Summary
Primære mikrogliakulturer brukes ofte til å evaluere nye antiinflammatoriske molekyler. Denne protokollen beskriver en reproduserbar og relevant metode for magnetisk å isolere mikroglia fra nyfødte valper.
Abstract
Microglia, som hjernen bosatt makrofager, er grunnleggende for flere funksjoner, inkludert respons på miljøstress og hjernen homeostase. Microglia kan ta i bruk et stort spekter av aktiveringsfenotyper. Videre er mikroglia som støtter proinflammatorisk fenotype forbundet med både nevrodevelopmentale og nevrodegenerative lidelser. In vitro-studier er mye brukt i forskning for å evaluere potensielle terapeutiske strategier i bestemte celletyper. I denne sammenheng er det mer relevant å studere mikrogliaaktivering og nevroinflammasjon in vitro ved bruk av primære mikrogliakulturer enn mikroglialcellelinjer eller stamcelleavledet mikroglia. Imidlertid kan bruken av noen primære kulturer lide av mangel på reproduserbarhet. Denne protokollen foreslår en reproduserbar og relevant metode for magnetisk isolering av mikroglia fra nyfødte valper. Mikroglial aktivering ved bruk av flere stimuli etter 4 timer og 24 timer ved mRNA-ekspresjonskvantifisering og en Cy3-perlefagocytisk analyse er demonstrert her. Det nåværende arbeidet forventes å gi en lett reproduserbar teknikk for å isolere fysiologisk relevant mikroglia fra juvenile utviklingsstadier.
Introduction
Microglia er makrofaglignende celler i sentralnervesystemet avledet fra erytropoetiske forløpere til plommesekken som migrerer til nevroepitelet under tidlig embryonal utvikling1. Bortsett fra deres immunitetsfunksjoner, spiller de også en betydelig rolle under nevroutvikling, spesielt for synaptogenese, nevronhomeostase ogmyelinisering. I voksen alder utvikler mikroglia lange cellulære prosesser for å skanne miljøet kontinuerlig. Ved homeostasebrudd som hjerneskade eller hjernesykdom, kan mikroglia endre sitt morfologiske utseende for å vedta en amoeboid form, migrere til det skadede området, øke og frigjøre mange cytoprotektive eller cytotoksiske faktorer. Microglia har heterogene aktiveringstilstander avhengig av utviklingsstadiet og typen skade som ble påført 3,4,5. I denne studien er disse aktiveringstilstandene bredt klassifisert i tre forskjellige fenotyper: pro-inflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk og immunregulatorisk, med tanke på at situasjonen i virkeligheten sannsynligvis vil være mer kompleks6.
Studier in vivo mikroglial aktivering og screening for nevrobeskyttende strategier i tidlige stadier av hjernens utvikling kan være utfordrende på grunn av (1) skjørheten til dyr før avvenning og (2) det lave antallet mikrogliaceller. Derfor er in vitro-studier på mikroglia mye brukt for toksisitet 7,8,9, nevrobeskyttende strategier5,10,11,12,13,14 og kokulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-studier kan bruke enten mikrogliacellelinjer, stamcelleavledet mikroglia eller primær mikrogliakultur. Alle disse tilnærmingene har fordeler og ulemper, og valget avhenger av det første biologiske spørsmålet. Fordelene ved å bruke primære mikrogliakulturer er den homogene genetiske bakgrunnen, patogenfri historie og kontroll av tiden da mikroglia stimuleres etter dyredød22.
Gjennom årene ble forskjellige metoder (flowcytometri, risting eller magnetisk merking) utviklet for dyrking av primær mikroglia fra gnagere, både nyfødte og voksne 23,24,25,26,27,28,29. I det foreliggende arbeidet utføres mikroglia-isolering fra musenyfødte valper ved bruk av tidligere beskrevet magnetisk aktivert cellesorteringsteknologi ved bruk av mikroperlebelagt anti-mus CD11b25,27,29. CD11b er en integrinreseptor uttrykt på overflaten av myeloide celler, inkludert mikroglia. Når det ikke er noen inflammatorisk utfordring i hjernen, er nesten alle CD11b+-celler microglia30. Sammenlignet med andre tidligere publiserte metoder 23,24,25,26,27,28,29, balanserer den nåværende protokollen umiddelbare ex vivo mikrogliale aktiveringsanalyser og vanlig in vitro primær mikroglialkultur. Dermed blir mikroglia (1) isolert på postnatal dag (P)8 uten fjerning av myelin, (2) dyrket uten serum, og (3) eksponert enten for siRNA, miRNA, farmakologisk forbindelse og/eller inflammatoriske stimuli bare 48 timer etter hjerneisolering. Hvert av disse tre aspektene gjør den nåværende protokollen relevant og rask. Først og fremst tillater bruk av pediatrisk mikroglia å oppnå dynamiske og reaktive levedyktige celler i kultur uten å kreve et ekstra demyeliniseringstrinn som potensielt kan modifisere mikroglial reaktivitet in vitro. Den nåværende protokollen tar sikte på å komme så nært som mulig til det fysiologiske miljøet til microglia. Faktisk møter microglia aldri serum, og denne protokollen krever heller ikke bruk av serum. Videre forhindrer eksponering av mikroglia så tidlig som 48 timer etter kultur at de mister sine fysiologiske fakulteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble godkjent, og alle dyrene ble håndtert i henhold til de institusjonelle retningslinjene til Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrike). Magnetisk isolasjon av mikroglia fra hjernen til 24 OF1 musevalper (både mannlige og kvinnelige) ved P8, delt inn i 6-brønns, 12-brønns eller 96-brønnplater, presenteres. Det eksperimentelle arbeidet ble utført under en hette for å opprettholde sterile forhold.
1. Fremstilling av sterile løsninger for isolasjon og cellekultur
- Tilbered 50 ml 1x Hanks' balanserte saltløsning (HBSS) uten Ca 2+ og Mg2+ (HBSS-/-) fra den kommersielt tilgjengelige 10x-løsningen (se materialtabell).
- Forbered dissosiasjonsblanding i henhold til sammensetningen gitt i tabell 1 ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig vevdissosiasjonssett (se Materialtabell).
- Tilbered 200 ml 1x HBSS med Ca 2+ og Mg2+ (HBSS+/+) fra den kommersielt tilgjengelige 10x oppløsningen.
- Forbered 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (referert til som cellesorteringsbuffer).
- Klargjør CD11b-mikroperler i henhold til tabell 2.
- Forbered 500 ml makrofag serumfritt kulturmedium (SFM) + 1% penicillin-streptomycin (P / S). Lag aliquots av 50 ml rør og oppbevar dem ved 4 ° C. Dette omtales som microglia-mediet senere i teksten.
MERK: Alle isolasjonsløsninger må tilberedes under sterile forhold på forsøksdagen og oppbevares på is. Microglia cellekulturmedium kan fremstilles, aliquoted i 50 ml rør, og holdes ved 4 ° C for fremtidig bruk. Filtrering er ikke nødvendig.
2. Hjerne disseksjon
- Halshugg valpens hode ved hjelp av stor saks uten tidligere generell anestesi.
- Klipp huden fra nakken til nesen etter sagittal sutur (15-20 mm) med liten saks (figur 1A-C).
- Sett inn en liten saksespiss i Foramen magnum parallelt med skallen. Klipp forsiktig fra hver side til øynene (figur 1D, E).
- Klipp mellom øynene med liten saks for å løsne skallen og hjernen fra hodet (figur 1F).
- Med to tang, ta tak i skallen nær luktpærene og riv skallen forsiktig, pass på at du ikke skader den underliggende hjernen (figur 1G-I).
- Fjern lillehjernen og olfaktiv pære med barberblad og skjær hjernen i to biter (figur 1J).
- Legg hjernebitene i en petriskål som inneholder 30-40 ml HBSS-/- (figur 1K).
3. Hjernedissosiasjon og magnetisk mikroglial isolasjon
MERK: Alle cellemanipulasjoner og resuspenderinger må utføres med en 1000 μL pipette med stor forsiktighet. Bruk av høy mekanisk handling kan aktivere eller drepe mikrogliaceller.
- Overfør 12 hjernestykker (~ 1,2 g) per dissosiasjonsrør som inneholder dissosiasjonsblanding i henhold til tabell 1. For 24 valper var det behov for fire C-rør (figur 2A-B).
- Plasser C-rør på dissosiatoren (med oppvarmingsmodus). Start det optimaliserte NTDK-programmet i utstyret i henhold til produsentens instruksjoner (figur 2D).
- Sentrifuge ved 300 x g i 20 s (ved 4 °C) for å samle alle cellene. Fullfør den mekaniske dissosiasjonen ved å pipettere tre ganger opp og ned med en pipette på 1000 μL (figur 2E).
- Overfør cellene til fire 15 ml rør + siler. Skyll silene med 10 ml HBSS+/+ (figur 2F).
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C) og fjern supernatanten. Fyll pelleten forsiktig om med 10 ml HBSS+/+ (figur 2G).
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C) og fjern supernatanten. Resuspender pelleten forsiktig med 6 ml sorteringsbuffer (trinn 1.4) (figur 2H).
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C) og fjern supernatanten. Tilsett 200 μL CD11b-mikroperleoppløsning (trinn 1.5) per rør og resuspender forsiktig (figur 2I).
- Inkuber rørene i 15-20 min ved 4 °C. Resuspend pelleten forsiktig med 6 ml sorteringsbuffer (figur 2I-J).
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C) og fjern supernatanten. Fyll pelleten forsiktig om med 8 ml sorteringsbuffer (figur 2K).
- Følg POSSEL-programmet på skilletegnet (se Materialtabell) for å klargjøre åtte kolonner. Overfør celler 1 ml med 1 ml på kolonnen. Vent til alle cellene passerer før du legger til en ny ml. Beregne CD11b+-celler på steril elueringsplate med 1 ml sorteringsbuffer (figur 2L).
- Samle CD11b+-celler i et nytt 50 ml rør (figur 2M).
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C) og fjern supernatanten. Fyll pelleten forsiktig om med 10 ml kaldt mikrogliamedium (trinn 1.6) (figur 2N).
- Tell CD11b+-cellene. Ved P8 bør man få ~650 000 celler per hjerne.
MERK: I den nåværende protokollen ble cellene talt ved hjelp av en automatisert celleteller (se Tabell over materialer). - Resuspendere cellene i kaldt mikrogliamedium til en endelig konsentrasjon på 650.000-700.000 celler / ml og dispensere i cellekulturplater.
MERK: 6-brønnsplatene er for Western Blot (2 ml per brønn); 12-brønnsplatene er for RT-qPCR-analyse (1 ml per brønn), og 96-brønnsplatene er for fagocytisk analyse (250 μL per brønn); Alle tre ble brukt til dette arbeidet. I dette manuskriptet er imidlertid resultatene fra Western Blot-analysen ikke vist, men det er mulig å utføre med denne protokollen. - Platene plasseres ved 37 °C med 5 % CO2 over natten. Bytt mediet forsiktig med en pipette på 1000 μL med forvarmet mikrogliamedium.
- Plasser platene ved 37 °C med 5 % CO2 over natten før stimulering.
MERK: Isolering av mikroglia fra mer enn 36 valper og etter P9 anbefales ikke. Dette vil øke risikoen for forurensning og akkumulering av celleavfall for å aktivere microglia.
4. Cellestimulering
- Klargjør stimuleringsreagenser i henhold til tabell 3 ved bruk av kommersielt tilgjengelige reagenser (se materialtabell).
- Legg til riktig volum i hver stimulert brønn.
MERK: Det riktige volumet avhenger av konsentrasjonen av stimulansen og størrelsen på brønnen. - Plasser platene ved 37 °C med 5 % CO2til stimuleringen er over 6 timer, 24 timer eller 48 timer.
- For Western Blot-analysen aspirerer du supernatanten og tilsetter 50 μL proteinlysebuffer (se Materialtabell) med en pipette. Bruk tips, skrap bunnen av platen for å løsne de lysede cellene og overfør dem til 1,5 ml rør. Oppbevares ved -80 °C.
MERK: Kulturplatene kan oppbevares i årevis ved -80 °C hvis supernatanten aspireres riktig. - For RT-qPCR-analyse 6,31, aspirere supernatanten og lagre kulturplatene direkte ved -80 ° C til mRNA-ekstraksjon (trinn 5).
- For fagocytisk analyse, se trinn 6.
5. mRNA-ekstraksjon og RT-qPCR-analyse
- Utfør RNA-ekstraksjon, RT-PCR og RT-qPCR etter produsentens protokoll (se materialtabell). Se tabell 4 for primersekvensene 5,6,31.
- Utfør RT-qPCR-analyse ved å følge den tidligere publiserte rapporten5.
6. Fagocytisk analyse
- Stimulere cellene og utføre fagocytisk analyse i løpet av de siste 3 timene av stimuleringen. For eksempel, for stimulering av 6 timer, start fagocytisk analyse etter 3 timers stimulering; og for stimulering av 12 timer, start fagocytisk analyse 9 timer etter begynnelsen av stimuleringen.
- Beregn antall perler som trengs for å forberede med tanke på forholdet (1 celle: 50 perler). For en brønn på 96-brønnsplaten kreves 8,1 x 106 perler. Forbered perleblandingen i henhold til tabell 5.
MERK: Vortex hetteglasset med perler forsiktig før tilsetning til PBS/FBS-blandingen. - Rug i 1 time i et vannbad ved 37 °C. Vortex hvert 10. minutt.
- Beregn løsningsvolumet som skal legges til hver brønn. Legg til løsningen og inkuber i 3 timer.
- Skyll brønnene tre ganger med 1x PBS. Les fluorescensutslippet ved 550 nm (Cy3-utslippsbølgelengde).
7. Renhet kvalitetskontroll
- Evaluer renheten av CD11b magnetisk isolasjon ved flowcytometri (FACS) (før og etter cellesortering), og utfør deretter RT-qPCR.
- Tell cellene og resuspender i FACS-bufferen (PBS + 2 mM EDTA + 0,5 % av Bovine Serum Albumin) for å oppnå en fortynning på 10 x 106 celler/ml etter trinn 3,5 og trinn 3,14.
- Etter 15 minutter av den konvensjonelle Fc-blokkeringen 32,33, inkuber cellene i 15 minutter med levedyktighetssonde (FVS780) og fluoroforkonjugerte antistoffer mot mus CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 eller deres tilsvarende kontrollisotyper 32,33 i den konsentrasjonen som anbefales av produsentene (se materialtabell).
- Vask cellene med FACS-buffer, fiks og permeabiliser med et kommersielt tilgjengelig permeabiliseringssett (se Materialtabell).
- Utfør Fc-blokkering igjen på de permeabiliserte cellene, og inkubert deretter med fluoroforkonjugert antistoff mot NeuN (se materialtabell) eller dets kontrollisotype i 15 minutter.
- Utfør FACS-analyse etter vask med FACS-buffer.
- Etter å ha ekskludert dublettene og de døde cellene basert på henholdsvis morfologiske parametere og FVS780-farging, velg gatingstrategien for overflateuttrykket av CX3CR1 (mikroglia), ACSA-2 (astrocytter), O4 (oligodendrocytter) og intracellulær tilstedeværelse av NeuN (nevroner) for analyse av prosentandelen av positive celler.
- Etter trinn 5, trekk ut mRNA og utfør RT-qPCR for å kvantifisere Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin og Gfap mRNA. Normaliser Cq ved å bruke Rpl13a mRNA som reporter, og utfør et relativt uttrykk for Itgam mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia er den CNS-bosatte makrofagen som aktiveres når den utsettes for miljøutfordringer (traumer, giftige molekyler, betennelse) 4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-studier på mikroglia brukes ofte til å evaluere celleautonome mekanismer relatert til disse miljøutfordringene og karakterisere aktiveringstilstanden etter farmakologisk eller genetisk manipulasjon. Her presenteres en tilnærming for å isolere primær mikroglia på ungdomsstadiet ved hjelp av magnetiske koblede perler.
En enkel avlesning for mikroglial aktivering in vitro er å kvantifisere mRNA-ekspresjon av flere mikrogliale reaktivitetsmarkører assosiert med en proinflammatorisk fenotype (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) eller en antiinflammatorisk fenotype (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3) 5,6,31. Disse fenotypene ble beskrevet avhengig av mRNA-uttrykk etter proinflammatorisk (IL-1β, LPS) eller antiinflammatorisk (IL-4 eller IL-10) stimulus. Noen markører klassifiseres som immunregulerende markører fordi de oppreguleres gjennom pro- og antiinflammatorisk stimulering (figur 3A). Denne klassifiseringen ble beskrevet tidligere av vårt team 5,6,31. Etter 48 timer ble isolert mikroglial stimulert med pro- og antiinflammatorisk stimulus i 4 timer eller 24 timer. mRNA ble ekstrahert, og RT-qPCR kvantifisert genuttrykk. Ved 4 timer og 24 timer induseres proinflammatoriske og immunregulerende markører av IL-1β, IL-1β + IFN-γ og LPS 5,6,31. Ved 4 timer induserer IL-4-stimulering også den immunregulerende markøren Il-1rn6. De induseres sterkt ved 4 timer etter IL-4-stimulering angående antiinflammatoriske markører. Interessant nok er Cd206 også betydelig oppregulert 24 timer etter IL-1β-stimulering6 (figur 3B).
For å evaluere fagocytisk aktivitet av mikroglia in vitro, ble fluorescerende Cy3 PVC-perler brukt. De ble forhåndsbehandlet med føtalt bovint serum (FBS) for å lette fagocytose ved mikroglia. Microglia ble polarisert mot proinflammatorisk fenotype ved stimulering med IL-1β + IFN-γ eller LPS i 3 timer eller 21 timer. Tre timer før slutten av stimuleringen ble Cy3-perler inkubert med mikrogliaceller. Etter skylling med 1x PBS ble fluorescensintensiteten i hver brønn kvantifisert. Kvantifisering i forhold til brønner uten perler ble uttrykt, og representative bilder ble tatt (figur 4). Etter 6 timers stimulering begynner mikroglia å fagocyte Cy3-perler bare under IL-1β + IFN-γ. Etter en 24 timers stimulering er det en økning av Cy3-fluorescens for begge typer stimulering. Denne økningen av Cy3-fluorescens fremhever økt fagocytisk aktivitet (figur 4C).
Flowcytometri (FACS) og RT-qPCR ble utført for å evaluere mikrogliakulturens renhet. Ulike hjernecellulære populasjoner kan skilles ved flowcytometri: CX3CR135 for mikroglia, O4 for oligodendrocytter 36, NeuN for nevroner 37 og ACSA-2 for astrocytter38. Etter dissosiasjon er alle hjerneceller tilstede; Etter cellesortering med CD11b-antistoff er imidlertid bare mikroglia og små mengder O4-celler til stede (figur 5A). 48 timer etter primær cellekultur finnes kun mikrogliamarkører som evaluert ved RT-qPCR (figur 5B).
Figur 1: Trinnvis representasjon som viser fjerning av hjernen fra skallen. (A-C) Små sakser ble brukt til å kutte huden fra nakken til nesen etter sagittal sutur. (D-E) Den lille saksens spisser ble satt inn i Foramen magnum parallelt med skallen, og fra hver side til øynene ble forsiktig kuttet. (F) Hodeskallen og hjernen ble løsnet fra hodet ved å kutte mellom øynene med liten saks. (G-I) Hodeskallen ble grepet nær olfaktive pærer med to tang og revet forsiktig for ikke å skade den underliggende hjernen. (J) Lillehjernen og olfactive pæren ble fjernet med et barberblad, og hjernen ble kuttet i to stykker. (K) Hjernebitene ble plassert i en petriskål som inneholdt 30-40 ml HBSS-/-. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av hjernedissosiasjoner og isolering av mikrogliaceller. (A-C) Etter P8 musehjernedisseksjon og fjerning av olfaktive pærer og lillehjernen ble hjernen først overført til en petriskål med HBSS+/+, og deretter til dissosiasjonsrør som inneholdt dissosiasjonsblandingen. C-rørene ble plassert på dissosiatoren (med oppvarmingsmodus), og NTDK-programmet ble startet (D). (E) På slutten av programmet ble rørene sentrifugert ved 300 x g i 20 s ved 4 ° C; dissosiasjon ble deretter fullført ved pipettering tre ganger opp og ned med en 1000 μL pipette. (F) Celler ble deretter overført til 15 ml rør + siler på 70 μm og skyllet med 10 ml HBSS +/+. (G) Prøvene ble deretter sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, supernatanten ble fjernet, og pelleten ble resuspendert med 10 ml HBSS+/+. (H) Rørene ble igjen sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C; supernatanten ble fjernet, og deretter ble pelleten resuspendert i 6 ml sorteringsbuffer. (I) Rørene ble sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, supernatanten ble fjernet, og CD11b-mikroperlen (200 μL)-løsningen ble tilsatt. Rørene ble inkubert i 15-20 minutter ved 4 °C, deretter resuspendert i 6 ml sorteringsbuffer (J) og sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. (K) Supernatanten ble fjernet, og pelleten ble forsiktig resuspendert i 8 ml sorteringsbuffer. (L) Start deretter POSSEL-programmet på separatoren for å forberede kolonner. Celler ble overført 1 ml med 1 ml på kolonnen, og CD11b-celler ble eluert på en steril elueringsplate med 1 ml sorteringsbuffer. (M) CD11b-celler ble samlet i et nytt 50 ml rør og sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten ble fjernet. (N) Pelleten ble forsiktig resuspendert i 10 ml kaldt mikrogliamedium i det siste trinnet. Cellene ble talt og fortynnet i mikroglialmediet til en endelig konsentrasjon på 650 000-700 000 celler/ml dispensert i cellekulturplater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikroglial aktivering etter utstilling av miljøutfordringer. (A) Forenklet skjematisk fremstilling av mikrogliaaktiveringsspekteret. (B) Relativ kvantifisering av mikrogliaaktiveringsmarkører etter 4 timer eller 24 timers stimulering. Toveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multiple sammenligningstest39 (n = 5-15); feilfelt representerer SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Evaluering av fagocytisk aktivitet av mikroglia in vitro. (A) Representative bilder av microglia Cy3-perler (i rødt) fagocytose etter stimulering på 6 timer eller 24 timer. Bildene ble anskaffet ved hjelp av 20x målet med fluorescensmikroskopet. Skala bar = 100 μm. (B) Relativ kvantifisering av fluorescens avgir per brønn. Statistikk ble utført ved hjelp av toveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multiple sammenligningstest (n = 4-7); feilfelt representerer SEM; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Representativt bilde av mikroglia (IBA-1 + celler i grønt) Cy3-perler (i rødt) fagocytose etter 6 timers stimulering. Bildene er anskaffet ved hjelp av et 40x mål for det konfokale mikroskopet. Skala bar = 300 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Evaluering av CD11b magnetisk isolasjonsrenhet ved flowcytometri før og etter cellesortering. (A) Rapporterer eksempler fra celletelleren før og etter cellesortering, og fremhever cellekonsentrasjon og levedyktighet. (B) X-aksen representerer cellekonsentrasjon (celle/ml) og levedyktighet (%) etter CD11b-cellesortering. Kolonne søylediagram; feilfelt representerer SEM (n = 16). Fenotypisk og genuttrykksanalyse av cellepopulasjonsmarkører før og etter CD11b+ cellesortering. Etter dissosiasjon ble CD11b+-celler fra P8-musehjerner magnetisk sortert. Ekspresjon av mikroglia (CX3CR1), oligodendrocytter (O4 eller Olig2 mRNA), nevroner (NeuN eller Synaptophysin mRNA)) og astrocytter (ACSA-2 eller Gfap mRNA) markører ble analysert før og etter sortering. (C) FACS-analyse av CX3CR1-, O4-, NeuN- og ACSA-2-uttrykk. X-aksen representerer prosentandelen av levende celler og celletall. (D) Relativ kvantifisering av CD11b+-celler ekspresjon av Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin og Gfap mRNA (x-akse representerer relativt mål-mRNA-uttrykk til Itgam mRNA). Kolonne søylediagram; feilfelt representerer SEM (n = 7). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | For en C-Tube (μL) | For fire C-rør (μL) |
| Buffer X | 2850 | 11400 |
| Enzym P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzym A (DNAse) | 15 | 60 |
| Buffer Y | 30 | 120 |
| Total | 2970 | 11880 |
Tabell 1: Fremstilling av dissosiasjonsblandingen.
| Løsning | For ett rør (μL) | For fire rør (μL) |
| CD11b Mikroperler | 20 | 80 |
| Sortere buffer | 180 | 720 |
| Total | 200 | 800 |
Tabell 2: Tilberedning av CD11b mikroperleoppløsning.
| Stimulering | Konsentrasjon (ng/ml) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
Tabell 3: Stimuleringsreagensene.
| Gener | Protein | Fremover | Omvendt |
| Arg1 | Arginase 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| Cd206 | Klynge av differensiering 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA PÅ | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| Cd32 | Klynge av differensiering 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| Cd86 | Klynge av differensiering 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| GFAP | Glial fibrillært surt protein | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | Insulinlignende vekstfaktor 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Interleukin 1-reseptorantagonist | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Interleukin 4-reseptorantagonist | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | HANDLE CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Integrin alfa M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lectin Glactoside-Binding løselig 3 | GAT CAC AAT KATT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nr2 | Nitrogenoksidsyntase 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Oligodendrocytt transkripsjon faktor 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandin endoperoksidsyntase 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | Ribosomalt protein L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Suppressor av cytokin 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG PÅ |
| Sphk1 | Sfingosinkinase 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Synaptofysin | ATCTCAGTGTCCCGATCCCA | GCTGTCTCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Tumor nekrose faktor α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tabell 4: RT-qPCR primersekvenser.
| Stimulering | For 1-brønn | For n-brønner |
| Cy3 Perler (1 celle: 50 perler) | 8, 100, 000 | X = (8, 100 000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
Tabell 5: Fremstilling av perleblandingen for fagocytisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nåværende arbeidet presenterer en primær mikroglial cellekultur ved hjelp av magnetisk sorterte CD11b + celler. I tillegg til mikroglial funksjonsevaluering (RT-qPCR og fagocytiske analyser) ble også mikrogliakulturrenhet bestemt.
Klassiske microglia cellekulturer er vanligvis generert fra P1 eller P2 gnager nyfødte hjernen og co-kultur med astrocytter i minst 10 dager. Microglia separeres deretter mekanisk ved hjelp av en orbital shaker. Metoden for å isolere og dyrke mikroglia in vitro ble beskrevet for første gang på slutten av 1990-tallet fra hjernen til nyfødte rotter40,41. Siden da har det blitt mye brukt til å analysere mikrogliale fenotyper som aktivert / hvilende mikroglia eller pro-inflammatorisk / antiinflammatorisk mikroglia. Videre har dette eksperimentet vært grunnleggende for å definere microglia som nevrotoksiske celler co-dyrket med nevroner. I 2014 beskrev imidlertid Biber og medarbeidere tre betydelige ulemper ved å studere microglia in vitro ved hjelp av klassiske metoder42. (1) Forsøket bruker rotte/mus-nyfødte hjerner (P1/P2), og disse cellene passerte ikke gjennom alle modningsprosessene som kan oppstå in vivo. (2) I samkulturmediet brukes 10% FBS; Men in vivo møter Microglia aldri slike komponenter i et "normalt" miljø. (3) Nyere studier viser at in vivo microglia begrenses av flere hemmende komponenter som ikke finnes i kulturen43,44. Videre beskrev mange studier (elektrofysiologisk45 og transkriptomisk46,47) ikke-stimulert primær mikroglia som "aktivert".
Den nåværende metoden foreslår en alternativ teknikk for å generere mikrogliakulturer ved hjelp av magnetisk cellesortert teknologi. Med denne protokollen høstes mikroglia bare noen få timer etter at dyret dør uten noe samkulturtrinn. Videre dyrkes mikroglia bare 2 dager in vitro (DIV) før stimulering sammenlignet med 10-14 DIV, inkludert kokultur i andre protokoller. Dette gjør det mulig å komme nærmere de mikrogliale fysiologiske forholdene. Denne prosedyren for dyrking av microglia in vitro ble tidligere publisert 25,26,27,28,29. Det nåværende arbeidet presenterte en optimalisert protokoll for nyfødte mus, standardisert for å redusere antall dyr som brukes og uten myelinfjerningstrinn.
For å redusere antall mus som brukes til primær mikrogliakultur, bestemte vi oss for å jobbe på P8 i OF1-stammen. På dette stadiet av hjernens utvikling i OF1-stammen ble det oppnådd opptil 750 000 mikrogliaceller per hjerne, i motsetning til 500 000 mikrogliaceller per C57BL6 / J-stammemusehjerne i samme alder. C57BL6/J-stammen er publisert på et annet utviklingsstadium for mikrogliakultur27,28. Den nåværende protokollen har også blitt brukt med Fmr1KO-mus for å evaluere fagocytiske egenskaper av mikroglia knyttet til denne mutasjonen og LysMCre: Dicerfl / + mus for å vurdere mikroglial aktiveringsfenotyper ved RT-qPCR. Dermed er arbeid med C57BL / 6 J musestamme litt mer utfordrende enn å jobbe med OF1-belastning på grunn av (1) færre mikrogliaceller per hjerne på samme utviklingsstadium og (2) skjørhet av mikroglia som er mer utsatt for å dø på grunn av mekanisk aktivering (se feilsøkingsdelen).
Avhengig av utviklingsstadiet som er valgt for primær mikrogliakultur, må myelinisering vurderes siden det starter rundt P5. I en klassisk mikrogliakultur (ved P0-2) er myelinisering ikke et problem; I andre publiserte metoder for å isolere mikroglia fjernes imidlertid myelin ved bruk av Percoll-gradient eller anti-myelinantistoffer 25,26,28,29. I denne protokollen avlives dyr ved P8 når myelinisering allerede har begynt; Store volumer brukes til å skylle pellets, og det nydannede myelin kan fjernes uten ytterligere prosedyrer. Dette kan være en feilsøkingsmetode (se delen Rusk).
Produsenten og tidligere publisert mikroglial magnetisk isolasjon brukte DMEM F-12 media supplert med 10% FBS - 1% P / S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 beskrev at mikroglia sjelden kommer i kontakt med serum in vivo. Faktisk inneholder sentralnervesystemets ekstracellulære væske sjelden protein og bioaktive faktorer29. Derfor brukes serumfri makrofag (SFM) medium + 1% P/S i denne protokollen.
Magnetisk aktivert cellesortering (MACS) protokoll kan også isolere og dyrke postnatal rotte microglia med noen modifikasjoner25,29. Rotte microglia er faktisk isolert ved hjelp av Microbead-belagt anti-rotte CD11b / c. På grunn av at hjernestørrelsen er større enn P8-mus, bør imidlertid bare en hjerne per dissosiasjonsrør per kolonne brukes. Microglia ble isolert fra P10-14 rottehjerner i tidligere publiserte protokoller, inkludert myeliniseringsfjerningstrinn29. Til tross for tidligere kommentarer om kulturmedium, for rottemikroglialkultur, anbefales F-12-medier + 10% FBS og 550.000-600.000 celler per 12-brønnsplate for nedstrøms applikasjoner.
Feilsøking
Dissosiasjon: Dissosiasjonsblandingen som beskrevet i tabell 1 beregnes for den maksimale mengden hjerne som kan dissosieres og fortsette ved P8 hos OF1-mus. Hvis mer hjerne legges til, kan dissosiasjon ikke fullføres på slutten av trinn 3.2, og ikke-dissosiert hjernevev vil bli funnet. I dette tilfellet anbefales det å kjøre NTDK-programmet på røret med ikke-dissosiert vev og holde de andre rørene ved 4 ° C.
Tilstoppet sil og/eller kolonne: Som beskrevet tidligere beregnes dissosiasjonsblandingen for den maksimale mengden hjernevev som kan passere gjennom silen i trinn 3.5. Hvis mer hjerne er lagt til, kan filtreringen ta lengre tid, men til slutt vil den passere gjennom. Det anbefales å resuspendere cellesuspensjonen forsiktig på toppen av silen til all cellesuspensjon er filtrert.
I løpet av trinn 3.12 må eksperimentøren passere merket cellesuspensjon gjennom en kolonne inne i magnetfeltet. Kolonnen kan være tilstoppet på dette stadiet av prosedyren (1) hvis for mye hjernevev er dissosiert per rør, (2) hvis resuspenderingsvolumet ikke er riktig, eller (3) hvis det er noen mekanisk indusert celledød (noe DNA kan være tilstede); i så fall anbefales det å fjerne det synlige DNA med en 200 μL spiss forsiktig.
Mekanisk indusert celledød og/eller aktivering: Protokollen beskrevet her utgjør en hovedutfordring: å unngå mekanisk aktivering. For å gjøre det, er det viktig å pipette forsiktig og holde sentrifugeringshastigheten lav. Hvis ikke, kan umoden mikroglia dø på grunn av mekanisk belastning eller bli aktivert, noe som fører til høy variasjon i RT-qPCR-resultater.
Rusk: I denne prosedyren blir dyr avlivet ved P8 når myelinisering bare begynner, og derfor er det ingen prosedyre for å fjerne myelin nøyaktig. På dette utviklingsstadiet kan myelin lett fjernes ved sentrifugering. Resuspenderingsvolumene beskrevet i denne prosedyren beregnes for å fjerne maksimal myelin. Hvis ikke respektert, kan myelin vises som celle rusk i kultur brønner. Eksperimentøren kan ikke fjerne den helt når den observeres i kulturbrønner ved å bytte medium på dag 2. Mikrogliaceller har en tendens til å fagocytere dette rusk, noe som kan påvirke mikroglial aktiveringstilstanden før stimulering og dermed påvirke eksperimentell reproduserbarhet.
All tidligere beskrevet feilsøking (Dissosiasjon, tilstoppet sil og/eller kolonne, mekanisk indusert celledød og/eller aktivering og rusk) kan føre til variasjon i antall CD11b+-celler oppnådd ved celletelling (figur 5B). Vi anbefaler å være veldig oppmerksom på dette for å optimalisere det endelige celleutbyttet.
Forurensning: I denne protokollen dyrkes mikrogliaceller i SFM-medium + 1 % P/S. SFM-medium kan lett bli forurenset. Derfor anbefales det å aliquot mediet i 50 ml rør etter tilsetning av P/S for å unngå middels kontaminering. Videre må all eksperimentering utføres så mye som mulig under sterile forhold.
mRNA kvantitet/kvalitet: Teamet vårt jobber med miRNA- eller siRNA-transfeksjoner. Den nåværende protokollen er svært kompatibel med slike applikasjoner som bruker magnetisk transfeksjon med en liten modifikasjon av protokollen; eksperimentøren trenger å høste 700 000 celler per 12-brønnsplate for å få mRNA av høy kvalitet for RT-qPCR. Selv om RNAseq ikke er utført i denne studien, utførte vårt team tidligere mRNA-ekstraksjon for RNAseq ved bruk av 500 000 celler per 12-brønnplate48.
Avslutningsvis kan denne protokollen reproduseres, og det forventes å være en ny standard for isolering av mikroglia på et ungdomsutviklingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Figurer ble opprettet ved hjelp av BioRender. Forskning er finansiert av Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, og et tilleggsstipend fra Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS og Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al.
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
