Summary
Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.
Abstract
Mikroglia, beyinde yerleşik makrofajlar olarak, çevresel strese ve beyin homeostazına yanıt da dahil olmak üzere çeşitli işlevlerin temelidir. Mikroglia, geniş bir aktivasyon fenotipi spektrumunu benimseyebilir. Ayrıca, pro-inflamatuar fenotipi destekleyen mikroglia hem nörogelişimsel hem de nörodejeneratif bozukluklarla ilişkilidir. İn vitro çalışmalar, spesifik hücre tiplerinde potansiyel terapötik stratejileri değerlendirmek için araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bağlamda, primer mikroglial kültürleri kullanarak in vitro mikroglial aktivasyon ve nöroinflamasyonu incelemek, mikroglial hücre hatlarından veya kök hücre kaynaklı mikroglialardan daha önemlidir. Bununla birlikte, bazı birincil kültürlerin kullanımı tekrarlanabilirlik eksikliğinden muzdarip olabilir. Bu protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntem önermektedir. Burada mRNA ekspresyon nicelemesi ve Cy3-boncuk fagositik testi ile 4 saat ve 24 saat sonra birkaç uyaran kullanılarak mikroglial aktivasyon gösterilmiştir. Mevcut çalışmanın, fizyolojik olarak ilgili mikroglia'yı juvenil gelişim aşamalarından izole etmek için kolayca tekrarlanabilir bir teknik sağlaması beklenmektedir.
Introduction
Mikroglia, erken embriyonik gelişim sırasında nöroepitelyuma göç eden yumurta sarısı kesesinin eritropoetik öncüllerinden türetilen merkezi sinir sistemi yerleşik makrofaj benzeri hücrelerdir1. Bağışıklık fonksiyonlarının yanı sıra, nörogelişim sırasında, özellikle sinaptogenez, nöronal homeostaz ve miyelinasyon2 için önemli bir rol oynarlar. Yetişkinlikte, mikroglia çevreyi sürekli taramak için uzun hücresel süreçler geliştirir. Beyin hasarı veya beyin hastalığı gibi homeostaz rüptürleri durumunda, mikroglia morfolojik görünümlerini amip şeklini benimsemek, yaralı bölgeye göç etmek, birçok sitoprotektif veya sitotoksik faktörü artırmak ve serbest bırakmak için değiştirebilir. Mikroglia, gelişim evrelerine ve devam eden yaralanma tipine bağlı olarak heterojen aktivasyon durumlarına sahiptir 3,4,5. Bu çalışmada, bu aktivasyon durumları genel olarak üç farklı fenotipte sınıflandırılmıştır: pro-enflamatuar / fagositik, anti-enflamatuar ve immüno-düzenleyici, gerçekte durumundaha karmaşık olması muhtemel olduğunu akılda tutarak6.
Beyin gelişiminin erken aşamalarında in vivo mikroglial aktivasyonu ve nöroprotektif stratejilerin taranmasını incelemek, (1) sütten kesilmeden önce hayvanların kırılganlığı ve (2) mikroglial hücrelerin sayısının az olması nedeniyle zor olabilir. Bu nedenle, mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar toksisite 7,8,9, nöroprotektif stratejiler5,10,11,12,13,14 ve ko-kültürler 15,16,17,18,19,20,21 için yaygın olarak kullanılmaktadır. . In vitro çalışmalar mikroglial hücre hatlarını, kök hücre kaynaklı mikrogliayı veya birincil mikroglia kültürünü kullanabilir. Tüm bu yaklaşımların avantajları ve dezavantajları vardır ve seçim ilk biyolojik soruya bağlıdır. Birincil mikroglia kültürlerini kullanmanın faydaları, homojen genetik arka plan, patojensiz öykü ve hayvan ölümünden sonra mikroglianın uyarıldığı zamanın kontrolüdür22.
Yıllar geçtikçe, hem yenidoğan hem de yetişkin 23,24,25,26,27,28,29 kemirgenlerinden birincil mikroglia kültürlenmesi için farklı yöntemler (akış sitometrisi, sallama veya manyetik etiketleme) geliştirilmiştir. Bu çalışmada, fare yenidoğan yavrularından mikroglia izolasyonu, mikroboncuk kaplı anti-fare CD11b25,27,29 kullanılarak daha önce tarif edilen manyetik aktive hücre sıralama teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. CD11b, mikroglia da dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen bir integrin-reseptörüdür. Beyinde enflamatuar bir zorluk olmadığında, neredeyse tüm CD11b + hücreleri mikroglia30'dur. Daha önce yayınlanmış diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 23,24,25,26,27,28,29, mevcut protokol acil ex vivo mikroglial aktivasyon analizlerini ve yaygın in vitro primer mikroglial kültürü dengelemektedir. Bu nedenle, mikroglia (1) doğum sonrası günde (P) 8'de miyelin çıkarılması olmadan izole edilir, (2) serum olmadan kültürlenir ve (3) beyin izolasyonundan sadece 48 saat sonra siRNA, miRNA, farmakolojik bileşik ve / veya enflamatuar uyaranlara maruz kalır. Bu üç yönün her biri, mevcut protokolü alakalı ve hızlı hale getirir. Her şeyden önce, pediatrik mikroglia kullanımı, in vitro mikroglial reaktiviteyi potansiyel olarak değiştirebilecek ek bir demiyelinizasyon adımı gerektirmeden kültürde dinamik ve reaktif canlı hücrelerin elde edilmesini sağlar. Mevcut protokol, mikroglia'nın fizyolojik ortamına mümkün olduğunca yaklaşmayı amaçlamaktadır. Gerçekten de, mikroglia asla serum ile karşılaşmaz ve bu protokol de serum kullanımını gerektirmez. Dahası, mikroglia'yı kültürden sonra 48 saat kadar erken bir sürede açığa çıkarmak, fizyolojik fakültelerini kaybetmelerini önler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol onaylandı ve tüm hayvanlar Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique'in (Inserm, Fransa) kurumsal yönergelerine göre ele alındı. P8'deki 24 OF1 fare yavrusunun (hem erkek hem de dişi) beyinlerinden mikroglia'nın manyetik izolasyonu, 6 kuyulu, 12 kuyulu veya 96 kuyucuklu plakalara bölünmüş olarak sunulmuştur. Deneysel çalışma, steril koşulları korumak için bir başlık altında gerçekleştirildi.
1. İzolasyon ve hücre kültürü için steril çözeltilerin hazırlanması
- Ticari olarak temin edilebilen 10x çözeltiden Ca 2+ve Mg 2+ (HBSS-/-) olmadan 50 mL 1x Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) hazırlayın (bkz.
- Ticari olarak temin edilebilen bir doku ayrışma kiti kullanarak Tablo 1'de verilen bileşime göre ayrışma karışımını hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Ticari olarak temin edilebilen 10x çözümünden Ca 2+ ve Mg2+ (HBSS+/+) ile200 mL 1x HBSS hazırlayın.
- 200 mL 1x PBS + %0,5 BSA (hücre sıralama arabelleği olarak adlandırılır) hazırlayın.
- CD11b-mikroboncukları Tablo 2'ye göre hazırlayın.
- 500 mL makrofaj serumsuz kültür ortamı (SFM) + %1 Penisilin-Streptomisin (P/S) hazırlayın. 50 mL tüplerden alikotlar yapın ve bunları 4 ° C'de saklayın. Bu, metnin ilerleyen kısımlarında mikroglia ortamı olarak adlandırılır.
NOT: Tüm izolasyon çözeltileri, deney gününde steril koşullar altında taze olarak hazırlanmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır. Mikroglia hücre kültürü ortamı hazırlanabilir, 50 mL tüplerde aliquoted edilebilir ve gelecekte kullanılmak üzere 4 ° C'de tutulabilir. Filtreleme gerekli değildir.
2. Beyin diseksiyonu
- Önceden genel anestezi olmadan büyük makas kullanarak yavrunun kafasını kesin.
- Sagital sütürü (15-20 mm) takiben deriyi boyundan buruna kadar küçük makasla kesin (Şekil 1A-C).
- Kafatasına paralel Foramen magnumunun içine küçük bir makas ucu yerleştirin. Her iki taraftan da gözlere dikkatlice kesin (Şekil 1D,E).
- Kafatasını ve beyni kafadan ayırmak için gözler arasında küçük makasla kesin (Şekil 1F).
- İki forseps ile, kafatasını koku alma ampullerine yakın tutun ve altta yatan beyne zarar vermemeye dikkat ederek kafatasını dikkatlice yırtın (Şekil 1G-I).
- Beyincik ve olfaktif ampulü jilet ile çıkarın ve beyni iki parçaya bölün (Şekil 1J).
- Beyin parçalarını 30-40 mL HBSS-/- içeren bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1K).
3. Beyin ayrışması ve manyetik mikroglial izolasyon
NOT: Tüm hücre manipülasyonları ve yeniden süspansiyonları 1.000 μL'lik bir pipetle büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yüksek mekanik bir etki uygulamak mikroglia hücrelerini aktive edebilir veya öldürebilir.
- Tablo 1'e göre ayrışma karışımı içeren ayrışma tüpü başına 12 beyin parçasını (~ 1.2 g) aktarın. 24 yavru için dört C-Tüpüne ihtiyaç vardı (Şekil 2A-B).
- C-Tüplerini ayrışıcıya yerleştirin (ısıtma modu ile). Üreticinin talimatına göre ekipmanda optimize edilmiş NTDK programını başlatın (Şekil 2D).
- Tüm hücreleri toplamak için 20 s (4 ° C'de) için 300 x g'de santrifüj. 1.000 μL pipetle üç kez yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek mekanik ayrışmayı tamamlayın (Şekil 2E).
- Hücreleri dört adet 15 mL tüp + süzgeçlere aktarın. Süzgeçleri 10 mL HBSS+/+ ile durulayın (Şekil 2F).
- 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 10 mL HBSS+/+ ile dikkatlice askıya alın (Şekil 2G).
- 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 6 mL ayıklama tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın (adım 1.4) (Şekil 2H).
- 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Tüp başına 200 μL CD11b-mikroboncuk çözeltisi (adım 1.5) ekleyin ve dikkatlice askıya alın (Şekil 2I).
- Tüpleri 4 ° C'de 15-20 dakika boyunca inkübe edin. Peleti 6 mL ayıklama tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın (Şekil 2I-J).
- 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 8 mL ayıklama tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın (Şekil 2K).
- Sekiz sütun hazırlamak için separatördeki POSSEL programını takip edin (bkz. Sütundaki hücreleri 1 mL'ye 1 mL'ye aktarın. Başka bir mL eklemeden önce tüm hücrelerin geçmesini bekleyin. CD11b+ hücrelerini steril elüsyon plakası üzerinde 1 mL ayıklama tamponu ile elute edin (Şekil 2L).
- CD11b+ hücrelerini yeni bir 50 mL tüpte havuzlayın (Şekil 2M).
- 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 10 mL soğuk mikroglia ortamı (adım 1.6) ile dikkatlice askıya alın (Şekil 2N).
- CD11b+ hücrelerini sayın. P8'de, beyin başına ~ 650.000 hücre elde edilmelidir.
NOT: Mevcut protokolde, hücreler otomatik bir hücre sayacı kullanılarak sayılmıştır (bkz. - Soğuk mikroglia ortamındaki hücreleri 650.000-700.000 hücre / mL'lik son konsantrasyona kadar askıya alın ve hücre kültürü plakalarına dağıtın.
NOT: 6 delikli plakalar Western Blot içindir (kuyu başına 2 mL); 12 delikli plakalar RT-qPCR analizi içindir (kuyu başına 1 mL) ve 96 delikli plakalar fagositik analiz içindir (kuyu başına 250 μL); üçü de bu iş için kullanıldı. Ancak bu yazıda Western Blot analizinden elde edilen sonuçlar gösterilmemiştir, ancak bu protokol ile gerçekleştirilmesi mümkündür. - Plakaları gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin. Önceden ısıtılmış mikroglia ortamına sahip 1.000 μL'lik bir pipetle ortamı dikkatlice değiştirin.
- Plakaları, stimülasyondan önce gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin.
NOT: Mikroglia'nın 36'dan fazla yavrudan ve P9'dan sonra izole edilmesi önerilmez. Bu, mikroglia'yı aktive etmek için kontaminasyon ve hücre kalıntılarının birikmesi riskini artıracaktır.
4. Hücre stimülasyonları
- Ticari olarak temin edilebilen reaktifleri kullanarak stimülasyon reaktiflerini Tablo 3'e göre hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Uyarılan her kuyuya uygun hacmi ekleyin.
NOT: Uygun hacim, uyaranın konsantrasyonuna ve kuyunun boyutuna bağlıdır. - Plakaları 37 ° C'de, 6 saatte,24saatte veya 48 saatte stimülasyonun sonuna kadar% 5 CO 2 ile yerleştirin.
- Western Blot analizi için, süpernatantı aspire edin ve bir pipetle 50 μL protein lizis tamponu ekleyin (bkz. Uçları kullanarak, lize hücreleri ayırmak ve bunları 1,5 mL tüplere aktarmak için plakanın altını çizin. -80 °C'de saklayın.
NOT: Kültür plakaları, süpernatant doğru şekilde aspire edilirse -80 ° C'de yıllarca saklanabilir. - RT-qPCR analizi 6,31 için, süpernatantı aspire edin ve mRNA ekstraksiyonuna kadar kültür plakalarını doğrudan -80 ° C'de saklayın (adım 5).
- Fagositik analiz için lütfen adım 6'ya bakın.
5. mRNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR analizi
- Üreticinin protokolünü izleyerek RNA ekstraksiyonu, RT-PCR ve RT-qPCR gerçekleştirin (bkz. 5,6,31 astar dizileri için Tablo 4'e bakınız.
- Daha önce yayımlanmış5 numaralı raporu takip ederek RT-qPCR analizi gerçekleştirin.
6. Fagositik tahlil
- Hücreleri uyarın ve stimülasyonun son 3 saati boyunca fagositik tahlil yapın. Örneğin, 6 saatlik stimülasyon için, 3 saatlik stimülasyondan sonra fagositik tahliline başlayın; ve 12 saatlik stimülasyon için, stimülasyonun başlamasından 9 saat sonra fagositik tahlili başlatın.
- Oranı göz önünde bulundurarak hazırlamak için gereken boncuk sayısını hesaplayın (1 hücre: 50 boncuk). 96 delikli plakanın bir kuyucuğu için 8,1 x 106 boncuk gereklidir. Boncuk karışımını Tablo 5'e göre hazırlayın.
NOT: PBS/FBS karışımına eklemeden önce boncuk stok şişesini dikkatlice vorteksine alın. - 37 °C'de bir su banyosunda 1 saat kuluçkaya yatırın. Her 10 dakikada bir vorteks.
- Her bir kuyucuğa eklenecek çözüm hacmini hesaplayın. Çözeltiyi ekleyin ve 3 saat boyunca inkübe edin.
- Kuyucukları 1x PBS ile üç kez durulayın. 550 nm (Cy3 emisyon dalga boyu) floresan emisyonunu okuyun.
7. Saflık kalite kontrolü
- CD11b manyetik izolasyonunun saflığını akış sitometrisi (FACS) ile değerlendirin (hücre sıralamadan önce ve sonra) ve ardından RT-qPCR'yi gerçekleştirin.
- Hücreleri sayın ve adım 3.5 ve adım 3.14'ten sonra 10 x 106 hücre / mL'lik bir seyreltme elde etmek için FACS tamponunda (PBS + 2 mM EDTA + Sığır Serum Albüminin% 0.5'i) yeniden askıya alın.
- Geleneksel Fc blokajı 32,33'ün 15 dakikasından sonra, hücreleri 15 dakika boyunca canlılık probu (FVS780) ve fare CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4'e veya bunlara karşılık gelen kontrol izotipleri 32,33'e karşı florofor konjuge antikorları ile üreticiler tarafından önerilen konsantrasyonda inkübe edin (bkz.
- Hücreleri FACS tamponu ile yıkayın, sabitleyin ve ticari olarak temin edilebilen bir geçirgenlik kiti ile geçirgenleştirin (bkz.
- Geçirgenleştirilmiş hücreler üzerinde tekrar Fc blokajı yapın ve daha sonra NeuN'ye karşı florofor konjuge antikoru ile inkübe edin (bakınız Malzeme Tablosu) veya kontrol izotipi 15 dakika boyunca.
- FACS tamponu ile yıkadıktan sonra FACS analizi yapın.
- Morfolojik parametrelere ve FVS780 boyamasına dayanan çiftleri ve ölü hücreleri sırasıyla dışladıktan sonra, pozitif hücrelerin yüzdesinin analizi için CX3CR1 (mikroglia), ACSA-2 (astrositler), O4 (oligodendrositler) ve NeuN'un (nöronlar) hücre içi varlığının yüzey ekspresyonu için geçit stratejisini seçin.
- 5. adımı takiben, mRNA'yı ayıklayın ve Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Sinaptophysin ve Gfap mRNA'yı ölçmek için RT-qPCR gerçekleştirin. Rpl13a mRNA'yı muhabir olarak kullanarak Cq'yu normalleştirin ve Itgam mRNA'ya göreceli bir ekspresyon gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia, çevresel zorluklara (travma, toksik moleküller, inflamasyon) maruz kaldığında aktive olan CNS yerleşik makrofajıdır (Şekil 3A). Mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar, bu çevresel zorluklarla ilgili hücre otonom mekanizmalarını değerlendirmek ve farmakolojik veya genetik manipülasyon sonrası aktivasyon durumunu karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, manyetik kuplajlı boncuklar kullanarak gençlik aşamasında primer mikrogliayı izole etmek için bir yaklaşım sunulmaktadır.
İn vitro mikroglial aktivasyon için kolay bir okuma, pro-inflamatuar bir fenotiple (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) veya bir anti-enflamatuar fenotiple (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3) ilişkili birkaç mikroglial reaktivite belirtecinin mRNA ekspresyonunu ölçmektir 5,6,31. Bu fenotipler pro-inflamatuar (IL-1β, LPS) veya anti-inflamatuar (IL-4 veya IL-10) uyarandan sonra mRNA ekspresyonuna bağlı olarak tanımlandı. Bazı belirteçler immüno-düzenleyici belirteçler olarak sınıflandırılır, çünkü pro- ve anti-inflamatuar stimülasyon yoluyla yukarı regüle edilirler (Şekil 3A). Bu sınıflandırma daha önce ekibimiz tarafından 5,6,31 olarak tanımlanmıştı. 48 saat sonra, izole mikroglial, 4 saat veya 24 saat boyunca pro- ve anti-enflamatuar uyaranla uyarıldı. mRNA ekstrakte edildi ve RT-qPCR gen ekspresyonunu ölçtü. 4 saat ve 24 saatte, pro-inflamatuar ve immüno-düzenleyici belirteçler IL-1β, IL-1β + IFN-γ ve LPS 5,6,31 tarafından indüklenir. 4 saatte, IL-4 stimülasyonu ayrıca immüno-düzenleyici belirteç Il-1rn6'yı da indükler. Anti-inflamatuar belirteçlerle ilgili IL-4 stimülasyonundan sonra 4 saatte güçlü bir şekilde indüklenirler. İlginç bir şekilde, Cd206 ayrıca IL-1β stimülasyonu6'dan 24 saat sonra önemli ölçüde yukarı regüle edilmiştir (Şekil 3B).
Mikroglia'nın in vitro fagositik aktivitesini değerlendirmek için floresan Cy3 PVC boncuklar kullanıldı. Mikroglia tarafından fagositozlarını kolaylaştırmak için fetal sığır serumu (FBS) ile ön tedavi edildiler. Mikroglia, IL-1β + IFN-γ veya LPS ile 3 saat veya 21 saat boyunca stimülasyon yoluyla pro-inflamatuar fenotipe doğru polarize edildi. Stimülasyonun bitiminden üç saat önce, Cy3-boncukları mikroglial hücrelerle inkübe edildi. 1x PBS ile duruladıktan sonra, her bir kuyucuktaki floresan yoğunluğu ölçüldü. Boncuksuz kuyucuklara göre nicelleştirme ifade edilmiş ve temsili görüntüler alınmıştır (Şekil 4). 6 saatlik stimülasyondan sonra, mikroglia sadece IL-1β + IFN-γ altında Cy3-boncuklarını fagosit etmeye başlar. 24 saatlik bir stimülasyondan sonra, her iki stimülasyon türü için de Cy3 floresan artışı vardır. Cy3 floresansının bu artışı, fagositik aktivitenin arttığını vurgulamaktadır (Şekil 4C).
Mikroglial kültürün saflığını değerlendirmek için akım sitometrisi (FACS) ve RT-qPCR yapıldı. Farklı beyin hücresel popülasyonları akış sitometrisi ile ayırt edilebilir: mikroglia içinCX3CR1 35, oligodendrositler 36 için O4, nöronlar için NeuN 37 ve astrositler için ACSA-2 38. Ayrışmadan sonra, tüm beyin hücreleri mevcuttur; Bununla birlikte, CD11b antikoru kullanılarak hücre sıralamasından sonra, sadece mikroglia ve az miktarda O4 hücresi bulunur (Şekil 5A). Primer hücre kültüründen 48 saat sonra, RT-qPCR ile değerlendirilen sadece mikroglia belirteçleri bulunur (Şekil 5B).
Şekil 1: Beynin kafatasından çıkarılmasını gösteren adım adım gösterim. (A-C) Sagital sütür takiben deriyi boyundan buruna kadar kesmek için küçük makaslar kullanıldı. (D-E) Küçük makasın uçları, kafatasına paralel olarak Foramen magnumunun içine yerleştirildi ve her iki taraftan gözlere dikkatlice kesildi. (F) Kafatası ve beyin, gözler arasında küçük makasla kesilerek kafadan ayrıldı. (G-I) Kafatası, iki forseps ile olfaktif ampullere yakın tutuldu ve altta yatan beyne zarar vermemek için dikkatlice yırtıldı. (J) Beyincik ve olfaktif ampul jilet ile çıkarıldı ve beyin iki parçaya bölündü. (K) Beyin parçaları 30-40 mL HBSS-/- içeren bir Petri kabına yerleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Beyin ayrışmalarının ve mikroglial hücre izolasyonunun şematik gösterimi. (A-C) P8 fare beyni diseksiyonundan ve olfaktif ampullerin ve beyinciğin çıkarılmasından sonra, beyinler önce HBSS ++ ile bir Petri kabına ve daha sonra ayrışma karışımını içeren ayrışma tüplerine aktarıldı. C-tüpleri ayrışıcıya (ısıtma modu ile) yerleştirildi ve NTDK programı başlatıldı (D). (E) Programın sonunda, tüpler 4 °C'de 20 s için 300 x g'de santrifüj edildi; ayrışma daha sonra 1.000 μL'lik bir pipetle üç kez yukarı ve aşağı pipetle pipetlenerek tamamlandı. (F) Hücreler daha sonra 15 mL tüplere + 70 μm'lik süzgeçlere aktarıldı ve 10 mL HBSS+/+ ile durulandı. (G) Numuneler daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edildi, süpernatant çıkarıldı ve pelet 10 mL HBSS + / + ile yeniden askıya alındı. (H) Tüpler tekrar 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edildi; süpernatant çıkarıldı ve daha sonra pelet 6 mL sıralama tamponunda yeniden askıya alındı. (I) Tüpler 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edildi, süpernatant çıkarıldı ve CD11b-mikroboncuk (200 μL) çözeltisi eklendi. Tüpler 4 ° C'de 15-20 dakika boyunca inkübe edildi ve daha sonra 6 mL sıralama tamponunda (J) yeniden askıya alındı ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edildi. (K) Süpernatant çıkarıldı ve pelet 8 mL ayırma tamponunda dikkatlice yeniden askıya alındı. (L) Ardından, sütunları hazırlamak için ayırıcıda POSSEL programını başlatın. Hücreler kolon üzerinde 1 mL x 1 mL transfer edildi ve CD11b hücreleri 1 mL sıralama tamponu ile steril bir elüsyon plakası üzerinde salındı. (M) CD11b hücreleri yeni bir 50 mL tüp içinde toplandı ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edildi ve süpernatant çıkarıldı. (N) Pelet, son adımda 10 mL soğuk mikroglia ortamında dikkatlice yeniden askıya alındı. Hücreler mikroglial ortamda sayıldı ve hücre kültürü plakalarında dağıtılan 650.000-700.000 hücre / mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çevresel zorluklara maruz kaldıktan sonra mikroglial aktivasyon. (A) Mikroglial aktivasyon spektrumunun basitleştirilmiş şematik gösterimi. (B) 4 saat veya 24 saat stimülasyondan sonra mikroglial aktivasyon belirteçlerinin nispi miktarı. İki yönlü ANOVA'yı Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi39 (n = 5-15); hata çubukları SEM'i temsil eder; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroglianın in vitro fagositik aktivitesinin değerlendirilmesi. (A) 6 saat veya 24 saat uyarıldıktan sonra mikroglia Cy3-boncuklarının (kırmızı renkte) fagositozun temsili görüntüleri. Görüntüler floresan mikroskobun 20x objektifi kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Floresanın nispi miktarının kuyu başına yayılması. İstatistikler iki yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi (n = 4-7) kullanılarak gerçekleştirildi; hata çubukları SEM'i temsil eder; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) 6 saatlik stimülasyondan sonra mikroglia (yeşil renkte IBA-1 + hücreleri) Cy3-boncukları (kırmızı renkte) fagositozun temsili resmi. Görüntüler, konfokal mikroskobun 40x hedefi kullanılarak elde edilir. Ölçek çubuğu = 300 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: CD11b manyetik izolasyon saflığının hücre sıralamadan önce ve sonra akış sitometrisi ile değerlendirilmesi. (A) Hücre sıralamasından önce ve sonra hücre sayacından örnekler sunar, hücre konsantrasyonunu ve canlılığını vurgular. (B) X ekseni, CD11b hücre sıralamasından sonra hücre konsantrasyonunu (hücre/mL) ve canlılığı (%) temsil eder. Sütun çubuğu grafiği; hata çubukları SEM'i temsil eder (n = 16). CD11b+ hücre sıralama öncesi ve sonrası hücre popülasyon belirteçlerinin fenotipik ve gen ekspresyon analizi. Ayrışmadan sonra, P8 farelerin beyinlerinden CD11b + hücreleri manyetik olarak sıralandı. Mikroglia (CX3CR1), oligodendrositler (O4 veya Olig2 mRNA), nöronlar (NeuN veya Synaptophysin mRNA)) ve astrositlerin (ACSA-2 veya Gfap mRNA) belirteçlerinin ekspresyonu, sıralamadan önce ve sonra analiz edildi. (C) CX3CR1, O4, NeuN ve ACSA-2 ifadesinin FACS analizi. X ekseni, canlı hücrelerin ve hücre sayılarının yüzdesini temsil eder. (D) Cx3cr1, Olig2, Sinaptophysin ve Gfap mRNA'nın CD11b + hücre ekspresyonunun göreceli nicelleştirilmesi (x ekseni, Itgam mRNA'ya göreceli hedef mRNA ekspresyonunu temsil eder). Sütun çubuğu grafiği; hata çubukları SEM'i temsil eder (n = 7). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | Bir C-Tüpü için (μL) | Dört C-tüpü (μL) için |
| Arabellek X | 2850 | 11400 |
| Enzim P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzim A (DNAse) | 15 | 60 |
| Arabellek Y | 30 | 120 |
| Toplam | 2970 | 11880 |
Tablo 1: Ayrışma karışımının hazırlanması.
| Çözüm | Bir tüp için (μL) | Dört tüp için (μL) |
| CD11b Mikroboncuklar | 20 | 80 |
| Sıralama Arabelleği | 180 | 720 |
| Toplam | 200 | 800 |
Tablo 2: CD11b mikroboncuk çözeltisinin hazırlanması.
| Uyarım | Konsantrasyon (ng/mL) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
Tablo 3: Stimülasyon reaktifleri.
| Gen | Protein | İletmek | Ters |
| Arg1 | Arjinaz 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| Cd206 | Farklılaşma kümesi 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA - | ETIKET AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| Cd32 Serisi | Farklılaşma kümesi 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| Cd86 Serisi | Farklılaşma kümesi 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Glial fibriler asidik protein | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| İl1-rn | İnterlökin 1 reseptör antagonisti | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| İl4-ra | İnterlökin 4 reseptör antagonisti | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | ACT CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Arjantin | Integrin alfa M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lektin Glaktosit-Bağlayıcı çözünür 3 | GAT CAC AAT CAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| No2 | Nitrik oksit sentaz 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Oligodendrosit transkripsiyon faktörü 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandin endoperoksit sentaz 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | Ribozomal protein L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Sitokin baskılayıcı 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG - |
| Sphk1 | Sfengozin kinaz 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Sinaptofizin | ATCTCAGTGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Tümör nekroz faktör α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tablo 4: RT-qPCR primer dizileri.
| Uyarım | 1 kuyu için | N-kuyuları için |
| Cy3 Boncuklar (1 hücreli : 50 boncuk) | 8, 100, 000 | X = (8, 100.000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS (Serbest Dolaşım | 50 |
Tablo 5: Fagositik tahlil için boncuk karışımının hazırlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut çalışma, manyetik olarak sıralanmış CD11b + hücrelerini kullanarak birincil bir mikroglial hücre kültürü sunmaktadır. Mikroglial fonksiyonel değerlendirmeye (RT-qPCR ve fagositik tahliller) ek olarak, mikroglial kültür saflığı da belirlendi.
Klasik mikroglia hücre kültürleri genellikle P1 veya P2 kemirgen yenidoğan beyninden ve astrositlerle en az 10 gün boyunca ortak kültürden üretilir. Mikroglia daha sonra yörüngesel bir çalkalayıcı kullanılarak mekanik olarak ayrılır. Mikroglia'yı in vitro olarak izole etme ve kültürleme yöntemi ilk kez 1990'ların sonunda yenidoğan sıçanların beyinlerinden40,41 olarak tanımlanmıştır. O zamandan beri, aktive edilmiş / dinlendirici mikroglia veya pro-enflamatuar / anti-enflamatuar mikroglia gibi mikroglial fenotipleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Dahası, bu deney mikroglia'yı nöronlarla birlikte kültürlenmiş nörotoksik hücreler olarak tanımlamak için temel olmuştur. Bununla birlikte, 2014 yılında Biber ve işbirlikçileri, klasik yöntemleri kullanarak in vitro mikroglia çalışmanın üç önemli dezavantajını tanımladılar42. (1) Deney, sıçan / fare yenidoğan beyinlerini (P1 / P2) kullanır ve bu hücreler in vivo olarak meydana gelebilecek tüm olgunlaşma süreçlerinden geçmemiştir. (2) Ortak kültür ortamında,% 10 FBS kullanılır; Bununla birlikte, in vivo, mikroglia "normal" bir ortamda bu tür bileşenlerle asla karşılaşmaz. (3) Son çalışmalar, in vivo mikroglia'nın kültürde bulunmayan birkaç inhibitör bileşen tarafından kısıtlandığını göstermektedir43,44. Ayrıca, birçok çalışma (elektrofizyolojik45 ve transkriptomik46,47), uyarılmamış primer mikrogliayı "aktive edilmiş" olarak tanımlamıştır.
Mevcut yöntem, manyetik olarak hücre sıralama teknolojisini kullanarak mikroglia kültürleri oluşturmak için alternatif bir teknik önermektedir. Bu protokolle, mikroglia, hayvan öldükten sadece birkaç saat sonra herhangi bir ortak kültür adımı olmadan hasat edilir. Dahası, mikroglia, diğer protokollerde ko-kültür de dahil olmak üzere, 10-14 DIV'ye kıyasla, stimülasyondan sadece 2 gün önce in vitro (DIV) kültürlenir. Bu, mikroglial fizyolojik koşullara yaklaşmayı sağlar. Mikroglia'nın in vitro kültürlenmesi prosedürü daha önce 25,26,27,28,29 yayınlanmıştır. Mevcut çalışma, yenidoğan fareler için, kullanılan ve miyelin giderme adımı olmayan hayvan sayısını azaltmak için standartlaştırılmış optimize edilmiş bir protokol sundu.
Birincil mikroglia kültürü için kullanılan farelerin sayısını azaltmak için, OF1 suşunda P8'de çalışmaya karar verdik. OF1 suşunda beyin gelişiminin bu aşamasında, aynı yaşta C57BL6 / J suşu fare beyni başına 500.000 mikroglial hücreye karşı, beyin başına 750.000 mikroglial hücre elde edildi. C57BL6/J suşu mikroglia kültürü için farklı bir gelişim aşamasında yayınlanmıştır27,28. Mevcut protokol ayrıca bu mutasyona bağlı mikroglia'nın fagositik özelliklerini değerlendirmek için Fmr1KO fareleri ve RT-qPCR ile mikroglial aktivasyon fenotiplerini değerlendirmek için LysMCre: Dicerfl / + fareleri ile birlikte kullanılmıştır. Bu nedenle, C57BL / 6 J fare suşu ile çalışmak, (1) aynı gelişim aşamasında beyin başına daha az mikroglial hücre ve (2) mekanik aktivasyon nedeniyle ölmeye daha yatkın olan mikroglia'nın kırılganlığı nedeniyle OF1 suşu üzerinde çalışmaktan biraz daha zordur (sorun giderme bölümüne bakın).
Birincil mikroglia kültürü için seçilen gelişim aşamasına bağlı olarak, P5 civarında başladığı için miyelinasyon düşünülmelidir. Klasik bir mikroglial kültürde (P0-2'de), miyelinasyon bir sorun değildir; Bununla birlikte, mikrogliayı izole etmek için yayınlanmış diğer yöntemlerde, miyelin, Percoll gradyanı veya anti-miyelin antikorları25,26,28,29 kullanılarak çıkarılır. Mevcut protokolde, miyelinasyon başladığında hayvanlar P8'de ötenazi yapılır; Peletleri durulamak için büyük hacimler kullanılır ve yeni oluşan miyelin herhangi bir ek prosedür olmadan çıkarılabilir. Bu bir sorun giderme yöntemi olabilir (Enkaz bölümüne bakın).
Üretici ve daha önce yayınlanan mikroglial manyetik izolasyon, %10 FBS -% 1 P / S 25,26,27,28,29 ile desteklenmiş DMEM F-12 ortamını kullandı. Biber ve ark.42, mikroglia'nın serum ile nadiren in vivo temas ettiğini tanımlamıştır. Gerçekten de, merkezi sinir sisteminin hücre dışı sıvısı nadiren protein ve biyoaktif faktörler içerir29. Bu nedenle serumsuz makrofaj (SFM) ortamı +% 1 P / S mevcut protokolde kullanılmaktadır.
Manyetik-aktive hücre sıralama (MACS) protokolü ayrıca bazı modifikasyonlarla doğum sonrası sıçan mikrogliasını izole edebilir ve kültürleyebilir25,29. Sıçan mikrogliası gerçekten de Mikroboncuk kaplı anti-sıçan CD11b / c kullanılarak izole edilir. Bununla birlikte, beyin boyutunun P8 farelerden daha büyük olması nedeniyle, sütun başına ayrışma tüpü başına yalnızca bir beyin kullanılmalıdır. Mikroglia, miyelinasyon giderme adımı29 da dahil olmak üzere daha önce yayınlanmış protokollerde P10-14 sıçan beyinlerinden izole edildi. Kültür ortamı hakkındaki önceki yorumlara rağmen, sıçan mikroglial kültürü için, aşağı akış uygulamaları için F-12 medya +% 10 FBS ve 12 kuyucuklu plaka başına 550.000-600.000 hücre önerilir.
Sorun giderme
Dissosiyasyon: Tablo 1'de tarif edildiği gibi ayrışma karışımı, OF1 farelerde ayrışabilen ve P8'de ilerleyebilen maksimum beyin miktarı için hesaplanır. Daha fazla beyin eklenirse, adım 3.2'nin sonunda ayrışma tamamlanamaz ve ayrışmamış beyin dokusu bulunur. Bu durumda NTDK programının ayrışmamış doku ile tüp üzerinde çalıştırılması ve diğer tüplerin 4 °C'de tutulması önerilir.
Tıkanmış süzgeç ve / veya sütun: Daha önce açıklandığı gibi, ayrışma karışımı, adım 3.5 sırasında süzgeçten geçebilecek maksimum miktarda beyin dokusu için hesaplanır. Daha fazla beyin eklenirse, filtrasyon daha uzun sürebilir, ancak sonunda geçecektir. Tüm hücre süspansiyonu filtrelenene kadar süzgecin üstündeki hücre süspansiyonunun dikkatlice askıya alınması önerilir.
Adım 3.12 sırasında, deneyci etiketli hücre süspansiyonunu manyetik alanın içindeki bir sütundan geçirmelidir. Kolon, prosedürün bu aşamasında tıkanabilir (1) tüp başına çok fazla beyin dokusu ayrışırsa, (2) yeniden süspansiyon hacmi doğru değilse veya (3) mekanik olarak indüklenen bir hücre ölümü varsa (bazı DNA'lar mevcut olabilir); Bu durumda, görünür DNA'nın 200 μL'lik bir uçla dikkatlice çıkarılması önerilir.
Mekanik olarak indüklenen hücre ölümü ve / veya aktivasyonu: Burada açıklanan protokol bir ana zorluk sunar: mekanik aktivasyondan kaçınmak. Bunu yapmak için nazikçe pipet uygulamak ve santrifüj hızını düşük tutmak çok önemlidir. Aksi takdirde, olgunlaşmamış mikroglia mekanik stres nedeniyle ölebilir veya aktive olabilir, bu da RT-qPCR sonuçlarında yüksek değişkenliğe yol açabilir.
Enkaz: Bu prosedürde, miyelinasyon yeni başladığında P8'de hayvanlar ötenazi yapılır ve bu nedenle miyelini kesin olarak çıkarmak için bir prosedür yoktur. Gelişimin bu aşamasında, miyelin santrifüjleme ile kolayca çıkarılabilir. Bu prosedürde açıklanan resüsitasyon hacimleri, maksimum miyelini çıkarmak için hesaplanır. Saygı duyulmazsa, miyelin kültür kuyularında hücre kalıntıları olarak görünebilir. Deneyci, 2. günde ortamı değiştirerek kültür kuyularında gözlemlendiğinde tamamen çıkaramaz. Mikroglial hücreler bu enkazı fagosit etme eğilimindedir, bu da stimülasyondan önce mikroglial aktivasyon durumunu etkileyebilir ve böylece deneysel tekrarlanabilirliği etkileyebilir.
Daha önce açıklanan tüm sorun giderme (Ayrışma, Tıkanmış süzgeç ve/veya kolon, Mekanik olarak indüklenen hücre ölümü ve/veya aktivasyonu ve döküntü), hücre sayımı sırasında elde edilen CD11b+ hücrelerinin sayısında değişkenliğe yol açabilir (Şekil 5B). Son hücre verimini optimize etmek için buna çok dikkat etmenizi öneririz.
Kontaminasyon: Bu protokolde, mikroglial hücreler SFM ortamında +% 1 P / S'de kültürlenir. Bu nedenle, ortam kontaminasyonunu önlemek için P / S eklendikten sonra ortamın 50 mL tüplerde aliquot edilmesi önerilir. Ayrıca, tüm deneylerin steril koşullar altında mümkün olduğunca yapılması gerekir.
mRNA miktarı/kalitesi: Ekibimiz miRNA veya siRNA transfeksiyonları üzerinde çalışmaktadır. Mevcut protokol, protokolün hafif bir modifikasyonu ile manyetik transfeksiyon kullanan bu tür uygulamalarla oldukça uyumludur; Deneycinin RT-qPCR için yüksek kaliteli mRNA elde etmek için 12 kuyucuklu plaka başına 700.000 hücre toplaması gerekir. Bu çalışmada RNAseq yapılmamasına rağmen, daha önce ekibimiz 12 kuyucuklu plaka48 başına 500.000 hücre kullanarak RNAseq için mRNA ekstraksiyonu gerçekleştirdi.
Sonuç olarak, bu protokol çoğaltılabilir ve genç gelişim aşamasında mikroglia'yı izole etmek için yeni bir standart olması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Figürler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırma, Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco ve Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al.
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
