Summary
Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.
Abstract
Le microglia, come macrofagi residenti nel cervello, sono fondamentali per diverse funzioni, tra cui la risposta allo stress ambientale e l'omeostasi cerebrale. La microglia può adottare un ampio spettro di fenotipi di attivazione. Inoltre, le microglia che sostengono il fenotipo pro-infiammatorio sono associate a disturbi sia dello sviluppo neurologico che neurodegenerativi. Gli studi in vitro sono ampiamente utilizzati nella ricerca per valutare potenziali strategie terapeutiche in specifici tipi di cellule. In questo contesto, lo studio dell'attivazione microgliale e della neuroinfiammazione in vitro utilizzando colture microgliali primarie è più rilevante delle linee cellulari microgliali o delle microglia derivate dalle cellule staminali. Tuttavia, l'uso di alcune colture primarie potrebbe soffrire di una mancanza di riproducibilità. Questo protocollo propone un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati. L'attivazione microgliale utilizzando diversi stimoli dopo 4 ore e 24 ore mediante quantificazione dell'espressione dell'mRNA e un saggio fagocitico Cy3-bead è dimostrato qui. Il lavoro attuale dovrebbe fornire una tecnica facilmente riproducibile per isolare microglia fisiologicamente rilevanti dagli stadi di sviluppo giovanile.
Introduction
Le microglia sono le cellule simili a macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale derivate da precursori eritropoietici del sacco vitellino che migrano verso il neuroepitelio durante lo sviluppo embrionale precoce1. Oltre alle loro funzioni immunitarie, svolgono anche un ruolo significativo durante lo sviluppo neurologico, in particolare per la sinaptogenesi, l'omeostasi neuronale e la mielinizzazione2. In età adulta, le microglia sviluppano lunghi processi cellulari per scansionare continuamente l'ambiente. In caso di rotture dell'omeostasi come lesioni cerebrali o malattie cerebrali, le microglia possono cambiare il loro aspetto morfologico per adottare una forma ameboide, migrare verso l'area lesa, aumentare e rilasciare molti fattori citoprotettivi o citotossici. Le microglia hanno stati di attivazione eterogenei a seconda del loro stadio di sviluppo e del tipo di lesione subita 3,4,5. In questo studio, questi stati di attivazione sono ampiamente classificati in tre diversi fenotipi: pro-infiammatori / fagocitici, antinfiammatori e immuno-regolatori, tenendo presente che in realtà la situazione è probabilmente più complessa6.
Studiare in vivo l'attivazione microgliale e lo screening per le strategie neuroprotettive nelle prime fasi dello sviluppo cerebrale può essere difficile a causa (1) della fragilità degli animali prima dello svezzamento e (2) del basso numero di cellule microgliali. Pertanto gli studi in vitro sulle microglia sono ampiamente utilizzati per tossicità 7,8,9, strategie neuroprotettive5,10,11,12,13,14 e co-colture 15,16,17,18,19,20,21 . Gli studi in vitro possono utilizzare linee cellulari microgliali, microglia derivate da cellule staminali o colture di microglia primarie. Tutti questi approcci hanno vantaggi e svantaggi e la scelta dipende dalla domanda biologica iniziale. I vantaggi dell'utilizzo di colture primarie di microglia sono il background genetico omogeneo, la storia priva di agenti patogeni e il controllo del momento in cui le microglia vengono stimolate dopo la morte dell'animale22.
Nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi metodi (citometria a flusso, scuotimento o marcatura magnetica) per la coltura di microglia primaria da roditori, sia neonati che adulti 23,24,25,26,27,28,29. Nel presente lavoro, l'isolamento della microglia da cuccioli di topo neonato viene eseguito utilizzando la tecnologia di selezione cellulare attivata magneticamente precedentemente descritta utilizzando CD11b 25,27,29 anti-topo rivestito di microsfere. CD11b è un recettore dell'integrina espresso sulla superficie delle cellule mieloidi, compresa la microglia. Quando non c'è sfida infiammatoria all'interno del cervello, quasi tutte le cellule CD11b + sono microglia30. Rispetto ad altri metodi precedentemente pubblicati 23,24,25,26,27,28,29, il presente protocollo bilancia le analisi immediate di attivazione microgliale ex vivo e la comune coltura microgliale primaria in vitro. Pertanto, le microglia sono (1) isolate al giorno postnatale (P) 8 senza rimozione della mielina, (2) coltivate senza siero e (3) esposte a siRNA, miRNA, composti farmacologici e / o stimoli infiammatori solo 48 ore dopo l'isolamento cerebrale. Ciascuno di questi tre aspetti rende l'attuale protocollo rilevante e rapido. Innanzitutto, l'utilizzo della microglia pediatrica consente di ottenere cellule vitali dinamiche e reattive in coltura senza richiedere un ulteriore step demielinico che potrebbe potenzialmente modificare la reattività microgliale in vitro. Il presente protocollo mira ad avvicinarsi il più possibile all'ambiente fisiologico della microglia. In effetti, le microglia non incontrano mai il siero e questo protocollo non richiede nemmeno l'uso del siero. Inoltre, esporre le microglia già 48 ore dopo la coltura impedisce loro di perdere le loro facoltà fisiologiche.
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Protocol
Il protocollo è stato approvato e tutti gli animali sono stati gestiti secondo le linee guida istituzionali dell'Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Viene presentato l'isolamento magnetico della microglia dal cervello di 24 cuccioli di topo OF1 (sia maschi che femmine) a P8, suddivisi in piastre a 6 pozzetti, 12 pozzetti o 96 pozzetti. Il lavoro sperimentale è stato eseguito sotto un cappuccio per mantenere condizioni sterili.
1. Preparazione di soluzioni sterili per isolamento e coltura cellulare
- Preparare 50 mL di 1x soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) senza Ca 2+ e Mg2+ (HBSS-/-) dalla soluzione 10x disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare la miscela di dissociazione secondo la composizione fornita nella Tabella 1 utilizzando un kit di dissociazione tissutale disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare 200 mL di 1x HBSS con Ca 2+ e Mg2+ (HBSS+/+) dalla soluzione 10x disponibile in commercio.
- Preparare 200 ml di 1x PBS + 0,5% BSA (indicato come buffer di selezione cellulare).
- Preparare le microsfere CD11b secondo la Tabella 2.
- Preparare 500 ml di terreno di coltura privo di siero macrofagico (SFM) + 1% di penicillina-streptomicina (P/S). Fabbricare aliquote di tubi da 50 ml e conservarli a 4 °C. Questo è indicato come il mezzo della microglia più avanti nel testo.
NOTA: Tutte le soluzioni di isolamento devono essere preparate al momento in condizioni sterili il giorno della sperimentazione e conservate su ghiaccio. Il terreno di coltura cellulare della microglia può essere preparato, aliquotato in provette da 50 ml e mantenuto a 4 °C per un uso futuro. La filtrazione non è necessaria.
2. Dissezione cerebrale
- Decapitare la testa del cucciolo usando grandi forbici senza previa anestesia generale.
- Tagliare la pelle dal collo al naso seguendo la sutura sagittale (15-20 mm) con piccole forbici (Figura 1A-C).
- Inserire una piccola punta di forbice all'interno del Forame magno parallelo al cranio. Tagliare da ciascun lato con cura agli occhi (Figura 1D,E).
- Tagliare tra gli occhi con piccole forbici per staccare il cranio e il cervello dalla testa (Figura 1F).
- Con due pinze, afferrare il cranio vicino ai bulbi olfattivi e strappare il cranio con cura, facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante (Figura 1G-I).
- Rimuovere il cervelletto e il bulbo olfattivo con una lametta e tagliare il cervello in due pezzi (Figura 1J).
- Posizionare i pezzi di cervello in una capsula di Petri contenente 30-40 ml di HBSS-/- (Figura 1K).
3. Dissociazione cerebrale e isolamento microgliale magnetico
NOTA: Tutte le manipolazioni e le risospensioni cellulari devono essere eseguite con una pipetta da 1.000 μL con grande cautela. L'applicazione di un'elevata azione meccanica può attivare o uccidere le cellule della microglia.
- Trasferire 12 pezzi di cervello (~ 1,2 g) per tubo di dissociazione contenente miscela di dissociazione secondo la Tabella 1. Per 24 cuccioli, erano necessari quattro tubi C (Figura 2A-B).
- Posizionare i tubi C sul dissociatore (con la modalità di riscaldamento). Avviare il programma NTDK ottimizzato nell'apparecchiatura secondo le istruzioni del produttore (Figura 2D).
- Centrifugare a 300 x g per 20 s (a 4 °C) per raccogliere tutte le cellule. Completare la dissociazione meccanica mediante pipettaggio tre volte su e giù con una pipetta da 1.000 μL (Figura 2E).
- Trasferire le cellule in quattro provette da 15 ml + filtri. Risciacquare i filtri con 10 ml di HBSS+/+ (Figura 2F).
- Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 ml di HBSS+/+ (Figura 2G).
- Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere accuratamente il pellet con 6 ml di tampone di selezione (fase 1.4) (Figura 2H).
- Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μL di soluzione di microsfere CD11b (fase 1.5) per provetta e risospendere con cautela (Figura 2I).
- Incubare le provette per 15-20 minuti a 4 °C. Risospendere accuratamente il pellet con 6 ml di tampone di selezione (Figura 2I-J).
- Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 8 ml di tampone di selezione (Figura 2K).
- Seguire il programma POSSEL sul separatore (vedi Tabella dei materiali) per preparare otto colonne. Trasferire le celle 1 mL per 1 mL sulla colonna. Attendere che tutte le celle passino prima di aggiungere un altro mL. Eluire le cellule CD11b+ su piastra di eluizione sterile con 1 mL di tampone di selezione (Figura 2L).
- Pool di cellule CD11b+ in una nuova provetta da 50 mL (Figura 2M).
- Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 ml di terreno microglia freddo (fase 1.6) (Figura 2N).
- Contare le cellule CD11b+. A P8, si dovrebbe ottenere ~ 650.000 cellule per cervello.
NOTA: Nel presente protocollo, le celle sono state contate utilizzando un contatore automatico delle celle (vedi Tabella dei materiali). - Risospendere le cellule nel mezzo della microglia fredda ad una concentrazione finale di 650.000-700.000 cellule/ml e dispensare in piastre di coltura cellulare.
NOTA: Le piastre a 6 pozzetti sono per Western Blot (2 mL per pozzetto); le piastre a 12 pozzetti sono per l'analisi RT-qPCR (1 mL per pozzetto) e le piastre a 96 pozzetti sono per il saggio fagocitario (250 μL per pozzetto); Tutti e tre sono stati utilizzati per questo lavoro. Tuttavia, in questo manoscritto, i risultati dell'analisi Western Blot non sono mostrati, ma è possibile eseguire con questo protocollo. - Posizionare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2 durante la notte. Cambiare accuratamente il mezzo con una pipetta da 1.000 μL con mezzo microglia preriscaldato.
- Posizionare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2 durante la notte prima della stimolazione.
NOTA: L'isolamento della microglia da più di 36 cuccioli e dopo P9 non è raccomandato. Ciò aumenterà il rischio di contaminazione e accumulo di detriti cellulari per attivare la microglia.
4. Stimolazioni cellulari
- Preparare i reagenti di stimolazione secondo la Tabella 3 utilizzando i reagenti disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Aggiungi il volume appropriato in ogni pozzetto stimolato.
NOTA: Il volume appropriato dipende dalla concentrazione dello stimolo e dalla dimensione del pozzo. - Posizionare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2fino alla fine della stimolazione a 6 ore, 24 ore o 48 ore.
- Per l'analisi Western Blot, aspirare il surnatante e aggiungere 50 μL di tampone di lisi proteica (vedere Tabella dei materiali) con una pipetta. Utilizzando le punte, grattare il fondo della piastra per staccare le cellule lisate e trasferirle in tubi da 1,5 ml. Conservare a -80 °C.
NOTA: Le piastre di coltura possono essere conservate per anni a -80 °C se il surnatante viene aspirato correttamente. - Per l'analisi RT-qPCR 6,31, aspirare il surnatante e conservare le piastre di coltura direttamente a -80 °C fino all'estrazione dell'mRNA (fase 5).
- Per il test fagocitico, vedere il punto 6.
5. Estrazione di mRNA e analisi RT-qPCR
- Eseguire l'estrazione dell'RNA, RT-PCR e RT-qPCR seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Fare riferimento alla Tabella 4 per le sequenze di primer 5,6,31.
- Eseguire l'analisi RT-qPCR seguendoil rapporto 5 precedentemente pubblicato.
6. Saggio fagocitico
- Stimolare le cellule ed eseguire il saggio fagocitario durante le ultime 3 ore della stimolazione. Ad esempio, per la stimolazione di 6 ore, iniziare il test fagocitario dopo 3 ore di stimolazione; e per la stimolazione di 12 ore, iniziare il test fagocitico 9 ore dopo l'inizio della stimolazione.
- Calcola il numero di perline necessarie per preparare considerando il rapporto (1 cella: 50 perline). Per un pozzetto della piastra a 96 pozzetti, sono necessarie 8,1 x 106 perline. Preparare la miscela di perline secondo la tabella 5.
NOTA: Vorticare con cautela il flaconcino di sfere prima di aggiungere alla miscela PBS/FBS. - Incubare per 1 ora a bagnomaria a 37 °C. Vortice ogni 10 min.
- Calcolare il volume della soluzione da aggiungere a ciascun pozzetto. Aggiungere la soluzione e incubare per 3 ore.
- Risciacquare i pozzetti tre volte con 1x PBS. Leggere l'emissione di fluorescenza a 550 nm (lunghezza d'onda di emissione Cy3).
7. Controllo qualità della purezza
- Valutare la purezza dell'isolamento magnetico CD11b mediante citometria a flusso (FACS) (prima e dopo l'ordinamento cellulare), quindi eseguire la RT-qPCR.
- Contare le cellule e risospenderle in tampone FACS (PBS + 2 mM di EDTA + 0,5% di albumina sierica bovina) per ottenere una diluizione di 10 x 106 cellule/ml dopo la fase 3.5 e la fase 3.14.
- Dopo 15 minuti di blocco Fc convenzionale 32,33, incubare le cellule per 15 minuti con sonda di vitalità (FVS780) e anticorpi coniugati con fluorofori contro il topo CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 o i corrispondenti isotipi di controllo32,33 alla concentrazione raccomandata dai produttori (vedere Tabella dei materiali).
- Lavare le celle con tampone FACS, fissare e permeabilizzare con un kit di permeabilizzazione disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Eseguire nuovamente il blocco Fc sulle cellule permeabilizzate e quindi incubare con anticorpi coniugati con fluorofori contro NeuN (vedi Tabella dei materiali) o il suo isotipo di controllo per 15 minuti.
- Eseguire l'analisi FACS dopo il lavaggio con tampone FACS.
- Dopo aver escluso i doppietti e le cellule morte in base ai parametri morfologici e alla colorazione FVS780, rispettivamente, selezionare la strategia di gating per l'espressione superficiale di CX3CR1 (microglia), ACSA-2 (astrociti), O4 (oligodendrociti) e presenza intracellulare di NeuN (neuroni) per l'analisi della percentuale di cellule positive.
- Dopo il passaggio 5, estrarre l'mRNA ed eseguire RT-qPCR per quantificare Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin, e Gfap mRNA. Normalizzare Cq usando l'mRNA Rpl13a come reporter ed eseguire un'espressione relativa all'mRNA Itgam .
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Representative Results
La microglia è il macrofago residente nel SNC che viene attivato quando esposto a sfide ambientali (traumi, molecole tossiche, infiammazione)4,5,6,34 (Figura 3A). Gli studi in vitro sulle microglia sono comunemente usati per valutare i meccanismi autonomi delle cellule correlati a tali sfide ambientali e caratterizzare lo stato di attivazione dopo manipolazione farmacologica o genetica. Qui, viene presentato un approccio per isolare la microglia primaria nella fase giovanile utilizzando perline accoppiate magnetiche.
Una facile lettura per l'attivazione microgliale in vitro è quella di quantificare l'espressione di mRNA di diversi marcatori di reattività microgliale associati a un fenotipo pro-infiammatorio (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) o un fenotipo antinfiammatorio (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3)5,6,31. Questi fenotipi sono stati descritti a seconda dell'espressione dell'mRNA dopo uno stimolo pro-infiammatorio (IL-1β, LPS) o antinfiammatorio (IL-4 o IL-10). Alcuni marcatori sono classificati come marcatori immunoregolatori perché sono sovraregolati attraverso la stimolazione pro- e anti-infiammatoria (Figura 3A). Questa classificazione è stata descritta in precedenza dal nostro team 5,6,31. Dopo 48 ore, le microgliali isolate sono state stimolate con stimoli pro- e anti-infiammatori per 4 ore o 24 ore. Sono stati estratti mRNA e RT-qPCR quantificato l'espressione genica. A 4 ore e 24 ore, i marcatori pro-infiammatori e immuno-regolatori sono indotti da IL-1β, IL-1β + IFN-γ e LPS 5,6,31. A 4 ore, la stimolazione di IL-4 induce anche il marcatore immunoregolatore Il-1rn6. Sono indotti fortemente a 4 ore dopo la stimolazione IL-4 per quanto riguarda i marcatori anti-infiammatori. È interessante notare che Cd206 è anche significativamente sovraregolato 24 ore dopo la stimolazione di IL-1β6 (Figura 3B).
Per valutare l'attività fagocitaria della microglia in vitro, sono state utilizzate perle fluorescenti in PVC Cy3. Sono stati pre-trattati con siero bovino fetale (FBS) per facilitare la loro fagocitosi da parte della microglia. Le microglia sono state polarizzate verso il fenotipo pro-infiammatorio mediante stimolazione con IL-1β + IFN-γ o LPS per 3 ore o 21 ore. Tre ore prima della fine della stimolazione, le perle Cy3 sono state incubate con cellule microgliali. Dopo il risciacquo con 1x PBS, è stata quantificata l'intensità della fluorescenza in ciascun pozzetto. È stata espressa la quantificazione relativa ai pozzi senza perline e sono state scattate immagini rappresentative (Figura 4). Dopo 6 ore di stimolazione, la microglia inizia a fagocitare Cy3-beads solo sotto IL-1β + IFN-γ. Dopo una stimolazione di 24 ore, c'è un aumento della fluorescenza Cy3 per entrambi i tipi di stimolazione. Tale aumento della fluorescenza Cy3 evidenzia un aumento dell'attività fagocitaria (Figura 4C).
Sono state eseguite citometria a flusso (FACS) e RT-qPCR per valutare la purezza della coltura microgliale. Diverse popolazioni cellulari cerebrali possono essere distinte dalla citometria a flusso: CX3CR135 per la microglia, O4 per gli oligodendrociti36, NeuN per i neuroni 37 e ACSA-2 per gli astrociti38. Dopo la dissociazione, tutte le cellule cerebrali sono presenti; tuttavia, dopo la selezione cellulare con l'anticorpo CD11b, sono presenti solo microglia e piccole quantità di cellule O4 (Figura 5A). 48 ore dopo la coltura cellulare primaria, si trovano solo marcatori microglia valutati da RT-qPCR (Figura 5B).
Figura 1: Rappresentazione passo-passo che mostra la rimozione del cervello dal cranio. (A-C) Piccole forbici sono state utilizzate per tagliare la pelle dal collo al naso dopo la sutura sagittale. (D-E) Le piccole punte della forbice sono state inserite all'interno del Forame magno parallelo al cranio, e da ogni lato agli occhi sono state accuratamente tagliate. (F) Il cranio e il cervello sono stati staccati dalla testa tagliando tra gli occhi con piccole forbici. (G-I) Il cranio è stato afferrato vicino ai bulbi olfattivi con due pinze e strappato con cura per non danneggiare il cervello sottostante. (J) Il cervelletto e il bulbo olfattivo sono stati rimossi con una lama di rasoio e il cervello è stato tagliato in due pezzi. (K) I pezzi di cervello sono stati posti in una capsula di Petri contenente 30-40 ml di HBSS-/-. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica delle dissociazioni cerebrali e dell'isolamento delle cellule microgliali. (A-C) Dopo la dissezione cerebrale del topo P8 e la rimozione dei bulbi olfattivi e del cervelletto, i cervelli sono stati prima trasferiti in una capsula di Petri con HBSS +/+ e poi in tubi di dissociazione contenenti la miscela di dissociazione. I tubi C sono stati posizionati sul dissociatore (con la modalità di riscaldamento) e il programma NTDK è stato avviato (D). (E) Alla fine del programma, i tubi sono stati centrifugati a 300 x g per 20 s a 4 °C; la dissociazione è stata poi completata mediante pipettaggio tre volte su e giù con una pipetta da 1.000 μL. (F) Le cellule sono state quindi trasferite in tubi da 15 ml + filtri da 70 μm e risciacquati con 10 ml di HBSS+/+. (G) I campioni sono stati quindi centrifugati a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato risospeso con 10 ml di HBSS+/+. H) i tubi sono stati nuovamente centrifugati a 300 x g per 10 minuti a 4 °C; il surnatante è stato rimosso e quindi il pellet è stato risospeso in 6 ml di tampone di selezione. (I) Le provette sono state centrifugate a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, il surnatante è stato rimosso ed è stata aggiunta la soluzione di microsfere CD11b (200 μL). Le provette sono state incubate per 15-20 minuti a 4 °C, quindi risospese in 6 ml di tampone di selezione (J) e centrifugate a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. (K) Il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato accuratamente risospeso in 8 ml di tampone di selezione. (L) Quindi, avviare il programma POSSEL sul separatore per preparare le colonne. Le cellule sono state trasferite 1 mL per 1 mL sulla colonna e le cellule CD11b sono state eluite su una piastra di eluizione sterile con 1 mL di tampone di selezione. (M) Le cellule CD11b sono state raggruppate in una nuova provetta da 50 mL e centrifugate a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, e il surnatante è stato rimosso. (N) Il pellet è stato accuratamente risospeso in 10 ml di terreno microglia freddo nell'ultima fase. Le cellule sono state contate e diluite nel mezzo microgliale fino a una concentrazione finale di 650.000-700.000 cellule / ml dispensate in piastre di coltura cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Attivazione microgliale dopo esposizione a sfide ambientali. (A) Rappresentazione schematica semplificata dello spettro di attivazione microgliale. (B) Quantificazione relativa dei marcatori di attivazione microgliale dopo stimolazione di 4 ore o 24 ore. ANOVA bidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett39 (n = 5-15); le barre di errore rappresentano SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Valutazione dell'attività fagocitaria della microglia in vitro. (A) Immagini rappresentative della fagocitosi delle sfere di microglia Cy3-beads (in rosso) dopo stimolazione di 6 ore o 24 ore. Le immagini sono state acquisite utilizzando l'obiettivo 20x del microscopio a fluorescenza. Barra di scala = 100 μm. (B) Quantificazione relativa delle emissioni di fluorescenza per pozzetto. Le statistiche sono state eseguite utilizzando ANOVA bidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett (n = 4-7); le barre di errore rappresentano SEM; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Immagine rappresentativa della microglia (cellule IBA-1 + in verde) Cy3-perline (in rosso) fagocitosi dopo 6 ore di stimolazione. Le immagini vengono acquisite utilizzando un obiettivo 40x del microscopio confocale. Barra di scala = 300 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Valutazione della purezza dell'isolamento magnetico CD11b mediante citometria a flusso prima e dopo la selezione cellulare. (A) Riporta esempi dal contatore delle cellule prima e dopo la selezione delle cellule, evidenziando la concentrazione e la vitalità delle cellule. (B) L'asse x rappresenta la concentrazione cellulare (cellula/ml) e la vitalità (%) dopo la selezione delle cellule CD11b. Grafico a barre a colonne; le barre di errore rappresentano SEM (n = 16). Analisi fenotipica ed espressione genica di marcatori di popolazione cellulare prima e dopo lo smistamento cellulare CD11b+. Dopo la dissociazione, le cellule CD11b + dal cervello dei topi P8 sono state ordinate magneticamente. L'espressione dei marcatori microglia (CX3CR1), oligodendrociti (mRNA O4 o Olig2), neuroni (mRNA NeuN o Synaptophysin )) e astrociti (mRNA ACSA-2 o Gfap ) è stata analizzata prima e dopo la selezione. (C) Analisi FACS dell'espressione di CX3CR1, O4, NeuN e ACSA-2. L'asse x rappresenta la percentuale di cellule vive e il numero di cellule. (D) Quantificazione relativa dell'espressione delle cellule CD11b+ di mRNA Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin, e Gfap (l'asse x rappresenta l'espressione relativa dell'mRNA target all'mRNA Itgam ). Grafico a barre a colonne; le barre di errore rappresentano SEM (n = 7). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Soluzione | Per un tubo C (μL) | Per quattro tubi C (μL) |
| Buffer X | 2850 | 11400 |
| Enzima P (Papaina) | 75 | 300 |
| Enzima A (DNAsi) | 15 | 60 |
| Buffer Y | 30 | 120 |
| Totale | 2970 | 11880 |
Tabella 1: Preparazione della miscela di dissociazione.
| Soluzione | Per un tubo (μL) | Per quattro tubi (μL) |
| Microsfere CD11b | 20 | 80 |
| Buffer di ordinamento | 180 | 720 |
| Totale | 200 | 800 |
Tabella 2: Preparazione della soluzione di microsfere CD11b.
| Stimolazione | Concentrazione (ng/mL) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 · | 30 |
| IL-10 · | 20 |
Tabella 3: I reagenti di stimolazione.
| Geni | Proteina | Inoltrare | Inverso |
| Arg1 | Arginasi 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| CD206 | Cluster di differenziazione 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA PRESSO | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| CD32 | Cluster di differenziazione 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| CD86 | Cluster di differenziazione 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Proteina acida fibrillare gliale | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | Fattore di crescita insulino-simile 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Antagonista del recettore dell'interleuchina 1 | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Antagonista del recettore dell'interleuchina 4 | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | ATTO CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Integrina alfa M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lectina Glactoside-Binding solubile 3 | GAT CAC AAT CAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| N. 2 | Ossido nitrico sintasi 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| OLIG2 | Fattore di trascrizione degli oligodendrociti 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandina endoperossido sintasi 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | Proteina ribosomiale L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Soppressore della citochina 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG PRESSO |
| SPHK1 | Sfingosina chinasi 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Sinaptofisina | ATCTCAGTGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Fattore di necrosi tumorale α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tabella 4: Sequenze di primer RT-qPCR.
| Stimolazione | Per 1-pozzetto | Per n-pozzi |
| Cy3 Perle (1 cella: 50 perle) | 8, 100, 000 | X = (8, 100.000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
Tabella 5: Preparazione della miscela di perle per il saggio fagocitico.
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Discussion
Il lavoro attuale presenta una coltura primaria di cellule microgliali utilizzando cellule CD11b + ordinate magneticamente. Oltre alla valutazione funzionale microgliale (RT-qPCR e saggi fagocitici), è stata determinata anche la purezza della coltura microgliale.
Le colture cellulari di microglia classiche sono comunemente generate dal cervello neonato del roditore P1 o P2 e dalla co-coltura con astrociti per almeno 10 giorni. Le microglia vengono quindi separate meccanicamente utilizzando uno scuotitore orbitale. Il metodo per isolare e coltivare microglia in vitro è stato descritto per la prima volta alla fine degli anni 1990 dal cervello di ratti neonati40,41. Da allora, è stato ampiamente utilizzato per analizzare fenotipi microgliali come microglia attivata / a riposo o microglia pro-infiammatoria / anti-infiammatoria. Inoltre, questo esperimento è stato fondamentale per definire le microglia come cellule neurotossiche co-coltivate con i neuroni. Tuttavia, nel 2014, Biber e collaboratori hanno descritto tre svantaggi significativi dello studio della microglia in vitro utilizzando metodi classici42. (1) L'esperimento utilizza cervelli neonati di ratto/topo (P1/P2), e queste cellule non sono passate attraverso tutti i processi di maturazione che possono verificarsi in vivo. (2) Nel mezzo di cocoltura, viene utilizzato il 10% di FBS; Tuttavia, in vivo, le microglia non incontrano mai tali componenti in un ambiente "normale". (3) Studi recenti dimostrano che le microglia in vivo sono trattenute da diversi componenti inibitori non presenti nella coltura43,44. Inoltre, molti studi (elettrofisiologico45 e trascrittomico46,47) hanno descritto la microglia primaria non stimolata come "attivata".
Il presente metodo propone una tecnica alternativa per generare colture di microglia utilizzando la tecnologia della selezione magnetica delle cellule. Con questo protocollo, le microglia vengono raccolte solo poche ore dopo la morte dell'animale senza alcuna fase di co-coltura. Inoltre, le microglia vengono coltivate solo 2 giorni in vitro (DIV) prima della stimolazione rispetto a 10-14 DIV, inclusa la co-coltura in altri protocolli. Ciò consente di avvicinarsi alle condizioni fisiologiche microgliali. Questa procedura di coltura della microglia in vitro è stata precedentemente pubblicata 25,26,27,28,29. Il lavoro attuale ha presentato un protocollo ottimizzato per i topi neonati, standardizzato per ridurre il numero di animali utilizzati e senza fase di rimozione della mielina.
Per ridurre il numero di topi utilizzati per la coltura primaria della microglia, abbiamo deciso di lavorare a P8 nel ceppo OF1. In questa fase dello sviluppo cerebrale nel ceppo OF1, sono state ottenute fino a 750.000 cellule microgliali per cervello, in contrasto con 500.000 cellule microgliali per cervello di topo ceppo C57BL6 / J alla stessa età. Il ceppo C57BL6/J è stato pubblicato in un diverso stadio di sviluppo per la coltura di microglia27,28. Il presente protocollo è stato utilizzato anche con topi Fmr1KO per valutare le proprietà fagocitarie della microglia legata a questa mutazione e LysMCre: topi Dicerfl/+ per valutare i fenotipi di attivazione microgliale mediante RT-qPCR. Pertanto, lavorare con il ceppo murino C57BL / 6 J è un po 'più impegnativo che lavorare sul ceppo OF1 a causa di (1) meno cellule microgliali per cervello nello stesso stadio di sviluppo e (2) fragilità delle microglia che sono più inclini a morire a causa dell'attivazione meccanica (vedi la sezione sulla risoluzione dei problemi).
A seconda dello stadio di sviluppo scelto per la coltura primaria della microglia, la mielinizzazione deve essere considerata poiché inizia intorno a P5. In una coltura microgliale classica (a P0-2), la mielinizzazione non è un problema; tuttavia, in altri metodi pubblicati per isolare la microglia, la mielina viene rimossa usando il gradiente di Percoll o gli anticorpi anti-mielina25,26,28,29. Nel presente protocollo, gli animali vengono eutanizzati a P8 quando la mielinizzazione è già iniziata; Grandi volumi vengono utilizzati per risciacquare i pellet e la mielina appena formata può essere rimossa senza alcuna procedura aggiuntiva. Questo può essere un metodo di risoluzione dei problemi (vedere la sezione Detriti).
Il produttore e l'isolamento magnetico microgliale precedentemente pubblicato hanno utilizzato supporti DMEM F-12 integrati con 10% FBS - 1% P / S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 hanno descritto che le microglia raramente contattano il siero in vivo. Infatti, il fluido extracellulare del sistema nervoso centrale contiene raramente proteine e fattori bioattivi29. Questo è il motivo per cui nel presente protocollo viene utilizzato un mezzo macrofago senza siero (SFM) + 1% di P / S.
Il protocollo MACS (Magnetic-activated cell sorting) può anche isolare e coltivare microglia di ratto postnatale con alcune modifiche25,29. Le microglia di ratto sono infatti isolate usando CD11b / c anti-ratto rivestito di microbead. Tuttavia, poiché le dimensioni del cervello sono più grandi dei topi P8, dovrebbe essere utilizzato solo un cervello per tubo di dissociazione per colonna. Le microglia sono state isolate dal cervello di ratto P10-14 in protocolli precedentemente pubblicati, inclusa la fase29 di rimozione della mielinizzazione. Nonostante i precedenti commenti sul terreno di coltura, per la coltura microgliale di ratto, i terreni F-12 + 10% FBS e 550.000-600.000 cellule per piastra a 12 pozzetti sono raccomandati per applicazioni a valle.
Risoluzione dei problemi
Dissociazione: La miscela di dissociazione descritta nella Tabella 1 è calcolata per la quantità massima di cervello che può essere dissociata e procedere a P8 nei topi OF1. Se viene aggiunto più cervello, la dissociazione non può essere completata alla fine del passaggio 3.2 e verrà trovato tessuto cerebrale non dissociato. In questo caso, si consiglia di eseguire il programma NTDK sulla provetta con tessuto non dissociato e mantenere le altre provette a 4 °C.
Filtro e/o colonna intasato: come descritto in precedenza, la miscela di dissociazione viene calcolata per la quantità massima di tessuto cerebrale che può passare attraverso il filtro durante la fase 3.5. Se viene aggiunto più cervello, la filtrazione potrebbe richiedere più tempo, ma alla fine passerà. Si raccomanda di risospendere attentamente la sospensione cellulare sulla parte superiore del filtro fino a quando tutta la sospensione cellulare non viene filtrata.
Durante il passaggio 3.12, lo sperimentatore deve far passare la sospensione cellulare marcata attraverso una colonna all'interno del campo magnetico. La colonna può essere ostruita in questa fase della procedura (1) se troppo tessuto cerebrale è dissociato per tubo, (2) se il volume di risospensione non è corretto, o (3) se c'è qualche morte cellulare indotta meccanicamente (può essere presente del DNA); in tal caso, si raccomanda di rimuovere con attenzione il DNA visibile con una punta da 200 μL.
Morte e/o attivazione cellulare indotta meccanicamente: il protocollo qui descritto presenta una sfida principale: evitare l'attivazione meccanica. Per fare ciò, è fondamentale pipettare delicatamente e mantenere bassa la velocità di centrifugazione. In caso contrario, la microglia immatura può morire a causa dello stress meccanico o attivarsi, portando ad un'elevata variabilità nei risultati RT-qPCR.
Detriti: In questa procedura, gli animali vengono eutanizzati a P8 quando la mielinizzazione è appena iniziata, e quindi non esiste una procedura per rimuovere con precisione la mielina. In questa fase di sviluppo, la mielina può essere facilmente rimossa mediante centrifugazione. I volumi di risospensione descritti in questa procedura sono calcolati per rimuovere la mielina massima. Se non rispettata, la mielina potrebbe apparire come detriti cellulari nei pozzetti di coltura. Lo sperimentatore non può rimuoverlo completamente quando osservato nei pozzi di coltura cambiando il terreno il giorno 2. Le cellule microgliali tendono a fagocitare questi detriti, che possono influenzare lo stato di attivazione microgliale prima della stimolazione e quindi influenzare la riproducibilità sperimentale.
Tutti i problemi descritti in precedenza (dissociazione, filtro e/o colonna intasata, morte e/o attivazione cellulare indotta meccanicamente e detriti) possono portare a variabilità nel numero di cellule CD11b+ ottenute durante il conteggio delle cellule (Figura 5B). Si consiglia di prestare molta attenzione a questo per ottimizzare la resa finale delle celle.
Contaminazione: In questo protocollo, le cellule microgliali sono coltivate in mezzo SFM + 1% P / S. Il mezzo SFM può essere facilmente contaminato. Pertanto, si raccomanda di aliquote del mezzo in provette da 50 mL dopo l'aggiunta di P/S per evitare la contaminazione del mezzo. Inoltre, tutte le sperimentazioni devono essere eseguite il più possibile in condizioni sterili.
Quantità/qualità dell'mRNA: Il nostro team lavora sulle trasfezioni di miRNA o siRNA. Il presente protocollo è altamente compatibile con tali applicazioni che utilizzano la trasfezione magnetica con una leggera modifica del protocollo; lo sperimentatore deve raccogliere 700.000 cellule per piastra a 12 pozzetti per ottenere mRNA di alta qualità per RT-qPCR. Sebbene RNAseq non venga eseguito nel presente studio, in precedenza, il nostro team ha eseguito l'estrazione di mRNA per RNAseq utilizzando 500.000 cellule per piastra48 a 12 pozzetti.
In conclusione, questo protocollo può essere riprodotto e dovrebbe essere un nuovo standard per isolare la microglia in una fase di sviluppo giovanile.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Le figure sono state create utilizzando BioRender. La ricerca è finanziata da Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco e una sovvenzione aggiuntiva da Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al.
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
