Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من فأر حديث الولادة لمزارع الخلايا الأولية

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/62964
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university
* These authors contributed equally

Summary

تستخدم مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية بشكل شائع لتقييم الجزيئات الجديدة المضادة للالتهابات. يصف البروتوكول الحالي طريقة قابلة للتكرار وذات صلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مغناطيسيا عن صغار حديثي الولادة.

Abstract

تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة ، باعتبارها بلاعم مقيمة في الدماغ ، أساسية للعديد من الوظائف ، بما في ذلك الاستجابة للإجهاد البيئي وتوازن الدماغ. يمكن أن تتبنى الخلايا الدبقية الصغيرة مجموعة كبيرة من الأنماط الظاهرية للتنشيط. علاوة على ذلك ، ترتبط الخلايا الدبقية الصغيرة التي تؤيد النمط الظاهري المؤيد للالتهابات بكل من اضطرابات النمو العصبي والاضطرابات التنكسية العصبية. تستخدم الدراسات في المختبر على نطاق واسع في البحث لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة في أنواع معينة من الخلايا. في هذا السياق ، تعد دراسة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والالتهاب العصبي في المختبر باستخدام مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية أكثر أهمية من خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، قد يعاني استخدام بعض الثقافات الأولية من نقص التكاثر. يقترح هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار وذات صلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مغناطيسيا عن صغار حديثي الولادة. يتم هنا توضيح التنشيط الدبقي الصغير باستخدام العديد من المحفزات بعد 4 ساعات و 24 ساعة عن طريق القياس الكمي لتعبير mRNA ومقايسة البلعمة Cy3-bead. من المتوقع أن يوفر العمل الحالي تقنية قابلة للتكرار بسهولة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية عن مراحل نمو الأحداث.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا الشبيهة بالبلاعم المقيمة في الجهاز العصبي المركزي المشتقة من السلائف الكريات الحمر لكيس الصفار التي تهاجر إلى الظهارة العصبية أثناء التطور الجنيني المبكر1. بصرف النظر عن وظائف المناعة ، فإنها تلعب أيضا دورا مهما أثناء النمو العصبي ، خاصة في تكوين المشابك ، والتوازن العصبي ، والميالين2. في مرحلة البلوغ ، تطور الخلايا الدبقية الصغيرة عمليات خلوية طويلة لمسح البيئة بشكل مستمر. في حالة تمزق التوازن مثل إصابة الدماغ أو أمراض الدماغ ، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة تغيير مظهرها المورفولوجي لتبني شكل أميبي ، والهجرة إلى المنطقة المصابة ، وزيادة وإطلاق العديد من العوامل الواقية للخلايا أو السامة للخلايا. الخلايا الدبقية الصغيرة لها حالات تنشيط غير متجانسة اعتمادا على مرحلة نموها ونوع الإصابة التي لحقتبها 3،4،5. في هذه الدراسة ، يتم تصنيف حالات التنشيط هذه على نطاق واسع إلى ثلاثة أنماط ظاهرية مختلفة: مؤيدة للالتهابات / البلعمة ، ومضادة للالتهابات ، ومنظمة مناعية ، مع الأخذ في الاعتبار أنه في الواقع ، من المرجح أن يكون الوضع أكثر تعقيدا6.

يمكن أن تكون الدراسة في الجسم الحي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وفحص استراتيجيات الحماية العصبية في المراحل المبكرة من نمو الدماغ صعبة بسبب (1) هشاشة الحيوانات قبل الفطام و (2) انخفاض عدد الخلايا الدبقية الصغيرة. لذلك تستخدم الدراسات في المختبر على الخلايا الدبقية الصغيرة على نطاق واسع للسمية7،8،9 ، واستراتيجيات الحماية العصبية5،10،11،12،13،14 ، والثقافات المشتركة15،16،17،18،19،20،21 . يمكن أن تستخدم الدراسات في المختبر إما خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية أو ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية. كل هذه الأساليب لها مزايا وعيوب ، ويعتمد الاختيار على السؤال البيولوجي الأولي. فوائد استخدام مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية هي الخلفية الوراثية المتجانسة ، والتاريخ الخالي من مسببات الأمراض ، والتحكم في الوقت الذي يتم فيه تحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة بعد موت الحيوان22.

على مر السنين، تم تطوير طرق مختلفة (قياس التدفق الخلوي، أو الاهتزاز، أو وضع العلامات المغناطيسية) لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من القوارض، سواء حديثي الولادة أو البالغين 23،24،25،26،27،28،29. في العمل الحالي، يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من صغار الفئران حديثي الولادة باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا الموصوفة سابقا باستخدام CD11b25،27،29 المضاد للفأر المغلف بالميكروبيدات. CD11b هو مستقبل إنتغرين يتم التعبير عنه على سطح الخلايا النخاعية ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. عندما لا يكون هناك تحد التهابي داخل الدماغ ، فإن جميع خلايا CD11b + تقريبا هي الخلايا الدبقية الصغيرة30. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المنشورة سابقا 23،24،25،26،27،28،29 ، يوازن البروتوكول الحالي بين تحليلات التنشيط الفوري للخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم الحي وزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية الشائعة في المختبر. وبالتالي ، فإن الخلايا الدبقية الصغيرة (1) معزولة في يوم ما بعد الولادة (P) 8 دون إزالة المايلين ، (2) مستنبتة بدون مصل ، و (3) تتعرض إما ل siRNA و miRNA و / أو مركب دوائي و / أو محفزات التهابية بعد 48 ساعة فقط من عزل الدماغ. كل جانب من هذه الجوانب الثلاثة يجعل البروتوكول الحالي مناسبا وسريعا. بادئ ذي بدء ، يسمح استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة لدى الأطفال بالحصول على خلايا ديناميكية وتفاعلية قابلة للحياة في الثقافة دون الحاجة إلى خطوة إضافية لإزالة الميالين يمكن أن تعدل تفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر. يهدف البروتوكول الحالي إلى الاقتراب قدر الإمكان من البيئة الفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة. في الواقع ، لا تواجه الخلايا الدبقية الصغيرة مصلا أبدا ، ولا يتطلب هذا البروتوكول استخدام المصل أيضا. علاوة على ذلك ، فإن تعريض الخلايا الدبقية الصغيرة في وقت مبكر من 48 ساعة بعد الثقافة يمنعهم من فقدان كلياتهم الفسيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول ، وتم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للمعهد الوطني للصحة والبحوث العلمية (Inserm ، فرنسا). يتم تقديم العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة 24 من جراء الفئران OF1 (ذكورا وإناثا) في P8 ، مقسمة إلى 6 آبار أو 12 بئرا أو 96 بئرا. تم تنفيذ العمل التجريبي تحت غطاء محرك السيارة للحفاظ على ظروف معقمة.

1. إعداد حلول معقمة للعزل وزراعة الخلايا

  1. قم بإعداد 50 مل من محلول الملح المتوازن 1x Hanks (HBSS) بدون Ca 2+ و Mg2+ (HBSS-/-) من محلول 10x المتاح تجاريا (انظر جدول المواد).
  2. تحضير خليط التفكك وفقا للتركيب الوارد في الجدول 1 باستخدام مجموعة تفكك الأنسجة المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد 200 مل من 1x HBSS مع Ca 2+ و Mg2+ (HBSS +/+) من حل 10x المتاح تجاريا.
  4. قم بإعداد 200 مل من 1x PBS + 0.5٪ BSA (يشار إليه باسم المخزن المؤقت لفرز الخلايا).
  5. تحضير ميكروبيدات CD11b وفقا للجدول 2.
  6. تحضير 500 مل من وسط الاستزراع الخالي من البلاعم في المصل (SFM) + 1٪ من البنسلين الستربتومايسين (P / S). اصنع حصصا من أنابيب سعة 50 مل وقم بتخزينها في 4 درجات مئوية. يشار إلى هذا باسم وسط الخلايا الدبقية الصغيرة لاحقا في النص.
    ملاحظة: يجب تحضير جميع محاليل العزل طازجة في ظل ظروف معقمة في يوم التجربة وحفظها على الجليد. يمكن تحضير وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة ، واقتباسه في أنابيب سعة 50 مل ، والاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. ليست هناك حاجة للترشيح.

2. تشريح الدماغ

  1. قطع رأس الجرو باستخدام مقص كبير دون تخدير عام سابق.
  2. قطع الجلد من الرقبة إلى الأنف بعد الخيط السهمي (15-20 مم) بمقص صغير (الشكل 1A-C).
  3. أدخل أطراف مقص صغيرة داخل الثقبة العظمى الموازية للجمجمة. قطع من كل جانب بعناية إلى العينين (الشكل 1D ، E).
  4. قطع بين العينين بمقص صغير لفصل الجمجمة والدماغ عن الرأس (الشكل 1F).
  5. باستخدام ملقطين ، أمسك الجمجمة بالقرب من المصابيح الشمية وقم بتمزيق الجمجمة بعناية ، مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ الأساسي (الشكل 1G-I).
  6. قم بإزالة المخيخ والبصلة الشمية بشفرة حلاقة وقطع الدماغ إلى قطعتين (الشكل 1J).
  7. ضع قطع الدماغ في طبق بتري يحتوي على 30-40 مل من HBSS-/- (الشكل 1K).

3. تفكك الدماغ وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة المغناطيسية

ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات التلاعب بالخلايا وتعليقها باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر بحذر شديد. قد يؤدي تطبيق إجراء ميكانيكي عالي إلى تنشيط أو قتل الخلايا الدبقية الصغيرة.

  1. نقل 12 قطعة دماغية (~ 1.2 جم) لكل أنبوب تفكك يحتوي على خليط تفكك وفقا للجدول 1. بالنسبة ل 24 جروا ، كانت هناك حاجة إلى أربعة أنابيب C (الشكل 2 أ - ب).
  2. ضع C-Tubes على جهاز الانفصال (مع وضع التسخين). ابدأ برنامج NTDK المحسن في الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 2D).
  3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 20 ثانية (عند 4 درجات مئوية) لجمع كل الخلايا. أكمل التفكك الميكانيكي عن طريق السحب ثلاث مرات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (الشكل 2E).
  4. نقل الخلايا إلى أربعة أنابيب 15 مل + مصافي. اشطف المصافي ب 10 مل من HBSS +/+ (الشكل 2F).
  5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 10 مل من HBSS +/+ (الشكل 2G).
  6. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 6 مل من مخزن الفرز المؤقت (الخطوة 1.4) (الشكل 2H).
  7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من محلول ميكروبيدات CD11b (الخطوة 1.5) لكل أنبوب وأعد تعليقه بعناية (الشكل 2I).
  8. احتضان الأنابيب لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 6 مل من مخزن الفرز المؤقت (الشكل 2I-J).
  9. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 8 مل من مخزن الفرز المؤقت (الشكل 2K).
  10. اتبع برنامج POSSEL على الفاصل (انظر جدول المواد) لإعداد ثمانية أعمدة. نقل الخلايا 1 مل في 1 مل على العمود. انتظر حتى تمر جميع الخلايا قبل إضافة مل آخر. خلايا Elute CD11b + على لوحة شطف معقمة مع 1 مل من مخزن الفرز المؤقت (الشكل 2L).
  11. تجمع خلايا CD11b + في أنبوب جديد سعة 50 مل (الشكل 2M).
  12. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 10 مل من وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة (الخطوة 1.6) (الشكل 2N).
  13. عد خلايا CD11b +. في P8 ، يجب على المرء الحصول على ~ 650,000 خلية لكل دماغ.
    ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي (انظر جدول المواد).
  14. أعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة إلى التركيز النهائي من 650,000-700,000 خلية / مل واستغني عنها في ألواح زراعة الخلايا.
    ملاحظة: الألواح المكونة من 6 آبار مخصصة للبقع الغربية (2 مل لكل بئر) ؛ الألواح المكونة من 12 بئرا مخصصة لتحليل RT-qPCR (1 مل لكل بئر) ، والألواح المكونة من 96 بئرا مخصصة للمقايسة البلعمية (250 ميكرولتر لكل بئر) ؛ تم استخدام الثلاثة لهذا العمل. ومع ذلك ، في هذه المخطوطة ، لا يتم عرض نتائج تحليل Western Blot ، ولكن من الممكن تنفيذ هذا البروتوكول.
  15. ضع الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 طوال الليل. قم بتغيير الوسط بعناية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع وسط الخلايا الدبقية الصغيرة المسخن مسبقا.
  16. ضع الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 طوال الليل قبل التحفيز.
    ملاحظة: لا ينصح بعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من أكثر من 36 جروا وبعد P9. هذا سيزيد من خطر التلوث وتراكم حطام الخلايا لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة.

4. تحفيز الخلايا

  1. إعداد كواشف التحفيز وفقا للجدول 3 باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
  2. أضف الحجم المناسب في كل بئر محفز.
    ملاحظة: يعتمد الحجم المناسب على تركيز التحفيز وحجم البئر.
  3. ضع الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2حتى نهاية التحفيز عند 6 ساعات أو 24 ساعة أو 48 ساعة.
  4. لتحليل اللطخة الغربية ، استنشاق المادة الطافية وإضافة 50 ميكرولتر من محلول تحلل البروتين (انظر جدول المواد) باستخدام ماصة. باستخدام النصائح ، خدش الجزء السفلي من اللوحة لفصل الخلايا المحللة ونقلها إلى أنابيب سعة 1.5 مل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين ألواح الاستزراع لسنوات عند -80 درجة مئوية إذا تم استنشاق المادة الطافية بشكل صحيح.
  5. لتحليل RT-qPCR6،31 ، قم بشفط المادة الطافية وتخزين ألواح الاستزراع مباشرة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج mRNA (الخطوة 5).
  6. للاطلاع على فحص الخلايا البلعمية، يرجى الاطلاع على الخطوة 6.

5. استخراج mRNA وتحليل RT-qPCR

  1. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي و RT-PCR و RT-qPCR باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). راجع الجدول 4 للحصول على تسلسلات التمهيدي5،6،31.
  2. قم بإجراء تحليل RT-qPCR باتباع التقرير المنشور مسبقا5.

6. مقايسة البلعمة

  1. تحفيز الخلايا وإجراء فحص البلعمة خلال آخر 3 ساعات من التحفيز. على سبيل المثال ، لتحفيز 6 ساعات ، ابدأ الفحص البلعمي بعد 3 ساعات من التحفيز ؛ ولتحفيز 12 ساعة ، ابدأ الفحص البلعمي بعد 9 ساعات من بداية التحفيز.
  2. احسب عدد الخرز اللازم للتحضير مع مراعاة النسبة (1 خلية: 50 حبة). بالنسبة لبئر واحد من لوحة 96 بئرا ، يلزم وجود خرز 8.1 × 106 . تحضير خليط الخرز وفقا للجدول 5.
    ملاحظة: دوامة بعناية قارورة مخزون الخرز قبل إضافتها إلى خليط PBS / FBS.
  3. احتضان لمدة 1 ساعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. دوامة كل 10 دقائق.
  4. احسب حجم المحلول لإضافته إلى كل بئر. أضف المحلول واحتضانه لمدة 3 ساعات.
  5. شطف الآبار ثلاث مرات مع 1x PBS. اقرأ انبعاث التألق عند 550 نانومتر (الطول الموجي لانبعاث Cy3).

7. مراقبة جودة النقاء

  1. تقييم نقاء العزل المغناطيسي CD11b عن طريق قياس التدفق الخلوي (FACS) (قبل وبعد فرز الخلايا) ، ثم إجراء RT-qPCR.
    1. عد الخلايا وأعد تعليقها في المخزن المؤقت FACS (PBS + 2 mM من EDTA + 0.5٪ من ألبومين مصل البقري) من أجل الحصول على تخفيف 10 × 106 خلايا / مل بعد الخطوة 3.5 والخطوة 3.14.
    2. بعد 15 دقيقة من حجب Fc التقليدي 32,33 ، احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة باستخدام مسبار الصلاحية (FVS780) والأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور ضد الماوس CD45 و CD11b و CX3CR1 و ACSA-2 و O4 أو أنماط التحكم المقابلةلها 32,33 بالتركيز الموصى به من قبل الشركات المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. اغسل الخلايا باستخدام مخزن FACS المؤقت ، وقم بإصلاحها ، ونفاذها باستخدام مجموعة النفاذية المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    4. قم بإجراء حجب Fc مرة أخرى على الخلايا المخترقة ، ثم احتضان الجسم المضاد المترافق بالفلوروفور ضد NeuN (انظر جدول المواد) أو النمط المتماثل للتحكم لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بإجراء تحليل FACS بعد الغسيل باستخدام المخزن المؤقت لنظام FACS.
    6. بعد استبعاد الثنائيات والخلايا الميتة بناء على المعلمات المورفولوجية وتلطيخ FVS780 ، على التوالي ، حدد استراتيجية البوابة للتعبير السطحي ل CX3CR1 (الخلايا الدبقية الصغيرة) ، ACSA-2 (الخلايا النجمية) ، O4 (oligodendrocytes) ، والوجود داخل الخلايا من NeuN (الخلايا العصبية) لتحليل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية.
  2. باتباع الخطوة 5 ، قم باستخراج mRNA وإجراء RT-qPCR لتحديد Itgam (CD11b) و Cx3cr1 و Olig2 و Synaptophysin و Gfap mRNA. تطبيع Cq باستخدام Rpl13a mRNA كمراسل ، وإجراء تعبير نسبي ل Itgam mRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الخلايا الدبقية الصغيرة هي البلاعم المقيمة في الجهاز العصبي المركزي والتي يتم تنشيطها عند تعرضها لتحديات بيئية (صدمة ، جزيئات سامة ، التهاب) 4،5،6،34 (الشكل 3 أ). تستخدم الدراسات في المختبر حول الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل شائع لتقييم آليات الخلية المستقلة المتعلقة بتلك التحديات البيئية وتوصيف حالة التنشيط بعد التلاعب الدوائي أو الجيني. هنا ، يتم تقديم نهج لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في مرحلة الأحداث باستخدام الخرز المغناطيسي.

القراءة السهلة للتنشيط الدبقي الصغير في المختبر هي تحديد تعبير mRNA للعديد من علامات تفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالنمط الظاهري المؤيد للالتهابات (Cd86 ، Nos2 ، Ptgs2 ، Tnf) أو النمط الظاهري المضاد للالتهابات (Cd206 ، Igf1 ، Arg1 ، Lgasl3) 5،6،31. تم وصف هذه الأنماط الظاهرية اعتمادا على تعبير mRNA بعد التحفيز المؤيد للالتهابات (IL-1β ، LPS) أو المضاد للالتهابات (IL-4 أو IL-10). تصنف بعض العلامات على أنها علامات تنظيمية مناعية لأنها يتم تنظيمها من خلال التحفيز المؤيد والمضاد للالتهابات (الشكل 3 أ). تم وصف هذا التصنيف سابقا من قبل فريقنا5،6،31. بعد 48 ساعة ، تم تحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بمحفز مؤيد ومضاد للالتهابات لمدة 4 ساعات أو 24 ساعة. في 4 ساعات و 24 ساعة ، يتم تحفيز العلامات المؤيدة للالتهابات والتنظيمية المناعية بواسطة IL-1β و IL-1β + IFN-γ و LPS5،6،31. في 4 ساعات ، يحفز تحفيز IL-4 أيضا علامة التنظيم المناعي Il-1rn6. يتم تحريضها بقوة في 4 ساعات بعد تحفيز IL-4 فيما يتعلق بالعلامات المضادة للالتهابات. ومن المثير للاهتمام ، أن Cd206 يتم أيضا تنظيمه بشكل كبير بعد 24 ساعة من تحفيز IL-1β6 (الشكل 3B).

لتقييم النشاط البلعمي للخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر ، تم استخدام حبات Cy3 PVC الفلورية. تمت معالجتهم مسبقا بمصل الأبقار الجنينية (FBS) لتسهيل البلعمة عن طريق الخلايا الدبقية الصغيرة. تم استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة نحو النمط الظاهري المؤيد للالتهابات عن طريق التحفيز باستخدام IL-1β + IFN-γ أو LPS لمدة 3 ساعات أو 21 ساعة. قبل ثلاث ساعات من نهاية التحفيز ، تم تحضين حبات Cy3 بخلايا دبقية صغيرة. بعد الشطف باستخدام 1x PBS ، تم تحديد كثافة التألق في كل بئر. تم التعبير عن القياس الكمي بالنسبة للآبار التي لا تحتوي على خرز ، وتم التقاط صور تمثيلية (الشكل 4). بعد تحفيز 6 ساعات ، تبدأ الخلايا الدبقية الصغيرة في حبات Cy3 البلعمية فقط تحت IL-1β + IFN-γ. بعد تحفيز 24 ساعة ، هناك زيادة في مضان Cy3 لكلا النوعين من التحفيز. تسلط هذه الزيادة في مضان Cy3 الضوء على زيادة نشاط البلعمة (الشكل 4C).

تم إجراء قياس التدفق الخلوي (FACS) و RT-qPCR لتقييم نقاء ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة. يمكن تمييز مجموعات خلايا الدماغ المختلفة عن طريق قياس التدفق الخلوي: CX3CR1 35 للخلايا الدبقية الصغيرة ، O4 للخلايا قليلة التغصن 36 ، NeuN للخلايا العصبية37 ، و ACSA-2 للخلايا النجمية38. بعد التفكك ، جميع خلايا الدماغ موجودة. ومع ذلك ، بعد فرز الخلايا باستخدام الجسم المضاد CD11b ، لا توجد سوى الخلايا الدبقية الصغيرة وكميات صغيرة من خلايا O4 (الشكل 5 أ). بعد 48 ساعة من زراعة الخلايا الأولية ، تم العثور على علامات الخلايا الدبقية الصغيرة فقط كما تم تقييمها بواسطة RT-qPCR (الشكل 5B).

Figure 1
الشكل 1: تمثيل خطوة بخطوة يوضح إزالة الدماغ من الجمجمة. (أ-ج) تم استخدام مقص صغير لقطع الجلد من الرقبة إلى الأنف بعد الخياطة السهمية. (دال - ه) تم إدخال أطراف المقص الصغيرة داخل الثقبة العظمى الموازية للجمجمة ، ومن كل جانب إلى العينين تم قطعها بعناية. (و) انفصلت الجمجمة والدماغ عن الرأس عن طريق القطع بين العينين بمقص صغير. (G-I) تم الإمساك بالجمجمة بالقرب من المصابيح الشمية بملقطين وتمزيقها بعناية حتى لا تتلف الدماغ الأساسي. (ج) أزيل المخيخ والبصلة الشمية بشفرة حلاقة، وقطع الدماغ إلى قطعتين. (ك) وضعت قطع الدماغ في طبق بتري يحتوي على 30-40 مل من HBSS-/-. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لتفكك الدماغ وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة. (أ-ج) بعد تشريح دماغ الفأر P8 وإزالة المصابيح الشمية والمخيخ ، تم نقل الأدمغة أولا إلى طبق بتري مع HBSS +/+ ، ثم إلى أنابيب التفكك التي تحتوي على خليط التفكك. تم وضع الأنابيب C على جهاز الانفصال (مع وضع التسخين) ، وتم بدء تشغيل برنامج NTDK (D). (ه) في نهاية البرنامج ، تم طرد الأنابيب بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية ؛ ثم تم الانتهاء من التفكك عن طريق سحب ثلاث مرات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. (F) ثم تم نقل الخلايا إلى أنابيب سعة 15 مل + مصافي 70 ميكرومتر وشطفها ب 10 مل من HBSS +/+. (ز) ثم تم طرد العينات بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتمت إزالة المادة الطافية ، وأعيد تعليق الحبيبات ب 10 مل من HBSS +/+. (ح) تم طرد الأنابيب مرة أخرى عند 300 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية؛ تمت إزالة المادة الطافية ، ثم تم إعادة تعليق الحبيبات في 6 مل من المخزن المؤقت للفرز. (I) تم طرد الأنابيب بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتم إزالة المادة الطافية ، وأضيف محلول CD11b-microbead (200 μL). تم تحضين الأنابيب لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم أعيد تعليقها في 6 مل من محلول الفرز (J) وطردها بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. (K) تمت إزالة المادة الطافية ، وتم إعادة تعليق الحبيبات بعناية في 8 مل من مخزن الفرز المؤقت. (L) بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج POSSEL على الفاصل لإعداد الأعمدة. تم نقل الخلايا 1 مل في 1 مل على العمود ، وتم استخلاص خلايا CD11b على لوحة شطف معقمة مع 1 مل من المخزن المؤقت للفرز. (M) تم تجميع خلايا CD11b في أنبوب جديد سعة 50 مل وطرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتمت إزالة المادة الطافية. (N) أعيد تعليق الكريات بعناية في 10 مل من وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة في الخطوة الأخيرة. تم عد الخلايا وتخفيفها في وسط الخلايا الدبقية الصغيرة إلى تركيز نهائي من 650،000-700،000 خلية / مل تم توزيعها في لوحات زراعة الخلايا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بعد التعرض للتحديات البيئية. (أ) تمثيل تخطيطي مبسط لطيف التنشيط الدبقي الصغير. (ب) القياس الكمي النسبي لعلامات التنشيط الدبقية الصغيرة بعد تحفيز 4 ساعات أو 24 ساعة. تحليل التباين الأحادي ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنات المتعددة لدونيت39 (ن = 5-15) ؛ تمثل أشرطة الخطأ SEM ؛ * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تقييم النشاط البلعمي للخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر. (أ) صور تمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة Cy3-beads (باللون الأحمر) البلعمة بعد تحفيز 6 ساعات أو 24 ساعة. تم الحصول على الصور باستخدام هدف 20x من المجهر الفلوري. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي النسبي للانبعاث الفلوري لكل بئر. تم إجراء الإحصاء باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنات المتعددة لدونيت (n = 4-7) ؛ تمثل أشرطة الخطأ SEM ؛ * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001. (ج) صورة تمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة (IBA-1 + الخلايا باللون الأخضر) Cy3-حبات (باللون الأحمر) البلعمة بعد تحفيز 6 ساعات. يتم الحصول على الصور باستخدام هدف 40x من المجهر متحد البؤر. شريط المقياس = 300 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تقييم نقاء العزل المغناطيسي CD11b عن طريق قياس التدفق الخلوي قبل وبعد فرز الخلايا. (أ) ينقل أمثلة من عداد الخلايا قبل فرز الخلايا وبعده، مع إبراز تركيز الخلية وقابليتها للحياة. (ب) يمثل المحور السيني تركيز الخلية (خلية / مل) وصلاحيتها (٪) بعد فرز خلايا CD11b. الرسم البياني الشريطي العمودي ؛ تمثل أشرطة الخطأ SEM (n = 16). تحليل النمط الظاهري والتعبير الجيني لعلامات تعداد الخلايا قبل وبعد فرز خلايا CD11b +. بعد التفكك ، تم فرز خلايا CD11b + من أدمغة الفئران P8 مغناطيسيا. تم تحليل التعبير عن الخلايا الدبقية الصغيرة (CX3CR1) ، والخلايا قليلة التغصن (O4 أو Olig2 mRNA) ، والخلايا العصبية (NeuN أو Synaptophysin mRNA)) ، والخلايا النجمية (ACSA-2 أو Gfap mRNA) قبل وبعد الفرز. (ج) تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتعبير CX3CR1 وO4 وNeuN وACSA-2. يمثل المحور السيني النسبة المئوية للخلايا الحية وأرقام الخلايا. (د) القياس الكمي النسبي لتعبير خلايا CD11b + ل Cx3cr1 و Olig2 و Synaptophysin و Gfap mRNA (يمثل المحور x تعبير mRNA المستهدف النسبي إلى Itgam mRNA). الرسم البياني الشريطي العمودي ؛ تمثل أشرطة الخطأ SEM (n = 7). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حل لأنبوب C واحد (ميكرولتر) لأربعة أنابيب C (ميكرولتر)
العازلة X 2850 11400
إنزيم P (غراء) 75 300
الإنزيم أ (DNAse) 15 60
العازلة Y 30 120
مجموع 2970 11880

الجدول 1: تحضير خليط التفكك.

حل لأنبوب واحد (ميكرولتر) لأربعة أنابيب (ميكرولتر)
CD11b ميكروبيدات 20 80
العازلة الفرز 180 720
مجموع 200 800

الجدول 2: تحضير محلول الميكروبيدات CD11b.

التحفيز التركيز (نانوغرام / مل)
IL-1β 50
IFN-γ 20
لبس 10
ايل -4 30
ايل -10 20

الجدول 3: كواشف التحفيز.

جينات بروتين أمامي عكس
أرج 1 أرجيناز 1 جي تي جي ايه جي ايه ايه سي سي سي جي تي GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG
سي دي 206 مجموعة التمايز 206 CTT CGG دول مجلس التعاون الخليجي TTT GGA ATA في العلامة AAG AGC CCT TGG GTT GA
سي دي 32 مجموعة التمايز 32 سي تي جي جي ايه جا جي سي تي جي سي ايه CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA
سي دي 86 مجموعة التمايز 86 GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA جي جي سي تي سي كاك تي جي سي تي سي
جباب البروتين الحمضي الليفي الدبقي AAGCCAAGCACGAAGCTAAC CTCCTGGTAACTGGCCGACT
منتدى حوكمة الإنترنت-1 الأنسولين مثل عامل النمو 1 TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG GCA ACA CTC ATC كاك AAT GC
Il1-rn مضاد مستقبلات إنترلوكين 1 TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG TTC TCA هفوة CG ATG AAG GT
Il4-ra مضاد مستقبلات إنترلوكين 4 GGA TAA GCA GAC CCG AAG C قانون CTG هفوة أغا CTT GGT TGG
إيتغام إنتغرين ألفا م CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT GGCAGCTTCATTCATCATCATGT
لجالس3 ليكتين جلاكتوسيد ملزم قابل للذوبان 3 جات كاك آت كات جي كاك إيه جي ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT
رقم 2 سينسيز أكسيد النيتريك 2 CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC
أوليج 2 عامل نسخ الخلايا قليلة التغصن 2 CAGCGAGCACCTCAAATCTA GATGGGCGACTAGACACCAG
Ptgs2 البروستاجلاندين إندوبيروكسيد سينسيز 2 TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT
آر بي إل 13 بروتين الريبوسوم L13a ACA دول مجلس التعاون الخليجي قانون CTG هفوة GAG AA GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA
Socs3 مثبط السيتوكين 3 CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA TAT TCT GGG GGC GAG AAG AT
سفك1 سفينغوسين كيناز 1 TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC كاج كاج TGT GCA GTT GAT GA
ل.س المشبك ATCTCAGTGTCCCGATCCCA GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC
تي إن إف α عامل نخر الورم α GCC TCT TCT CAT TCCC TGC TT AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT

الجدول 4: تسلسل RT-qPCR التمهيدي.

التحفيز ل 1 بئر ل ن الآبار
Cy3 الخرز (1 خلية: 50 حبة) 8, 100, 000 س = (8 ، 100 ، 000) س ن
1x برنامج تلفزيوني Y = (100 + X) / n 50
FBS 50

الجدول 5: تحضير خليط الخرز لمقايسة البلعمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقدم العمل الحالي ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية باستخدام خلايا CD11b + المصنفة مغناطيسيا. بالإضافة إلى التقييم الوظيفي الدبقي الصغير (RT-qPCR والمقايسات البلعمية) ، تم أيضا تحديد نقاء ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة.

عادة ما يتم إنشاء مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الكلاسيكية من دماغ القوارض P1 أو P2 والاستزراع المشترك مع الخلايا النجمية لمدة 10 أيام على الأقل. ثم يتم فصل الخلايا الدبقية الصغيرة ميكانيكيا باستخدام شاكر مداري. تم وصف طريقة عزل وزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر لأول مرة في نهاية 1990s من أدمغة الفئران حديثي الولادة40,41. منذ ذلك الحين ، تم استخدامه على نطاق واسع لتحليل الأنماط الظاهرية للخلايا الدبقية الصغيرة مثل الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة / أثناء الراحة أو الخلايا الدبقية الصغيرة المؤيدة للالتهابات / المضادة للالتهابات. علاوة على ذلك ، كانت هذه التجربة أساسية لتعريف الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها خلايا سامة للأعصاب مستزرعة مع الخلايا العصبية. ومع ذلك ، في عام 2014 ، وصف بيبر والمتعاونون ثلاثة عيوب مهمة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر باستخدام الطرق الكلاسيكية42. (1) تستخدم التجربة أدمغة حديثي الولادة من الجرذان / الفئران (P1 / P2) ، ولم تمر هذه الخلايا بجميع عمليات النضج التي يمكن أن تحدث في الجسم الحي. (2) في وسط الاستزراع المشترك ، يتم استخدام 10٪ FBS ؛ ومع ذلك ، في الجسم الحي ، لا تواجه الخلايا الدبقية الصغيرة مثل هذه المكونات في بيئة "طبيعية". (3) تظهر الدراسات الحديثة أن الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي مقيدة بالعديد من المكونات المثبطة غير الموجودة في الثقافة43,44. علاوة على ذلك ، وصفت العديد من الدراسات (الفيزيولوجيا الكهربية45 والنسخ46,47) الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية غير المحفزة بأنها "نشطة".

تقترح الطريقة الحالية تقنية بديلة لتوليد مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تقنية فرز الخلايا المغناطيسية. مع هذا البروتوكول ، يتم حصاد الخلايا الدبقية الصغيرة بعد ساعات قليلة فقط من موت الحيوان دون أي خطوة استزراع مشترك. علاوة على ذلك ، يتم استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة يومين فقط في المختبر (DIV) قبل التحفيز مقارنة ب 10-14 DIV ، بما في ذلك الثقافة المشتركة في البروتوكولات الأخرى. هذا يسمح بالاقتراب من الظروف الفسيولوجية الصغيرة. تم نشر هذا الإجراء لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر سابقا25،26،27،28،29. قدم العمل الحالي بروتوكولا محسنا للفئران حديثي الولادة ، موحدا لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة وبدون خطوة إزالة الميالين.

لتقليل عدد الفئران المستخدمة في زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية ، قررنا العمل في P8 في سلالة OF1. في هذه المرحلة من تطور الدماغ في سلالة OF1 ، تم الحصول على ما يصل إلى 750000 خلية دبقية صغيرة لكل دماغ ، في مقابل 500000 خلية دبقية صغيرة لكل دماغ فأر C57BL6 / J في نفس العمر. تم نشر سلالة C57BL6 / J في مرحلة نمو مختلفة لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة27,28. تم استخدام البروتوكول الحالي أيضا مع فئران Fmr1KO لتقييم الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بهذه الطفرة و LysMCre: Dicerfl / + الفئران لتقييم الأنماط الظاهرية لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بواسطة RT-qPCR. وبالتالي ، فإن العمل مع سلالة الماوس C57BL / 6 J يعد أكثر صعوبة قليلا من العمل على سلالة OF1 بسبب (1) عدد أقل من الخلايا الدبقية الصغيرة لكل دماغ في نفس مرحلة النمو و (2) هشاشة الخلايا الدبقية الصغيرة التي تكون أكثر عرضة للموت بسبب التنشيط الميكانيكي (انظر قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها).

اعتمادا على المرحلة التنموية المختارة لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية ، يجب مراعاة الميالين لأنها تبدأ حول P5. في ثقافة الدبقية الصغيرة الكلاسيكية (في P0-2) ، لا يمثل الميالين مشكلة. ومع ذلك ، في الطرق المنشورة الأخرى لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، تتم إزالة المايلين باستخدام الأجسام المضادة Percoll gradient أو anti-myelin25،26،28،29. في البروتوكول الحالي ، يتم القتل الرحيم للحيوانات في P8 عندما يكون الميالين قد بدأ بالفعل. تستخدم كميات كبيرة لشطف الكريات ، ويمكن إزالة المايلين المشكل حديثا دون أي إجراء إضافي. يمكن أن تكون هذه إحدى طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها (راجع قسم الحطام).

استخدمت الشركة المصنعة والعزل المغناطيسي الدبقي الصغير المنشور سابقا وسائط DMEM F-12 المكملة بنسبة 10٪ FBS - 1٪ P / S25،26،27،28،29. وصف Biber et al.42 أن الخلايا الدبقية الصغيرة نادرا ما تلامس المصل في الجسم الحي. في الواقع ، نادرا ما يحتوي السائل خارج الخلية في الجهاز العصبي المركزي على البروتين والعوامل النشطة بيولوجيا29. هذا هو السبب في استخدام البلاعم الخالية من المصل (SFM) المتوسطة + 1٪ P / S في البروتوكول الحالي.

يمكن لبروتوكول فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) أيضا عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بعد الولادة واستزراعها مع بعض التعديلات25,29. يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران بالفعل باستخدام CD11b / c المغلفة بالميكروبيدات. ومع ذلك ، نظرا لأن حجم الدماغ أكبر من الفئران P8 ، يجب استخدام دماغ واحد فقط لكل أنبوب تفكك لكل عمود. تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة الفئران P10-14 في البروتوكولات المنشورة سابقا ، بما في ذلك خطوة إزالة الميالين29. على الرغم من التعليقات السابقة على وسط الاستزراع ، بالنسبة لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران ، يوصى باستخدام وسائط F-12 + 10٪ FBS و 550,000-600,000 خلية لكل لوحة ذات 12 بئرا للتطبيقات النهائية.

استكشاف الاخطاء
التفكك: يتم حساب خليط التفكك كما هو موضح في الجدول 1 لأقصى كمية من الدماغ التي يمكن فصلها والمضي قدما عند P8 في الفئران OF1. إذا تمت إضافة المزيد من الدماغ ، فلا يمكن إكمال الانفصال في نهاية الخطوة 3.2 ، وسيتم العثور على أنسجة المخ غير المنفصلة. في هذه الحالة ، يوصى بتشغيل برنامج NTDK على الأنبوب بأنسجة غير منفصلة والحفاظ على الأنابيب الأخرى عند 4 درجات مئوية.

مصفاة و / أو عمود مسدود: كما هو موضح من قبل ، يتم حساب خليط التفكك لأقصى كمية من أنسجة المخ التي يمكن أن تمر عبر المصفاة خلال الخطوة 3.5. إذا تمت إضافة المزيد من الدماغ ، فقد يستغرق الترشيح وقتا أطول ، ولكن في النهاية ، سوف يمر. يوصى بإعادة تعليق تعليق الخلية بعناية في الجزء العلوي من المصفاة حتى يتم تصفية كل تعليق الخلية.

أثناء الخطوة 3.12 ، يجب على المجرب تمرير معلق الخلية المسمى عبر عمود داخل المجال المغناطيسي. يمكن انسداد العمود في هذه المرحلة من الإجراء (1) إذا تم فصل الكثير من أنسجة المخ لكل أنبوب ، (2) إذا كان حجم إعادة التعليق غير صحيح ، أو (3) إذا كان هناك بعض موت الخلايا المستحث ميكانيكيا (يمكن أن يكون بعض الحمض النووي موجودا) ؛ في هذه الحالة ، يوصى بإزالة الحمض النووي المرئي بطرف 200 ميكرولتر بعناية.

موت الخلايا المستحث ميكانيكيا و / أو تنشيطها: يمثل البروتوكول الموصوف هنا تحديا رئيسيا واحدا: تجنب التنشيط الميكانيكي. للقيام بذلك ، من الأهمية بمكان ماصة بلطف والحفاظ على سرعة الطرد المركزي منخفضة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، يمكن أن تموت الخلايا الدبقية الصغيرة غير الناضجة بسبب الإجهاد الميكانيكي أو يتم تنشيطها ، مما يؤدي إلى تباين كبير في نتائج RT-qPCR.

الحطام: في هذا الإجراء ، يتم القتل الرحيم للحيوانات في P8 عندما يكون الميالين قد بدأ للتو ، وبالتالي لا يوجد إجراء لإزالة المايلين بدقة. في هذه المرحلة من التطور ، يمكن بسهولة إزالة المايلين عن طريق الطرد المركزي. يتم حساب أحجام إعادة التعليق الموضحة في هذا الإجراء لإزالة الحد الأقصى من الميالين. إذا لم يتم احترامه ، يمكن أن يظهر المايلين كحطام خلوي في آبار الزرع. لا يمكن للمجرب إزالته تماما عند ملاحظته في آبار الاستزراع عن طريق تغيير الوسيط في اليوم 2. تميل الخلايا الدبقية الصغيرة إلى البلعمة بهذا الحطام، وهو ما قد يؤثر على حالة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة قبل التحفيز، ومن ثم يؤثر على قابلية التكاثر التجريبي.

يمكن أن تؤدي جميع عمليات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الموصوفة سابقا (التفكك ، المصفاة المسدودة و / أو العمود ، موت الخلايا المستحث ميكانيكيا و / أو التنشيط ، والحطام) إلى تباين في عدد خلايا CD11b + التي تم الحصول عليها عند عد الخلايا (الشكل 5 ب). نوصي بإيلاء اهتمام كبير لهذا لتحسين العائد النهائي للخلية.

التلوث: في هذا البروتوكول ، يتم استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة في وسط SFM + 1٪ P / S. يمكن بسهولة تلوث وسط SFM. لذلك ، يوصى بتقسيم الوسط في أنابيب سعة 50 مل بعد إضافة P / S لتجنب التلوث المتوسط. علاوة على ذلك ، يجب إجراء جميع التجارب قدر الإمكان في ظل ظروف معقمة.

كمية / جودة mRNA: يعمل فريقنا على عمليات نقل miRNA أو siRNA. والبروتوكول الحالي متوافق إلى حد كبير مع هذه التطبيقات باستخدام النقل المغنطيسي مع تعديل طفيف للبروتوكول؛ يحتاج المجرب إلى حصاد 700000 خلية لكل لوحة ذات 12 بئرا للحصول على mRNA عالي الجودة ل RT-qPCR. على الرغم من عدم إجراء RNAseq في الدراسة الحالية ، فقد أجرى فريقنا سابقا استخراج mRNA ل RNAseq باستخدام 500000 خلية لكل لوحة12 بئر 48.

في الختام ، يمكن إعادة إنتاج هذا البروتوكول ، ومن المتوقع أن يكون معيارا جديدا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة في مرحلة نمو الأحداث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم إنشاء الأشكال باستخدام BioRender. يتم تمويل البحث من قبل Inserm ، جامعة باريس ، Horizon 2020 (PREMSTEM-874721) ، مؤسسة فرنسا ، مؤسسة ARSEP ، مؤسسة البحوث حول سيرفو ، مؤسسة نعمة موناكو ، ومنحة إضافية من Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 185 ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، زراعة الخلايا ، التهاب الأعصاب ، فحص البلعمة ، التعبير الجيني ، العزل المغناطيسي
العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من فأر حديث الولادة لمزارع الخلايا الأولية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni,… More

Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter