Summary
Primära mikrogliakulturer används ofta för att utvärdera nya antiinflammatoriska molekyler. Detta protokoll beskriver en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda ungar.
Abstract
Microglia, som hjärnboende makrofager, är grundläggande för flera funktioner, inklusive svar på miljöstress och hjärnhomeostas. Microglia kan anta ett stort spektrum av aktiveringsfenotyper. Dessutom är microglia som stöder proinflammatorisk fenotyp associerad med både neurodevelopmental och neurodegenerativa störningar. In vitro- studier används ofta i forskning för att utvärdera potentiella terapeutiska strategier i specifika celltyper. I detta sammanhang är det mer relevant att studera mikroglial aktivering och neuroinflammation in vitro med hjälp av primära mikroglialkulturer än mikrogliala cellinjer eller stamcellsbaserade mikroglia. Användningen av vissa primära kulturer kan dock drabbas av brist på reproducerbarhet. Detta protokoll föreslår en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda valpar. Mikroglial aktivering med användning av flera stimuli efter 4 h och 24 h genom mRNA-uttryckskvantifiering och en Cy3-pärlfagocytisk analys demonstreras här. Det aktuella arbetet förväntas ge en lätt reproducerbar teknik för att isolera fysiologiskt relevant mikroglia från juvenila utvecklingsstadier.
Introduction
Microglia är de makrofagliknande cellerna i centrala nervsystemet som härrör från erytropoietiska föregångare till äggula som migrerar till neuroepitelet under tidig embryonal utveckling1. Förutom deras immunitetsfunktioner spelar de också en viktig roll under neuroutveckling, särskilt för synaptogenes, neuronal homeostas och myelinering2. I vuxen ålder utvecklar microglia långa cellulära processer för att skanna miljön kontinuerligt. Vid homeostasbrott som hjärnskada eller hjärnsjukdom kan microglia ändra sitt morfologiska utseende för att anta en amoeboidform, migrera till det skadade området, öka och frigöra många cytoprotektiva eller cytotoxiska faktorer. Microglia har heterogena aktiveringstillstånd beroende på deras utvecklingsstadium och vilken typ av skada som uppstått 3,4,5. I denna studie klassificeras dessa aktiveringstillstånd i stort sett i tre olika fenotyper: proinflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk och immunreglerande, med tanke på att situationen i verkligheten sannolikt kommer att vara mer komplex6.
Att studera mikrogliaaktivering in vivo och screening för neuroprotektiva strategier i tidiga stadier av hjärnans utveckling kan vara utmanande på grund av (1) djurens bräcklighet före avvänjning och (2) det låga antalet mikrogliaceller. Därför används in vitro-studier på mikroglia i stor utsträckning för toxicitet 7,8,9, neuroprotektiva strategier5,10,11,12,13,14 och samkulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-studier kan använda antingen mikrogliala cellinjer, stamcellsderiverade mikroglia eller primär mikrogliakultur. Alla dessa tillvägagångssätt har fördelar och nackdelar, och valet beror på den ursprungliga biologiska frågan. Fördelarna med att använda primära mikrogliakulturer är den homogena genetiska bakgrunden, patogenfri historia och kontroll av den tid då mikroglia stimuleras efter djurdöd22.
Under åren utvecklades olika metoder (flödescytometri, skakning eller magnetisk märkning) för odling av primär mikroglia från gnagare, både nyfödda och vuxna 23,24,25,26,27,28,29. I detta arbete utförs mikrogliaisolering från musnyfödda ungar med hjälp av tidigare beskriven magnetaktiverad cellsorteringsteknik med hjälp av mikropärlbelagd antimus-CD11b25,27,29. CD11b är en integrinreceptor uttryckt vid ytan av myeloida celler, inklusive mikroglia. När det inte finns någon inflammatorisk utmaning i hjärnan är nästan alla CD11b + -celler microglia30. Jämfört med andra tidigare publicerade metoder 23,24,25,26,27,28,29, balanserar detta protokoll omedelbara ex vivo mikroglialaktiveringsanalyser och vanlig in vitro primär mikroglialkultur. Således isoleras mikroglia (1) efter födseln (P) 8 utan myelinavlägsnande, (2) odlas utan serum och (3) exponeras antingen för siRNA, miRNA, farmakologisk förening och / eller inflammatoriska stimuli endast 48 timmar efter hjärnisolering. Var och en av dessa tre aspekter gör det nuvarande protokollet relevant och snabbt. Först och främst möjliggör användningen av pediatrisk mikroglia att erhålla dynamiska och reaktiva livskraftiga celler i odling utan att kräva ett ytterligare demyelineringssteg som potentiellt kan modifiera mikroglial reaktivitet in vitro. Detta protokoll syftar till att komma så nära den fysiologiska miljön i microglia som möjligt. Faktum är att microglia aldrig stöter på serum, och detta protokoll kräver inte heller användning av serum. Dessutom hindrar exponering av mikroglia så tidigt som 48 timmar efter odling dem från att förlora sina fysiologiska förmågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet godkändes och alla djur hanterades enligt de institutionella riktlinjerna från Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrike). Magnetisk isolering av mikroglia från hjärnan hos 24 OF1-musvalpar (både manliga och kvinnliga) vid P8, uppdelad i 6-brunns-, 12-brunns- eller 96-brunnsplattor, presenteras. Det experimentella arbetet utfördes under en huva för att upprätthålla sterila förhållanden.
1. Beredning av sterila lösningar för isolering och cellodling
- Bered 50 ml 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) utan Ca 2+ och Mg2+ (HBSS-/-) från den kommersiellt tillgängliga 10x-lösningen (se materialförteckning).
- Bered dissociationsblandningen enligt den sammansättning som anges i tabell 1 med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt vävnadsdissociationssats (se materialförteckningen).
- Förbered 200 ml 1x HBSS med Ca 2+ och Mg2+ (HBSS+/+) från den kommersiellt tillgängliga 10x-lösningen.
- Förbered 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (kallas cellsorteringsbuffert).
- Förbered CD11b-mikrober enligt tabell 2.
- Förbered 500 ml makrofagserumfritt odlingsmedium (SFM) + 1% penicillin-streptomycin (P/S). Gör alikvoter av 50 ml rör och förvara dem vid 4 °C. Detta kallas mikrogliamediet senare i texten.
OBS: Alla isoleringslösningar måste vara nyberedda under sterila förhållanden på experimentdagen och hållas på is. Microglia-cellodlingsmedium kan framställas, alikvoteras i 50 ml rör och hållas vid 4 °C för framtida bruk. Filtrering behövs inte.
2. Hjärndissektion
- Halshugga valpens huvud med stor sax utan tidigare generell anestesi.
- Skär huden från halsen till näsan efter sagittal sutur (15-20 mm) med liten sax (figur 1A-C).
- Sätt in en liten sax spetsar i Foramen magnum parallellt med skallen. Skär försiktigt från varje sida till ögonen (figur 1D,E).
- Skär mellan ögonen med en liten sax för att lossa skallen och hjärnan från huvudet (figur 1F).
- Med två pincett, ta tag i skallen nära luktlökarna och riv skallen försiktigt, var försiktig så att du inte skadar den underliggande hjärnan (figur 1G-I).
- Ta bort lillhjärnan och olfaktiv glödlampa med ett rakblad och skär hjärnan i två delar (figur 1J).
- Placera hjärnbitarna i en petriskål som innehåller 30-40 ml HBSS-/- (figur 1K).
3. Hjärndissociation och magnetisk mikroglial isolering
OBS: Alla cellmanipulationer och resuspensioner måste utföras med en 1 000 μL pipett med stor försiktighet. Att tillämpa en hög mekanisk verkan kan aktivera eller döda mikrogliaceller.
- Överför 12 hjärnstycken (~ 1,2 g) per dissociationsrör innehållande dissociationsblandning enligt tabell 1. För 24 valpar behövdes fyra C-rör (figur 2A-B).
- Placera C-rör på dissociatorn (med uppvärmningsläge). Starta det optimerade NTDK-programmet i utrustningen enligt tillverkarens instruktioner (figur 2D).
- Centrifugera vid 300 x g i 20 s (vid 4 °C) för att samla upp alla celler. Slutför den mekaniska dissociationen genom att pipettera tre gånger upp och ner med en pipett på 1 000 μl (figur 2E).
- Överför cellerna till fyra 15 ml rör + silar. Skölj silarna med 10 ml HBSS+/+ (figur 2F).
- Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Återsuspendera försiktigt pelleten med 10 ml HBSS+/+ (figur 2G).
- Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Återsuspendera försiktigt pelleten med 6 ml sorteringsbuffert (steg 1.4) (figur 2H).
- Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Tillsätt 200 μl CD11b-mikrob-mikrob-lösning (steg 1.5) per rör och återsuspendera försiktigt (figur 2I).
- Inkubera rören i 15–20 minuter vid 4 °C. Återsuspendera försiktigt pelleten med 6 ml sorteringsbuffert (figur 2I-J).
- Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Återsuspendera försiktigt pelleten med 8 ml sorteringsbuffert (figur 2K).
- Följ POSSEL-programmet på separatorn (se Materialförteckning) för att förbereda åtta kolumner. Överför celler 1 ml med 1 ml på kolonnen. Vänta tills alla celler passerar igenom innan du lägger till ytterligare ml. Eluera CD11b+-celler på steril elueringsplatta med 1 ml sorteringsbuffert (figur 2L).
- Slå samman CD11b+-celler i ett nytt 50 ml rör (bild 2M).
- Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Återsuspendera försiktigt pelleten med 10 ml kallt mikrogliamedium (steg 1.6) (figur 2N).
- Räkna CD11b+-cellerna. Vid P8 bör man få ~650 000 celler per hjärna.
OBS: I detta protokoll räknades cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare (se Materialförteckning). - Återsuspendera cellerna i kallt mikrogliamedium till en slutlig koncentration av 650 000-700 000 celler / ml och dispensera i cellodlingsplattor.
OBS: 6-brunnsplattorna är för Western Blot (2 ml per brunn); 12-brunnsplattorna är för RT-qPCR-analys (1 ml per brunn) och 96-brunnsplattorna är för fagocytisk analys (250 μL per brunn); Alla tre användes för detta arbete. I detta manuskript visas dock inte resultaten från Western Blot-analysen, men det är möjligt att utföra med detta protokoll. - Placera plattorna vid 37 °C med 5 % CO2över natten. Byt mediet försiktigt med en 1 000 μl pipett med förvärmt mikrogliamedium.
- Placera plattorna vid 37 °C med 5% CO2över natten före stimulering.
OBS: Isolering av microglia från mer än 36 valpar och efter P9 rekommenderas inte. Detta kommer att öka risken för kontaminering och ansamling av cellskräp för att aktivera microglia.
4. Cellstimuleringar
- Bered stimuleringsreagenser enligt tabell 3 med hjälp av kommersiellt tillgängliga reagenser (se materialförteckning).
- Lägg till lämplig volym i varje stimulerad brunn.
OBS: Lämplig volym beror på stimulanskoncentrationen och brunnens storlek. - Placera plattorna vid 37 °C med 5%CO2tills stimuleringens slut vid 6 timmar, 24 timmar eller 48 timmar.
- För Western Blot-analysen, aspirera supernatanten och tillsätt 50 μL proteinlysbuffert (se materialtabell) med en pipett. Använd spetsar, repa botten av plattan för att lossa de lyserade cellerna och överför dem till 1,5 ml rör. Förvaras vid -80 °C.
OBS: Odlingsplattorna kan förvaras i flera år vid -80 °C om supernatanten aspireras korrekt. - För RT-qPCR-analys 6,31, aspirera supernatanten och förvara odlingsplattorna direkt vid -80 °C tills mRNA-extraktion (steg 5).
- För fagocytisk analys, se steg 6.
5. mRNA-extraktion och RT-qPCR-analys
- Utför RNA-extraktion, RT-PCR och RT-qPCR enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning). Se tabell 4 för primersekvenserna 5,6,31.
- Utför RT-qPCR-analys genom att följa den tidigare publicerade rapporten5.
6. Fagocytisk analys
- Stimulera cellerna och utför fagocytisk analys under de sista 3 timmarna av stimuleringen. Till exempel, för stimulering av 6 h, starta den fagocytiska analysen efter 3 timmars stimulering; Och för stimulering av 12 h, starta den fagocytiska analysen 9 h efter stimuleringens början.
- Beräkna antalet pärlor som behövs för att förbereda med tanke på förhållandet (1 cell: 50 pärlor). För en brunn på 96-brunnsplattan krävs 8,1 x 106 pärlor. Förbered pärlblandningen enligt tabell 5.
OBS: Virvla försiktigt injektionsflaskan med pärlor innan du lägger till PBS / FBS-blandningen. - Inkubera i 1 timme i ett vattenbad vid 37 °C. Vortex var 10: e minut.
- Beräkna lösningsvolymen som ska läggas till varje brunn. Tillsätt lösningen och inkubera i 3 timmar.
- Skölj brunnarna tre gånger med 1x PBS. Läs fluorescensemissionen vid 550 nm (cy3-emissionsvåglängd).
7. Kvalitetskontroll av renhet
- Utvärdera renheten hos CD11b magnetisk isolering genom flödescytometri (FACS) (före och efter cellsortering) och utför sedan RT-qPCR.
- Räkna cellerna och återsuspendera i FACS-buffert (PBS + 2 mM EDTA + 0,5% bovint serumalbumin) för att erhålla en utspädning av 10 x 106 celler/ml efter steg 3.5 och steg 3.14.
- Efter 15 min av de konventionella Fc-blockerande 32,33 inkubera cellerna i 15 minuter med viabilitetssond (FVS780) och fluoroforkonjugerade antikroppar mot mus CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 eller motsvarande kontrollisotyper 32,33 i den koncentration som rekommenderas av tillverkarna (se Materialförteckning).
- Tvätta cellerna med FACS-buffert, fixa och permeabilisera med ett kommersiellt tillgängligt permeabiliseringssats (se Materialförteckning).
- Utför Fc-blockering igen på de permeabiliserade cellerna och inkubera sedan med fluoroforkonjugerad antikropp mot NeuN (se materialtabell) eller dess kontrollisotyp i 15 minuter.
- Utför FACS-analys efter tvätt med FACS-buffert.
- Efter att ha uteslutit dubblarna och de döda cellerna baserat på morfologiska parametrar respektive FVS780-färgning, välj grindstrategin för ytuttrycket av CX3CR1 (microglia), ACSA-2 (astrocyter), O4 (oligodendrocyter) och intracellulär närvaro av NeuN (neuroner) för analys av procentandelen positiva celler.
- Efter steg 5, extrahera mRNA och utför RT-qPCR för att kvantifiera Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin och Gfap mRNA. Normalisera Cq med Rpl13a mRNA som reporter och utför ett relativt uttryck till Itgam mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia är den CNS-bosatta makrofagen som aktiveras när den utsätts för miljöutmaningar (trauma, giftiga molekyler, inflammation) 4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-studier på mikroglia används ofta för att utvärdera cellautonoma mekanismer relaterade till dessa miljöutmaningar och karakterisera aktiveringstillstånd efter farmakologisk eller genetisk manipulation. Här presenteras ett tillvägagångssätt för att isolera primär mikroglia vid ungdomsstadiet med hjälp av magnetiska kopplade pärlor.
En enkel avläsning för mikroglial aktivering in vitro är att kvantifiera mRNA-uttryck av flera mikroglialreaktivitetsmarkörer associerade med en proinflammatorisk fenotyp (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) eller en antiinflammatorisk fenotyp (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3)5,6,31. Dessa fenotyper beskrevs beroende på mRNA-uttryck efter proinflammatorisk (IL-1β, LPS) eller antiinflammatorisk (IL-4 eller IL-10) stimulans. Vissa markörer klassificeras som immunreglerande markörer eftersom de är uppreglerade genom pro- och antiinflammatorisk stimulering (figur 3A). Denna klassificering beskrevs tidigare av vårt team 5,6,31. Efter 48 h stimulerades isolerad mikroglial med pro- och antiinflammatorisk stimulans i 4 h eller 24 h. mRNA extraherades och RT-qPCR kvantifierade genuttryck. Vid 4 h och 24 h induceras proinflammatoriska och immunreglerande markörer av IL-1β, IL-1β + IFN-γ och LPS 5,6,31. Vid 4 h inducerar IL-4-stimulering också den immunreglerande markören Il-1rn6. De induceras starkt vid 4 h efter IL-4-stimulering avseende antiinflammatoriska markörer. Intressant nog är Cd206 också signifikant uppreglerad 24 timmar efter IL-1β-stimulering6 (figur 3B).
För att utvärdera den fagocytiska aktiviteten hos microglia in vitro användes fluorescerande Cy3 PVC-pärlor. De förbehandlades med fetalt bovint serum (FBS) för att underlätta deras fagocytos med microglia. Microglia polariserades mot proinflammatorisk fenotyp genom stimulering med IL-1β + IFN-γ eller LPS i 3 h eller 21 h. Tre timmar före stimuleringens slut inkuberades Cy3-pärlor med mikrogliaceller. Efter sköljning med 1x PBS kvantifierades fluorescensintensiteten i varje brunn. Kvantifiering i förhållande till brunnar utan pärlor uttrycktes och representativa bilder togs (figur 4). Efter 6 timmars stimulering börjar microglia att fagocyt Cy3-pärlor endast under IL-1β + IFN-γ. Efter en 24 timmars stimulering finns det en ökning av Cy3-fluorescens för båda typerna av stimulering. Den ökningen av Cy3-fluorescens belyser ökad fagocytisk aktivitet (figur 4C).
Flödescytometri (FACS) och RT-qPCR utfördes för att utvärdera mikroglialkulturens renhet. Olika hjärncellpopulationer kan särskiljas genom flödescytometri: CX3CR135 för mikroglia, O4 för oligodendrocyter 36, NeuN för neuroner 37 och ACSA-2 för astrocyter38. Efter dissociation är alla hjärnceller närvarande; Efter cellsortering med CD11b-antikropp finns dock endast mikroglia och små mängder O4-celler närvarande (figur 5A). 48 timmar efter primär cellodling hittas endast mikrogliamarkörer som utvärderats av RT-qPCR (figur 5B).
Figur 1: Steg-för-steg-representation som visar avlägsnandet av hjärnan från skallen. (A-C) Små saxar användes för att skära huden från nacken till näsan efter sagittal sutur. (D-E) Den lilla saxens spetsar sattes in i Foramen magnum parallellt med skallen, och från varje sida till ögonen skars försiktigt. (F) Skallen och hjärnan lossnade från huvudet genom att skära mellan ögonen med en liten sax. (G-I) Skallen greps nära de olfaktiva glödlamporna med två tångar och revs försiktigt för att inte skada den underliggande hjärnan. (J) Lillhjärnan och den olfaktiva glödlampan avlägsnades med ett rakblad och hjärnan skars i två delar. (K) Hjärnbitarna placerades i en petriskål som innehöll 30-40 ml HBSS-/-. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk representation av hjärndissociationer och isolering av mikrogliaceller. (A-C) Efter P8-mushjärndissektion och avlägsnande av olfaktiva lökar och lillhjärna överfördes hjärnor först till en petriskål med HBSS +/+ och sedan till dissociationsrör innehållande dissociationsblandningen. C-rören placerades på dissociatorn (med uppvärmningsläget) och NTDK-programmet startades (D). E) I slutet av programmet centrifugerades rören vid 300 x g i 20 s vid 4 °C. dissociationen slutfördes sedan genom pipettering tre gånger upp och ner med en pipett på 1 000 μL. (F) Cellerna överfördes sedan till 15 ml rör + silar på 70 μm och sköljdes med 10 ml HBSS+/+. (G) Proverna centrifugerades sedan vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C, supernatanten avlägsnades och pelleten återsuspenderades med 10 ml HBSS+/+. (H) Rören centrifugerades igen vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C. supernatanten avlägsnades och sedan återsuspenderades pelleten i 6 ml sorteringsbuffert. (I) Rören centrifugerades vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C, supernatanten avlägsnades och CD11b-mikrob-lösningen (200 μl) tillsattes. Rören inkuberades i 15–20 minuter vid 4 °C och återsuspenderades sedan i 6 ml sorteringsbuffert (J) och centrifugerades vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C. (K) Supernatanten avlägsnades och pelleten återsuspenderades försiktigt i 8 ml sorteringsbuffert. (L) Starta sedan POSSEL-programmet på separatorn för att förbereda kolumner. Celler överfördes 1 ml med 1 ml på kolonnen och CD11b-celler eluerades på en steril elueringsplatta med 1 ml sorteringsbuffert. (M) CD11b-celler poolades i ett nytt 50 ml rör och centrifugerades vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C, och supernatanten avlägsnades. (N) Pelleten återsuspenderades försiktigt i 10 ml kallt mikrogliamedium i det sista steget. Cellerna räknades och späddes ut i mikroglialmediet till en slutlig koncentration av 650 000-700 000 celler/ml dispenserade i cellodlingsplattor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mikroglial aktivering efter exponering för miljöutmaningar. (A) Förenklad schematisk representation av mikroglialt aktiveringsspektrum. (B) Relativ kvantifiering av mikroglialaktiveringsmarkörer efter 4 timmar eller 24 timmars stimulering. Tvåvägs ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelser test39 (n = 5-15); felstaplar representerar SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Utvärdering av den fagocytiska aktiviteten hos microglia in vitro. (A) Representativa bilder av microglia Cy3-pärlor (i rött) fagocytos efter stimulering av 6 h eller 24 h. Bilderna förvärvades med hjälp av 20x mål för fluorescensmikroskopet. Skalstreck = 100 μm. (B) Relativ kvantifiering av fluorescensavgivning per brunn. Statistik utfördes med tvåvägs ANOVA följt av Dunnetts test med flera jämförelser (n = 4-7); felstaplar representerar SEM; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Representativ bild av mikroglia (IBA-1 + celler i grönt) Cy3-pärlor (i rött) fagocytos efter 6 timmars stimulering. Bilderna förvärvas med hjälp av ett 40x mål för konfokalmikroskopet. Skalstreck = 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Utvärdering av CD11b magnetisk isoleringsrenhet genom flödescytometri före och efter cellsortering. (A) Rapporterar exempel från cellräknaren före och efter cellsortering, vilket markerar cellkoncentration och livskraft. (B) X-axeln representerar cellkoncentration (cell/ml) och viabilitet (%) efter cellsortering enligt CD11b. Stapeldiagram; felstaplar representerar SEM (n = 16). Fenotypisk och genuttrycksanalys av cellpopulationsmarkörer före och efter CD11b + cellsortering. Efter dissociation sorterades CD11b + -celler från P8-mösshjärnor magnetiskt. Uttryck av mikroglia (CX3CR1), oligodendrocyter (O4 eller Olig2 mRNA), neuroner (NeuN eller Synaptophysin mRNA)) och astrocyter (ACSA-2 eller Gfap mRNA) markörer analyserades före och efter sortering. (C) FACS-analys av CX3CR1-, O4-, NeuN- och ACSA-2-uttryck. X-axeln representerar procentandelen levande celler och cellnummer. (D) Relativ kvantifiering av CD11b + -celluttryck av Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin och Gfap mRNA (x-axeln representerar relativt mål-mRNA-uttryck till Itgam mRNA). Stapeldiagram; felstaplar representerar SEM (n = 7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | För ett C-rör (μL) | För fyra C-rör (μL) |
| Buffert X | 2850 | 11400 |
| Enzym P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzym A (DNAse) | 15 | 60 |
| Buffert Y | 30 | 120 |
| Total | 2970 | 11880 |
Tabell 1: Beredning av dissociationsblandningen.
| Lösning | För ett rör (μL) | För fyra rör (μL) |
| CD11b Mikropärlor | 20 | 80 |
| Sortering buffert | 180 | 720 |
| Total | 200 | 800 |
Tabell 2: Beredning av CD11b-mikrob-lösningen.
| Stimulering | Koncentration (ng/ml) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
Tabell 3: Stimuleringsreagenserna.
| Gener | Protein | Framåt | Omvända |
| Arg1 | Arginas 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| CD206 | Kluster av differentiering 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA PÅ | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| CD32 | Kluster av differentiering 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG AGERA AA |
| Cd86 | Kluster av differentiering 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Glialfibrillärt surt protein | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | Insulin som tillväxtfaktor 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Interleukin 1-receptorantagonist | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Interleukin 4-receptorantagonist | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | AGERA CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Integrin alfa M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lektin glaktosidbindande löslig 3 | GAT CAC AAT KATT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nr2 | Kväveoxid syntas 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Oligodendrocyt transkriptionsfaktor 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandin endoperoxid syntas 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | Ribosomalt protein L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Suppressor av cytokin 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG PÅ |
| Sphk1 | Sfingosinkinas 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Synaptophysin | ATCTCAGTGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Tumörnekrosfaktor α | GCC TCT TCT KATT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tabell 4: RT-qPCR-primersekvenser.
| Stimulering | För 1-brunn | För n-brunnar |
| Cy3-pärlor (1 cell: 50 pärlor) | 8, 100, 000 | X = (8.100.000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
Tabell 5: Beredning av pärlblandningen för fagocytisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det aktuella arbetet presenterar en primär mikroglialcellodling med magnetiskt sorterade CD11b + -celler. Förutom den mikrogliala funktionella utvärderingen (RT-qPCR och fagocytiska analyser) bestämdes också mikroglialodlingsrenhet.
Klassiska mikrogliacellkulturer genereras vanligtvis från P1- eller P2-gnagare nyfödda hjärna och samodling med astrocyter i minst 10 dagar. Microglia separeras sedan mekaniskt med hjälp av en orbital shaker. Metoden att isolera och odla microglia in vitro beskrevs för första gången i slutet av 1990-talet från hjärnan hos nyfödda råttor40,41. Sedan dess har det använts i stor utsträckning för att analysera mikrogliala fenotyper såsom aktiverad / vilande mikroglia eller proinflammatorisk / antiinflammatorisk mikroglia. Dessutom har detta experiment varit grundläggande för att definiera mikroglia som neurotoxiska celler som odlas tillsammans med neuroner. Men 2014 beskrev Biber och medarbetare tre signifikanta nackdelar med att studera microglia in vitro med klassiska metoder42. (1) Experimentet använder råtta/mus nyfödda hjärnor (P1/P2), och dessa celler passerade inte genom alla mognadsprocesser som kan uppstå in vivo. (2) I samodlingsmediet används 10% FBS; Men in vivo stöter Microglia aldrig på sådana komponenter i en "normal" miljö. (3) Nyligen genomförda studier visar att mikroglia in vivo begränsas av flera hämmande komponenter som inte finns i kulturen43,44. Dessutom beskrev många studier (elektrofysiologisk45 och transkriptomisk46,47) icke-stimulerad primär mikroglia som "aktiverad".
Den nuvarande metoden föreslår en alternativ teknik för att generera mikrogliakulturer med hjälp av magnetiskt cellsorterad teknik. Med detta protokoll skördas mikroglia bara några timmar efter att djuret dör utan något samodlingssteg. Dessutom odlas mikroglia endast 2 dagar in vitro (DIV) före stimulering jämfört med 10-14 DIV, inklusive samodling i andra protokoll. Detta gör det möjligt att komma närmare de mikrogliala fysiologiska förhållandena. Denna procedur för odling av mikroglia in vitro publicerades tidigare 25,26,27,28,29. Det aktuella arbetet presenterade ett optimerat protokoll för nyfödda möss, standardiserat för att minska antalet djur som används och utan myelinborttagningssteg.
För att minska antalet möss som används för primär mikrogliakultur bestämde vi oss för att arbeta på P8 i OF1-stammen. I detta skede av hjärnans utveckling i OF1-stam erhölls upp till 750 000 mikrogliaceller per hjärna, i motsats till 500 000 mikrogliaceller per C57BL6 / J-stammushjärna vid samma ålder. C57BL6/J-stam har publicerats i ett annat utvecklingsstadium för mikrogliaodling27,28. Detta protokoll har också använts med Fmr1KO-möss för att utvärdera fagocytiska egenskaper hos mikroglia kopplade till denna mutation och LysMCre: Dicerfl / + möss för att bedöma mikroglialaktiveringsfenotyper av RT-qPCR. Således är det lite mer utmanande att arbeta med C57BL / 6 J-musstam än att arbeta med OF1-stam på grund av (1) färre mikrogliaceller per hjärna i samma utvecklingsstadium och (2) bräcklighet hos mikroglia som är mer benägna att dö på grund av mekanisk aktivering (se felsökningsavsnittet).
Beroende på det utvecklingsstadium som valts för primär mikrogliakultur måste myelinering övervägas eftersom det börjar runt P5. I en klassisk mikroglialkultur (vid P0-2) är myelinisering inte ett problem; I andra publicerade metoder för att isolera microglia avlägsnas myelin med användning av Percoll-gradient eller anti-myelinantikroppar25,26,28,29. I detta protokoll avlivas djur vid P8 när myeliniseringen redan har börjat; Stora volymer används för att skölja pellets, och det nybildade myelinet kan avlägsnas utan ytterligare procedur. Detta kan vara en felsökningsmetod (se avsnittet Skräp).
Tillverkaren och tidigare publicerade mikroglial magnetisk isolering använde DMEM F-12 media kompletterat med 10% FBS - 1% P / S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 beskrev att microglia sällan kommer i kontakt med serum in vivo. Faktum är att centrala nervsystemets extracellulära vätska sällan innehåller protein och bioaktiva faktorer29. Det är därför serumfritt makrofag (SFM) medium + 1% P / S används i detta protokoll.
Magnetaktiverat cellsorteringsprotokoll (MACS) kan också isolera och odla postnatal råtta mikroglia med vissa modifieringar25,29. Råtta microglia är verkligen isolerade med hjälp av Microbead-belagda anti-råtta CD11b / c. På grund av att hjärnstorleken är större än P8-möss bör dock endast en hjärna per dissociationsrör per kolonn användas. Microglia isolerades från P10-14 råtthjärnor i tidigare publicerade protokoll, inklusive myeliniseringsavlägsnande steg29. Trots de tidigare kommentarerna om odlingsmedium, för råttmikroglialodling, rekommenderas F-12-media + 10% FBS och 550 000-600 000 celler per 12-brunnsplatta för nedströmsapplikationer.
Felsökning
Dissociation: Dissociationsblandningen enligt beskrivningen i tabell 1 beräknas för den maximala mängd hjärna som kan dissocieras och fortsätta vid P8 hos OF1-möss. Om mer hjärna läggs till kan dissociation inte slutföras i slutet av steg 3.2, och icke-dissocierad hjärnvävnad kommer att hittas. I detta fall rekommenderas att köra NTDK-programmet på röret med icke-dissocierad vävnad och hålla de andra rören vid 4 °C.
Täppt sil och/eller kolonn: Som beskrivits tidigare beräknas dissociationsblandningen för den maximala mängden hjärnvävnad som kan passera genom silen under steg 3.5. Om mer hjärna läggs till kan filtreringen ta längre tid, men så småningom kommer den att passera igenom. Det rekommenderas att försiktigt återsuspendera cellsuspensionen på toppen av silen tills all cellsuspension filtreras.
Under steg 3.12 måste experimentören passera märkt cellsuspension genom en kolonn inuti magnetfältet. Kolonnen kan vara igensatt i detta skede av proceduren (1) om för mycket hjärnvävnad dissocieras per rör, (2) om resuspensionsvolymen inte är korrekt, eller (3) om det finns någon mekaniskt inducerad celldöd (vissa DNA kan vara närvarande); I så fall rekommenderas att du tar bort det synliga DNA med en 200 μL spets försiktigt.
Mekaniskt inducerad celldöd och / eller aktivering: Protokollet som beskrivs här presenterar en huvudutmaning: att undvika mekanisk aktivering. För att göra det är det viktigt att pipettera försiktigt och hålla centrifugeringshastigheten låg. Om inte, kan omogna mikroglia dö på grund av den mekaniska spänningen eller aktiveras, vilket leder till hög variation i RT-qPCR-resultat.
Skräp: I denna procedur avlivas djur vid P8 när myeliniseringen just börjar, och därför finns det inget förfarande för att exakt ta bort myelin. Vid detta utvecklingsstadium kan myelin lätt avlägsnas genom centrifugering. Resuspensionsvolymer som beskrivs i denna procedur beräknas för att avlägsna det maximala myelinet. Om det inte respekteras kan myelin uppträda som cellskräp i odlingsbrunnar. Experimentören kan inte helt ta bort den när den observeras i odlingsbrunnar genom att byta medium på dag 2. Mikroglialceller tenderar att fagocytera detta skräp, vilket kan påverka mikroglialaktiveringstillståndet före stimulering och därmed påverka experimentell reproducerbarhet.
All tidigare beskriven felsökning (Dissociation, Täppt sil och/eller kolumn, Mekaniskt inducerad celldöd och/eller aktivering och skräp) kan leda till variationer i antalet CD11b+-celler som erhålls vid cellräkning (figur 5B). Vi rekommenderar att du ägnar stor uppmärksamhet åt detta för att optimera det slutliga cellutbytet.
Kontaminering: I detta protokoll odlas mikrogliaceller i SFM-medium + 1% P / S. SFM-medium kan lätt förorenas. Därför rekommenderas att alikvotera mediet i 50 ml rör efter tillsats av P/S för att undvika medium kontaminering. Dessutom måste alla experiment utföras så mycket som möjligt under sterila förhållanden.
mRNA kvantitet / kvalitet: Vårt team arbetar med miRNA- eller siRNA-transfektioner. Det nuvarande protokollet är mycket kompatibelt med sådana applikationer som använder magnetisk transfektion med en liten modifiering av protokollet; experimenten måste skörda 700 000 celler per 12-brunnsplatta för att få högkvalitativt mRNA för RT-qPCR. Även om RNAseq inte utförs i den aktuella studien, utförde vårt team tidigare mRNA-extraktion för RNAseq med 500 000 celler per 12-brunnsplatta48.
Sammanfattningsvis kan detta protokoll reproduceras, och det förväntas vara en ny standard för att isolera mikroglia i ett juvenilt utvecklingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Figurer skapades med BioRender. Forskningen finansieras av Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco och ett ytterligare bidrag från Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS och Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al.
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
