינציה. למרות ההערות הקודמות על מדיום התרבית, עבור תרבית מיקרוגליאלית של חולדות, מדיה F-12 + 10% FBS ו-550,000-600,000 תאים לכל צלחת 12 בארות מומלצת ליישומים במורד הזרם.
פתרון בעיות
דיסוציאציה: תערובת הדיסוציאציה כמתואר בטבלה 1 מחושבת עבור הכמות המקסימלית של המוח שניתן לנתק ולהמשיך ב-P8 בעכברי OF1. אם מוסיפים עוד מוח, לא ניתן להשלים דיסוציאציה בסוף שלב 3.2, ותימצא רקמת מוח לא מנותקת. במקרה זה, מומלץ להפעיל את תוכנית NTDK על הצינור עם רקמה לא מנותקת ולשמור על צינורות אחרים ב 4 מעלות צלזיוס.
מסננת סתומה ו/או עמודה: כפי שתואר קודם, תערובת הדיסוציאציה מחושבת עבור הכמות המקסימלית של רקמת המוח שיכולה לעבור דרך המסננת במהלך שלב 3.5. אם מוסיפים עוד מוח, הסינון עשוי להימשך זמן רב יותר, אך בסופו של דבר, הוא יעבור. מומלץ להשהות בזהירות את תרחיף התא בחלק העליון של המסננת עד לסינון כל תרחיף התא.
במהלך שלב 3.12, על הנסיין להעביר את תרחיף התא המסומן דרך עמודה בתוך השדה המגנטי. ניתן לסתום את העמודה בשלב זה של ההליך (1) אם יותר מדי רקמת מוח מנותקת לכל צינור, (2) אם נפח ההדחה אינו נכון, או (3) אם יש מוות תאי המושרה מכנית (חלק מהדנ"א יכול להיות נוכח); במקרה כזה, מומלץ להסיר את הדנ"א הנראה לעין עם קצה של 200 μL בזהירות.
מוות ו/או הפעלה של תאים המושרים באופן מכני: הפרוטוקול המתואר כאן מציב אתגר מרכזי אחד: הימנעות מהפעלה מכנית. כדי לעשות זאת, זה קריטי פיפטה בעדינות ולשמור על מהירות צנטריפוגה נמוכה. אם לא, מיקרוגליה לא בשלה עלולה למות כתוצאה מהלחץ המכני או להיות מופעלת, מה שמוביל לשונות גבוהה בתוצאות RT-qPCR.
פסולת: בהליך זה, בעלי חיים מורדמים ב- P8 כאשר המיאלינציה רק מתחילה, ולכן אין הליך להסרה מדויקת של המיאלין. בשלב זה של הפיתוח, מיאלין ניתן להסיר בקלות על ידי צנטריפוגה. נפחי ההדחה המתוארים בהליך זה מחושבים כדי להסיר את המיאלין המרבי. אם לא יכבדו אותו, המיאלין עלול להופיע כפסולת תאים בבארות תרבית. הנסיין אינו יכול להסיר אותו לחלוטין כאשר הוא נצפה בבארות תרבות על ידי שינוי המדיום ביום השני. תאים מיקרוגליאליים נוטים לפאגוציט פסולת זו, מה שעשוי להשפיע על מצב ההפעלה המיקרוגליאלית לפני הגירוי ובכך להשפיע על יכולת השחזור הניסיונית.
כל פתרון הבעיות שתואר קודם לכן (דיסוציאציה, מסננת סתומה ו/או עמודה, מוות ו/או הפעלה של תאים המושרים באופן מכני ופסולת) יכולים להוביל לשונות במספר תאי CD11b+ המתקבלים בעת ספירת תאים (איור 5B). אנו ממליצים להקדיש לכך תשומת לב רבה כדי לייעל את תפוקת התא הסופית.
זיהום: בפרוטוקול זה, תאים מיקרוגליאליים מתרבית במדיום SFM + 1% P/S. מדיום SFM יכול בקלות להיות מזוהם. לכן, מומלץ להצמיד את המדיום בצינורות של 50 מ"ל לאחר הוספת P/S כדי למנוע זיהום בינוני. יתר על כן, כל הניסויים צריכים להתבצע ככל האפשר בתנאים סטריליים.
כמות/איכות mRNA: הצוות שלנו עובד על טרנספקציות miRNA או siRNA. הפרוטוקול הנוכחי תואם מאוד ליישומים כאלה באמצעות טרנספקציה מגנטית עם שינוי קל של הפרוטוקול; הנסיין צריך לקצור 700,000 תאים לכל צלחת של 12 בארות כדי לקבל mRNA באיכות גבוהה עבור RT-qPCR. למרות ש-RNAseq אינו מבוצע במחקר הנוכחי, בעבר, הצוות שלנו ביצע מיצוי mRNA עבור RNAseq באמצעות 500,000 תאים לכל צלחת12-well 48.
לסיכום, ניתן לשכפל פרוטוקול זה, והוא צפוי להיות תקן חדש לבידוד מיקרוגליה בשלב התפתחותי לנוער.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
הדמויות נוצרו באמצעות BioRender. המחקר ממומן על ידי Inserm, אוניברסיטת פריז, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, ומענק נוסף מ- Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al.
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
