Summary
Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.
Abstract
A micróglia, como macrófagos residentes no cérebro, são fundamentais para várias funções, incluindo a resposta ao estresse ambiental e a homeostase cerebral. A micróglia pode adotar um grande espectro de fenótipos de ativação. Além disso, a micróglia que endossa o fenótipo pró-inflamatório está associada a distúrbios neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos. Estudos in vitro são amplamente utilizados em pesquisas para avaliar potenciais estratégias terapêuticas em tipos específicos de células. Neste contexto, estudar a ativação microglial e a neuroinflamação in vitro usando culturas microgliais primárias é mais relevante do que as linhagens celulares microgliais ou a microglia derivada de células-tronco. No entanto, o uso de algumas culturas primárias pode sofrer de falta de reprodutibilidade. Este protocolo propõe um método reprodutível e relevante de isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos. A ativação microglial utilizando vários estímulos após 4 h e 24 h por quantificação da expressão de mRNA e um ensaio fagocítico de esferas Cy3 é demonstrado aqui. Espera-se que o presente trabalho forneça uma técnica facilmente reprodutível para isolar micróglias fisiologicamente relevantes dos estágios de desenvolvimento juvenis.
Introduction
Microglia são as células semelhantes a macrófagos residentes no sistema nervoso central derivadas de precursores eritropoiéticos do saco vitelino que migram para o neuroepitélio durante o desenvolvimento embrionário inicial1. Além de suas funções de imunidade, eles também desempenham um papel significativo durante o neurodesenvolvimento, particularmente para sinaptogênese, homeostase neuronal e mielinização2. Na idade adulta, a micróglia desenvolve longos processos celulares para escanear o ambiente continuamente. Em caso de rupturas de homeostase, como lesão cerebral ou doença cerebral, a micróglia pode alterar sua aparência morfológica para adotar uma forma de ameboide, migrar para a área lesada, aumentar e liberar muitos fatores citoprotetores ou citotóxicos. As micróglias apresentam estados de ativação heterogêneos dependendo do seu estágio de desenvolvimento e do tipo de lesão sofrida 3,4,5. Neste estudo, esses estados de ativação são amplamente classificados em três fenótipos diferentes: pró-inflamatório/fagocítico, anti-inflamatório e imunorregulador, tendo em vista que, na realidade, a situação provavelmente será mais complexa6.
Estudar a ativação microglial in vivo e a triagem de estratégias neuroprotetoras nos estágios iniciais do desenvolvimento cerebral podem ser desafiadores devido (1) à fragilidade dos animais antes do desmame e (2) ao baixo número de células microgliais. Portanto, estudos in vitro sobre micróglias são amplamente utilizados para toxicidade 7,8,9, estratégias neuroprotetoras5,10,11,12,13,14 e coculturas 15,16,17,18,19,20,21 . Estudos in vitro podem usar linhagens celulares microgliais, microglia derivada de células-tronco ou cultura de micróglia primária. Todas essas abordagens têm vantagens e desvantagens, e a escolha depende da questão biológica inicial. Os benefícios do uso de culturas primárias de micróglias são o fundo genético homogêneo, a história livre de patógenos e o controle do momento em que as micróglias são estimuladas após a morte animal22.
Ao longo dos anos, diferentes métodos (citometria de fluxo, agitação ou marcação magnética) foram desenvolvidos para a cultura de micróglias primárias de roedores, tanto recém-nascidos quanto adultos 23,24,25,26,27,28,29. No presente trabalho, o isolamento de micróglias de filhotes de camundongos recém-nascidos é realizado utilizando-se a tecnologia de classificação de células ativadas magneticicamente descritas anteriormente, utilizando CD11b anti-camundongo revestido por microesferas25,27,29. CD11b é um receptor de integrina expresso na superfície das células mielóides, incluindo a micróglia. Quando não há desafio inflamatório dentro do cérebro, quase todas as células CD11b + são microglia30. Comparado a outros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, o presente protocolo equilibra análises de ativação microglial ex vivo imediata e cultura microglial primária in vitro comum. Assim, as micróglias são (1) isoladas no dia pós-natal (P)8 sem remoção de mielina, (2) cultivadas sem soro e (3) expostas a siRNA, miRNA, composto farmacológico e/ou estímulos inflamatórios apenas 48 h após o isolamento cerebral. Cada um desses três aspectos torna o protocolo atual relevante e rápido. Em primeiro lugar, o uso da micróglia pediátrica permite a obtenção de células viáveis dinâmicas e reativas em cultura sem a necessidade de uma etapa adicional de desmielinização que poderia potencialmente modificar a reatividade microglial in vitro. O presente protocolo tem como objetivo aproximar-se o máximo possível do ambiente fisiológico da micróglia. De fato, a micróglia nunca encontra soro, e esse protocolo também não requer o uso de soro. Além disso, expor a micróglia já 48 h após a cultura impede que eles percam suas faculdades fisiológicas.
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Protocol
O protocolo foi aprovado e todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes institucionais do Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, França). O isolamento magnético da micróglia dos cérebros de 24 filhotes de camundongos OF1 (machos e fêmeas) em P8, divididos em placas de 6 poços, 12 ou 96 poços, são apresentados. O trabalho experimental foi realizado sob um capô para manter as condições estéreis.
1. Preparação de soluções estéreis para isolamento e cultura celular
- Prepare 50 mL de 1x Solução Sal Balanceada de Hanks (HBSS) sem Ca 2+ e Mg2+ (HBSS-/-) a partir da solução 10x comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais).
- Preparar a mistura de dissociação de acordo com a composição fornecida no Quadro 1 utilizando um kit de dissociação tecidual comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
- Prepare 200 mL de 1x HBSS com Ca 2+ e Mg2+ (HBSS+/+) a partir da solução 10x disponível comercialmente.
- Prepare 200 mL de 1x PBS + 0,5% BSA (referido como buffer de classificação celular).
- Preparar microesferas CD11b de acordo com a Tabela 2.
- Preparar 500 mL de meio de cultura livre de soro de macrófagos (SFM) + 1% de Penicilina-Estreptomicina (P/S). Fazer alíquotas de tubos de 50 ml e armazená-las a 4 °C. Isso é referido como o meio da micróglia mais adiante no texto.
NOTA: Todas as soluções de isolamento devem ser preparadas na hora em condições estéreis no dia da experimentação e mantidas no gelo. O meio de cultura de células de micróglia pode ser preparado, alicitado em tubos de 50 mL e mantido a 4 °C para uso futuro. A filtração não é necessária.
2. Dissecção cerebral
- Decapitar a cabeça do filhote usando uma tesoura grande sem anestesia geral prévia.
- Corte a pele do pescoço ao nariz seguindo a sutura sagital (15-20 mm) com tesoura pequena (Figura 1A-C).
- Insira as pontas de uma pequena tesoura dentro do forame magno paralelo ao crânio. Corte de cada lado cuidadosamente para os olhos (Figura 1D,E).
- Corte entre os olhos com uma pequena tesoura para separar o crânio e o cérebro da cabeça (Figura 1F).
- Com duas pinças, agarre o crânio perto dos bulbos olfativos e rasgue o crânio com cuidado, tomando cuidado para não danificar o cérebro subjacente (Figura 1G-I).
- Remova o cerebelo e o bulbo olfativo com uma lâmina de barbear e corte o cérebro em dois pedaços (Figura 1J).
- Coloque os pedaços cerebrais em uma placa de Petri contendo 30-40 mL de HBSS-/- (Figura 1K).
3. Dissociação cerebral e isolamento microglial magnético
NOTA: Todas as manipulações e resuspensões celulares devem ser realizadas com uma pipeta de 1.000 μL com grande cautela. A aplicação de uma alta ação mecânica pode ativar ou matar as células da micróglia.
- Transferir 12 pedaços cerebrais (~1,2 g) por tubo de dissociação contendo mistura de dissociação de acordo com a Tabela 1. Para 24 filhotes, foram necessários quatro tubos C (Figura 2A-B).
- Coloque os tubos C no dissociador (com o modo de aquecimento). Inicie o programa NTDK otimizado no equipamento de acordo com as instruções do fabricante (Figura 2D).
- Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recolher todas as células. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL (Figura 2E).
- Transfira as células para quatro tubos de 15 mL + filtros. Enxaguar os filtros com 10 mL de HBSS+/+ (Figura 2F).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspeite cuidadosamente o pellet com 10 mL de HBSS+/+ (Figura 2G).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuscite cuidadosamente o pellet com 6 mL de tampão de classificação (etapa 1.4) (Figura 2H).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Adicionar 200 μL de solução de microesferas CD11b (passo 1.5) por tubo e voltar a suspender cuidadosamente (Figura 2I).
- Incubar os tubos durante 15-20 min a 4 °C. Ressuspeite cuidadosamente o pellet com 6 mL de tampão de classificação (Figura 2I-J).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspeite cuidadosamente o pellet com 8 mL de tampão de classificação (Figura 2K).
- Siga o programa POSSEL no separador (consulte Tabela de Materiais) para preparar oito colunas. Transfira células 1 mL por 1 mL na coluna. Aguarde a passagem de todas as células antes de adicionar outro ml. Elute células CD11b+ em placa de eluição estéril com 1 mL de tampão de classificação (Figura 2L).
- Agrupe células CD11b+ em um novo tubo de 50 mL (Figura 2M).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressussuscite cuidadosamente o pellet com 10 mL de meio microglia frio (etapa 1.6) (Figura 2N).
- Conte as células CD11b+. Em P8, deve-se obter ~ 650.000 células por cérebro.
NOTA: No presente protocolo, as células foram contadas usando um contador de células automatizado (consulte Tabela de Materiais). - Ressuspender as células em meio microglia frio até uma concentração final de 650.000-700.000 células/mL e dispensar em placas de cultura celular.
NOTA: As placas de 6 poços são para Western Blot (2 mL por poço); as placas de 12 poços são para análise de RT-qPCR (1 mL por poço), e as placas de 96 poços são para ensaio fagocítico (250 μL por poço); todos os três foram utilizados para este trabalho. No entanto, neste manuscrito, os resultados da análise de Western Blot não são mostrados, mas é possível realizar com este protocolo. - Colocar as placas a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite. Mude o meio cuidadosamente com uma pipeta de 1.000 μL com meio microglia pré-aquecido.
- Coloque as placas a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite antes da estimulação.
NOTA: O isolamento da micróglia de mais de 36 filhotes e após o P9 não é recomendado. Isso aumentará o risco de contaminação e acúmulo de detritos celulares para ativar a micróglia.
4. Estímulos celulares
- Preparar os reagentes de estimulação de acordo com o Quadro 3 utilizando os reagentes comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais).
- Adicione o volume apropriado em cada poço estimulado.
NOTA: O volume apropriado depende da concentração do estímulo e do tamanho do poço. - Coloque as placas a 37 °C com 5% de CO2até o final da estimulação às 6 h, 24 h ou 48 h.
- Para a análise de Western Blot, aspirar o sobrenadante e adicionar 50 μL de tampão de lise proteica (ver Tabela de Materiais) com uma pipeta. Usando pontas, risque o fundo da placa para separar as células lisadas e transferi-las para tubos de 1,5 mL. Conservar a -80 °C.
NOTA: As placas de cultura podem ser armazenadas durante anos a -80 °C se o sobrenadante for aspirado correctamente. - Para a análise RT-qPCR 6,31, aspirar o sobrenadante e armazenar as placas de cultura diretamente a -80 °C até a extração do RNAm (etapa 5).
- Para o ensaio fagocítico, consulte o passo 6.
5. Extração de mRNA e análise RT-qPCR
- Execute a extração de RNA, RT-PCR e RT-qPCR seguindo o protocolo do fabricante (consulte Tabela de Materiais). Consulte a Tabela 4 para as sequências de primer 5,6,31.
- Execute a análise RT-qPCR seguindo o relatório publicado anteriormente5.
6. Ensaio fagocítico
- Estimular as células e realizar ensaio fagocítico durante as últimas 3 h da estimulação. Por exemplo, para estimulação de 6 h, inicie o ensaio fagocítico após 3 h de estimulação; e para estimulação de 12 h, iniciar o ensaio fagocítico 9 h após o início da estimulação.
- Calcule o número de contas necessárias para se preparar considerando a proporção (1 célula: 50 contas). Para um poço da placa de 96 poços, são necessárias 8,1 x 106 contas. Preparar a mistura de grânulos de acordo com a Tabela 5.
NOTA: Vórtice cuidadosamente o frasco para injetáveis de caldo de contas antes de adicionar à mistura PBS/FBS. - Incubar durante 1 h em banho-maria a 37 °C. Vórtice a cada 10 min.
- Calcule o volume de solução a ser adicionado a cada poço. Adicionar a solução e incubar durante 3 h.
- Lave os poços três vezes com 1x PBS. Leia a emissão de fluorescência a 550 nm (comprimento de onda de emissão Cy3).
7. Controle de qualidade da pureza
- Avaliar a pureza do isolamento magnético CD11b por citometria de fluxo (FACS) (antes e após a classificação celular) e, em seguida, realizar o RT-qPCR.
- Contar as células e ressuspender em tampão FACS (PBS + 2 mM de EDTA + 0,5% de Albumina Sérica Bovina) para obter uma diluição de 10 x 106 células/mL após a etapa 3.5 e a etapa 3.14.
- Após 15 min do bloqueio convencional de Fc 32,33, incubar as células por 15 min com sonda de viabilidade (FVS780) e anticorpos conjugados com fluoróforos contra CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 ou seus correspondentes isótipos de controle32,33 na concentração recomendada pelos fabricantes (ver Tabela de Materiais).
- Lave as células com tampão FACS, fixe e permeabilize com um kit de permeabilização comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais).
- Realize o bloqueio de Fc novamente nas células permeabilizadas e, em seguida, incube com anticorpo conjugado com fluoróforo contra NeuN (ver Tabela de Materiais) ou seu isótipo de controle por 15 min.
- Realize a análise FACS após a lavagem com tampão FACS.
- Após a exclusão dos dubletos e das células mortas com base em parâmetros morfológicos e coloração FVS780, respectivamente, selecione a estratégia de bloqueio para a expressão superficial de CX3CR1 (micróglia), ACSA-2 (astrócitos), O4 (oligodendrócitos) e presença intracelular de NeuN (neurônios) para a análise da porcentagem de células positivas.
- Após a etapa 5, extraia o mRNA e execute o RT-qPCR para quantificar o mRNA Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin e Gfap . Normalize o Cq usando o mRNA Rpl13a como repórter e execute uma expressão relativa ao mRNA do Itgam .
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Representative Results
A micróglia é o macrófago residente do SNC que é ativado quando exposto a desafios ambientais (trauma, moléculas tóxicas, inflamação)4,5,6,34 (Figura 3A). Estudos in vitro sobre micróglia são comumente usados para avaliar mecanismos autônomos celulares relacionados a esses desafios ambientais e caracterizar o estado de ativação após manipulação farmacológica ou genética. Aqui, uma abordagem é apresentada para isolar a micróglia primária no estágio juvenil usando contas acopladas magnéticas.
Uma leitura fácil para a ativação microglial in vitro é quantificar a expressão de mRNA de vários marcadores de reatividade microglial associados a um fenótipo pró-inflamatório (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) ou a um fenótipo anti-inflamatório (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3)5,6,31. Esses fenótipos foram descritos dependendo da expressão do RNAm após estímulo pró-inflamatório (IL-1β, LPS) ou anti-inflamatório (IL-4 ou IL-10). Alguns marcadores são classificados como marcadores imunorreguladores por serem regulados positivamente por meio de estimulação pró e anti-inflamatória (Figura 3A). Essa classificação foi descrita anteriormente por nossa equipe 5,6,31. Após 48 h, microgliais isolados foram estimulados com estímulo pró e anti-inflamatório por 4 h ou 24 h. mRNA foram extraídos e RT-qPCR quantificada a expressão gênica. Às 4 h e 24 h, marcadores pró-inflamatórios e imunorreguladores são induzidos por IL-1β, IL-1β + IFN-γ e LPS 5,6,31. Às 4 h, a estimulação com IL-4 também induz o marcador imunorregulador Il-1rn6. Eles são induzidos fortemente às 4 h após a estimulação com IL-4 em relação aos marcadores anti-inflamatórios. Curiosamente, o Cd206 também é significativamente regulado 24 h após a estimulação com IL-1β6 (Figura 3B).
Para avaliar a atividade fagocítica da micróglia in vitro, foram utilizadas esferas fluorescentes de PVC Cy3. Eles foram pré-tratados com soro fetal bovino (FBS) para facilitar sua fagocitose por microglia. As micróglias foram polarizadas em direção ao fenótipo pró-inflamatório por estimulação com IL-1β + IFN-γ ou LPS por 3 h ou 21 h. Três horas antes do término da estimulação, as esferas Cy3 foram incubadas com células microgliais. Após o enxágue com 1x PBS, a intensidade de fluorescência em cada poço foi quantificada. A quantificação relativa aos poços sem contas foi expressa e imagens representativas foram obtidas (Figura 4). Após 6 h de estimulação, a micróglia começa a fagocitar as esferas Cy3 apenas sob IL-1β + IFN-γ. Após uma estimulação de 24 horas, há um aumento da fluorescência Cy3 para ambos os tipos de estimulação. Esse aumento da fluorescência Cy3 destaca o aumento da atividade fagocítica (Figura 4C).
Citometria de fluxo (CASC) e RT-qPCR foram realizadas para avaliar a pureza da cultura microglial. Diferentes populações celulares cerebrais podem ser distinguidas pela citometria de fluxo: CX3CR135 para microglia, O4 para oligodendrócitos 36, NeuN para neurônios 37 e ACSA-2 para astrócitos38. Após a dissociação, todas as células cerebrais estão presentes; no entanto, após a classificação celular com o anticorpo CD11b, apenas a micróglia e pequenas quantidades de células O4 estão presentes (Figura 5A). 48 h após a cultura celular primária, apenas marcadores de micróglia são encontrados, conforme avaliado pela RT-qPCR (Figura 5B).
Figura 1: Representação passo a passo mostrando a remoção do cérebro do crânio. (A-C) Pequenas tesouras foram usadas para cortar a pele do pescoço ao nariz após a sutura sagital. (D-E) As pontas da pequena tesoura foram inseridas dentro do forame magno paralelo ao crânio e, de cada lado até os olhos, foram cuidadosamente cortadas. (F) O crânio e o cérebro foram destacados da cabeça cortando-se entre os olhos com uma pequena tesoura. (G-I) O crânio foi agarrado perto dos bulbos olfativos com duas pinças e rasgado cuidadosamente para não danificar o cérebro subjacente. (J) O cerebelo e o bulbo olfativo foram removidos com uma lâmina de barbear, e o cérebro foi cortado em dois pedaços. (K) Os pedaços cerebrais foram colocados em uma placa de Petri contendo 30-40 mL de HBSS-/-. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação esquemática das dissociações cerebrais e isolamento de células microgliais. (A-C) Após a dissecção cerebral do rato P8 e a remoção dos bulbos olfativos e do cerebelo, os cérebros foram primeiro transferidos para uma placa de Petri com HBSS + / + e, em seguida, para tubos de dissociação contendo a mistura de dissociação. Os tubos C foram colocados no dissociador (com o modo de aquecimento) e o programa NTDK foi iniciado (D). (E) Ao final do programa, os tubos foram centrifugados a 300 x g por 20 s a 4 °C; a dissociação foi então completada pipetando três vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL. (F) As células foram então transferidas para tubos de 15 mL + filtros de 70 μm e enxaguadas com 10 mL de HBSS+/+. (G) As amostras foram então centrifugadas a 300 x g por 10 min a 4 °C, o sobrenadante foi removido e o pellet foi ressuspenso com 10 mL de HBSS+/+. (H) Os tubos foram novamente centrifugados a 300 x g por 10 min a 4 °C; o sobrenadante foi removido e, em seguida, o pellet foi ressuspenso em 6 mL de tampão de classificação. (I) Os tubos foram centrifugados a 300 x g por 10 min a 4 °C, o sobrenadante foi removido e a solução de microesferas CD11b (200 μL) foi adicionada. Os tubos foram incubados por 15-20 min a 4 °C e, em seguida, ressuspensos em 6 mL de tampão de classificação (J) e centrifugados a 300 x g por 10 min a 4 °C. (K) O sobrenadante foi removido e o pellet foi cuidadosamente ressuspenso em 8 mL de tampão de classificação. (L) Em seguida, inicie o programa POSSEL no separador para preparar colunas. As células foram transferidas 1 mL por 1 mL na coluna, e as células CD11b foram eluídas em uma placa de eluição estéril com 1 mL de tampão de classificação. (M) As células CD11b foram agrupadas em um novo tubo de 50 mL e centrifugadas a 300 x g por 10 min a 4 °C, e o sobrenadante foi removido. (N) O pellet foi cuidadosamente ressuspenso em 10 mL de meio microglia fria na última etapa. As células foram contadas e diluídas em meio microglial até uma concentração final de 650.000-700.000 células/mL dispensadas em placas de cultura celular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ativação microglial após exposição a desafios ambientais. (A) Representação esquemática simplificada do espectro de ativação microglial. (B) Quantificação relativa dos marcadores de ativação microglial após estimulação de 4 h ou 24 h. ANOVA two-way seguida do teste de comparações múltiplas de Dunnett39 (n = 5-15); as barras de erro representam o SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação da atividade fagocítica da micróglia in vitro. (A) Imagens representativas da fagocitose de microglia Cy3-beads (em vermelho) após estimulação de 6 h ou 24 h. As imagens foram adquiridas utilizando-se objetiva 20x do microscópio de fluorescência. Barra de escala = 100 μm. (B) Quantificação relativa das emissões de fluorescência por poço. A estatística foi realizada por ANOVA two-way seguida do teste de comparações múltiplas de Dunnett (n = 4-7); as barras de erro representam o SEM; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Quadro representativo da fagocitose da micróglia (IBA-1 + células em verde) de esferas de Cy3 (em vermelho) após 6 h de estimulação. As imagens são adquiridas usando uma objetiva de 40x do microscópio confocal. Barra de escala = 300 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação da pureza do isolamento magnético CD11b por citometria de fluxo antes e após a classificação celular. (A) Relata exemplos do contador de células antes e depois da classificação celular, destacando a concentração e a viabilidade celular. (B) O eixo x representa a concentração celular (célula/mL) e a viabilidade (%) após a classificação das células CD11b. Gráfico de barras de colunas; as barras de erro representam o MEV (n = 16). Análise fenotípica e de expressão gênica de marcadores populacionais de células antes e após a classificação celular CD11b+. Após a dissociação, as células CD11b+ dos cérebros de camundongos P8 foram classificadas magneticamente. A expressão de microglia (CX3CR1), oligodendrócitos (mRNA O4 ou Olig2), neurônios (NeuN ou Synaptophysin mRNA)) e astrócitos (ACSA-2 ou Gfap mRNA) foi analisada antes e após a classificação. (C) Análise FACS da expressão de CX3CR1, O4, NeuN e ACSA-2. O eixo x representa a porcentagem de células vivas e o número de células. (D) Quantificação relativa da expressão de células CD11b+ de Cx3cr1, Olig2, Sinaptofisina e Gfap mRNA (o eixo x representa a expressão relativa de mRNA-alvo para o mRNA de Itgam ). Gráfico de barras de colunas; as barras de erro representam o MEV (n = 7). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Para um tubo C (μL) | Para quatro tubos C (μL) |
| Buffer X | 2850 | 11400 |
| Enzima P (Papaína) | 75 | 300 |
| Enzima A (DNAse) | 15 | 60 |
| Buffer Y | 30 | 120 |
| Total | 2970 | 11880 |
Tabela 1: Preparação da mistura de dissociação.
| Solução | Para um tubo (μL) | Para quatro tubos (μL) |
| Microesferas CD11b | 20 | 80 |
| Buffer de classificação | 180 | 720 |
| Total | 200 | 800 |
Tabela 2: Preparação da solução de microesferas CD11b.
| Estimulação | Concentração (ng/mL) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
Tabela 3: Os reagentes de estimulação.
| Genes | Proteína | Encaminhar | Inverter |
| Arg1 | Arginase 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| Cd206 | | Cluster de diferenciação 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA NA | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| Cd32 | Cluster de diferenciação 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| Cd86 | | Cluster de diferenciação 86 | MORDAÇA CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Proteína glial fibrilar ácida | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | Fator de crescimento semelhante à insulina 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Antagonista do receptor de interleucina 1 | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Antagonista do receptor de interleucina 4 | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | ATO CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Integrina alfa M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lectina Glactosídeo-Ligação solúvel 3 | GAT CAC AAT GATO GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nos2 | Óxido nítrico sintase 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Fator de transcrição de oligodendrócitos 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Endoperóxido sintase de prostaglandinas 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | Proteína ribossomal L13a | ACA GCC ACT CTG MORDAÇA MORDAÇA AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Supressor de citocinas 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG NA |
| Sphk1 | Esfingosina quinase 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Sinaptofisina | ATCTCAGTGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Fator de necrose tumoral α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tabela 4: Sequências de primer RT-qPCR.
| Estimulação | Para 1 poço | Para n-poços |
| Contas Cy3 (1 célula: 50 contas) | 8, 100, 000 | X = (8, 100, 000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
Tabela 5: Preparação da mistura de contas para ensaio fagocítico.
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Discussion
O presente trabalho apresenta uma cultura primária de células microgliais usando células CD11b+ classificadas magneticamente. Além da avaliação funcional microglial (RT-qPCR e ensaios fagocíticos), a pureza da cultura microglial também foi determinada.
Culturas clássicas de células de micróglias são comumente geradas a partir do cérebro de recém-nascidos de roedores P1 ou P2 e co-cultura com astrócitos por pelo menos 10 dias. As micróglias são então separadas mecanicamente usando um agitador orbital. O método de isolamento e cultura de micróglia in vitro foi descrito pela primeira vez no final da década de 1990 a partir do cérebro de ratos recém-nascidos 40,41. Desde então, tem sido amplamente utilizado para analisar fenótipos microgliais, como micróglia ativada/em repouso ou micróglia pró-inflamatória/anti-inflamatória. Além disso, este experimento tem sido fundamental para definir a micróglia como células neurotóxicas co-cultivadas com neurônios. No entanto, em 2014, Biber e colaboradores descreveram três desvantagens significativas do estudo da micróglia in vitro usando métodos clássicos42. (1) O experimento utiliza cérebros de ratos/camundongos recém-nascidos (P1/P2), e essas células não passaram por todos os processos de maturação que podem ocorrer in vivo. (2) No meio de cocultura, utiliza-se 10% de FBS; no entanto, in vivo, a micróglia nunca encontra tais componentes em um ambiente "normal". (3) Estudos recentes demonstram que a micróglia in vivo é contida por diversos componentes inibitórios não presentes na cultura43,44. Além disso, muitos estudos (eletrofisiológico45 e transcriptômico46,47) descreveram a micróglia primária não estimulada como "ativada".
O presente método propõe uma técnica alternativa para gerar culturas de micróglias utilizando tecnologia magneticamente ordenada por células. Com este protocolo, a micróglia é colhida apenas algumas horas após a morte do animal, sem qualquer etapa de co-cultura. Além disso, as micróglias são cultivadas apenas 2 dias in vitro (DIV) antes da estimulação em comparação com 10-14 DIV, incluindo a co-cultura em outros protocolos. Isso permite se aproximar das condições fisiológicas da microglia. Este procedimento de cultivo de micróglias in vitro foi previamente publicado 25,26,27,28,29. O presente trabalho apresentou um protocolo otimizado para camundongos recém-nascidos, padronizado para redução do número de animais utilizados e sem etapa de remoção de mielina.
Para reduzir o número de camundongos usados para a cultura primária de micróglia, decidimos trabalhar em P8 na cepa OF1. Nesta fase do desenvolvimento cerebral na estirpe OF1, foram obtidas até 750.000 células microgliais por cérebro, em oposição a 500.000 células microgliais por cérebro de rato com estirpe C57BL6/J na mesma idade. A cepa C57BL6/J foi publicada em um estágio de desenvolvimento diferente para a cultura de micróglias27,28. O presente protocolo também tem sido utilizado com camundongos Fmr1KO para avaliar as propriedades fagocíticas da micróglia ligada a essa mutação e camundongos LysMCre: Dicerfl/+ para avaliar fenótipos de ativação microglial por RT-qPCR. Assim, trabalhar com a cepa de camundongo C57BL/6 J é um pouco mais desafiador do que trabalhar com a cepa OF1 devido a (1) menos células microgliais por cérebro no mesmo estágio de desenvolvimento e (2) fragilidade da micróglia que são mais propensas a morrer devido à ativação mecânica (consulte a seção de solução de problemas).
Dependendo do estágio de desenvolvimento escolhido para a cultura de micróglia primária, a mielinização deve ser considerada, uma vez que se inicia em torno de P5. Em uma cultura microglial clássica (em P0-2), a mielinização não é um problema; no entanto, em outros métodos publicados para isolar a micróglia, a mielina é removida usando gradiente de Percoll ou anticorpos anti-mielina25,26,28,29. No presente protocolo, os animais são eutanasiados no P8 quando a mielinização já começou; grandes volumes são usados para enxaguar pellets, e a mielina recém-formada pode ser removida sem qualquer procedimento adicional. Esse pode ser um método de solução de problemas (consulte a seção Detritos).
O fabricante e o isolamento magnético microglial previamente publicado utilizaram meios DMEM F-12 suplementados com 10% FBS - 1% P/S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 descreveram que a micróglia raramente entra em contato com o soro in vivo. De fato, o líquido extracelular do sistema nervoso central raramente contém proteínas e fatores bioativos29. É por isso que o meio de macrófagos livres de soro (SFM) + P/S a 1% é utilizado no presente protocolo.
O protocolo de classificação celular ativada por vírus (MACS) também pode isolar e cultivar micróglia pós-natal de ratos com algumas modificações25,29. As micróglias de ratos são de fato isoladas usando CD11b/c anti-rato revestido de microesferas (CD11b/c). No entanto, devido ao tamanho do cérebro ser maior do que os ratos P8, apenas um cérebro por tubo de dissociação por coluna deve ser usado. Microglias foram isoladas de cérebros de ratos P10-14 em protocolos previamente publicados, incluindo a etapa de remoção da mielinização29. Apesar dos comentários anteriores sobre o meio de cultura, para a cultura microglial de ratos, o meio F-12 + 10% FBS e 550.000-600.000 células por placa de 12 poços são recomendados para aplicações a jusante.
Solucionando problemas
Dissociação: A mistura de dissociação, conforme descrito na Tabela 1, é calculada para a quantidade máxima de cérebro que pode ser dissociada e prosseguir em P8 em camundongos OF1. Se mais cérebro for adicionado, a dissociação não poderá ser concluída no final da etapa 3.2 e o tecido cerebral não dissociado será encontrado. Neste caso, recomenda-se executar o programa NTDK no tubo com tecido não dissociado e manter os outros tubos a 4 °C.
Coador entupido e/ou coluna: Como descrito anteriormente, a mistura de dissociação é calculada para a quantidade máxima de tecido cerebral que pode passar pelo filtro durante a etapa 3.5. Se mais cérebro for adicionado, a filtração pode levar mais tempo, mas, eventualmente, passará. Recomenda-se ressuspender cuidadosamente a suspensão celular na parte superior do filtro até que toda a suspensão celular seja filtrada.
Durante a etapa 3.12, o experimentador deve passar a suspensão celular rotulada através de uma coluna dentro do campo magnético. A coluna pode ser entupida nesta fase do procedimento (1) se muito tecido cerebral for dissociado por tubo, (2) se o volume de ressuspensão não estiver correto ou (3) se houver alguma morte celular induzida mecanicamente (algum DNA pode estar presente); nesse caso, recomenda-se remover o DNA visível com uma ponta de 200 μL com cuidado.
Morte e/ou ativação celular induzida mecanicamente: O protocolo aqui descrito apresenta um desafio principal: evitar a ativação mecânica. Para fazer isso, é fundamental pipetar suavemente e manter a velocidade de centrifugação baixa. Caso contrário, a micróglia imatura pode morrer devido ao estresse mecânico ou ser ativada, levando a uma alta variabilidade nos resultados de RT-qPCR.
Detritos: Neste procedimento, os animais são sacrificados em P8 quando a mielinização está apenas começando e, portanto, não há procedimento para remover com precisão a mielina. Nesta fase de desenvolvimento, a mielina pode ser facilmente removida por centrifugação. Os volumes de ressuspensão descritos neste procedimento são calculados para remover a mielina máxima. Se não for respeitada, a mielina pode aparecer como detritos celulares em poços de cultura. O experimentador não pode removê-lo completamente quando observado em poços de cultura, alterando o meio no dia 2. As células microgliais tendem a fagocitar esses detritos, o que pode afetar o estado de ativação microglial antes da estimulação e, portanto, afetar a reprodutibilidade experimental.
Todas as soluções de problemas descritas anteriormente (Dissociação, filtro entupido e/ou coluna, Morte celular e/ou ativação induzida mecanicamente e detritos) podem levar à variabilidade no número de células CD11b+ obtidas na contagem celular (Figura 5B). Recomendamos prestar muita atenção a isso para otimizar o rendimento final de células.
Contaminação: Neste protocolo, as células microgliais são cultivadas em meio SFM + 1% P / S. O meio SFM pode ser facilmente contaminado. Portanto, recomenda-se alíquota do meio em tubos de 50 mL após a adição de P/S para evitar a contaminação do meio. Além disso, toda a experimentação precisa ser realizada o máximo possível em condições estéreis.
Quantidade/qualidade de mRNA: Nossa equipe trabalha em transfecções de miRNA ou siRNA. O presente protocolo é altamente compatível com tais aplicações que utilizam transfecção magnética com uma ligeira modificação do protocolo; o experimentador precisa colher 700.000 células por placa de 12 poços para obter mRNA de alta qualidade para RT-qPCR. Embora o RNAseq não tenha sido realizado no presente estudo, anteriormente, nossa equipe realizou a extração de mRNA para RNAseq usando 500.000 células por placa de 12 poços48.
Em conclusão, este protocolo pode ser reproduzido, e espera-se que seja um novo padrão para isolar a micróglia em um estágio de desenvolvimento juvenil.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
As figuras foram criadas usando BioRender. A investigação é financiada pela Inserm, Université de Paris, Horizonte 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, e uma subvenção adicional do Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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