Summary
Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.
Abstract
Peptidomics kan worden gedefinieerd als de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van peptiden in een biologisch monster. De belangrijkste toepassingen omvatten het identificeren van de peptide biomarkers van ziekte of omgevingsstress, het identificeren van neuropeptiden, hormonen en bioactieve intracellulaire peptiden, het ontdekken van antimicrobiële en nutraceutische peptiden uit eiwithydrolysaten, en kunnen worden gebruikt in studies om de proteolytische processen te begrijpen. De recente vooruitgang in monstervoorbereiding, scheidingsmethoden, massaspectrometrietechnieken en computationele hulpmiddelen met betrekking tot eiwitsequencing heeft bijgedragen aan de toename van het geïdentificeerde aantal peptiden en peptidomes gekarakteriseerd. Peptidomic studies analyseren vaak peptiden die van nature in cellen worden gegenereerd. Hier wordt een monstervoorbereidingsprotocol op basis van warmte-inactivatie beschreven, dat protease-activiteit en extractie met milde omstandigheden elimineert, zodat er geen splitsing van peptidebindingen is. Daarnaast wordt ook de relatieve kwantificering van peptiden met behulp van stabiele isotoopetikettering door reductieve methylering van amines getoond. Deze etiketteringsmethode heeft enkele voordelen omdat de reagentia in de handel verkrijgbaar zijn, goedkoop in vergelijking met andere, chemisch stabiel en de analyse van maximaal vijf monsters in een enkele LC-MS-run mogelijk maken.
Introduction
"Omics" wetenschappen worden gekenmerkt door de diepe analyse van een molecuulset, zoals DNA, RNA, eiwitten, peptiden, metabolieten, enz. Deze gegenereerde grootschalige datasets (genomics, transcriptomics, proteomics, peptidomics, metabolomics, etc.) hebben een revolutie teweeggebracht in de biologie en geleid tot een geavanceerd begrip van biologische processen1. De term peptidomics begon te worden geïntroduceerd in het begin van de 20e eeuw, en sommige auteurs hebben ernaar verwezen als een tak van proteomics2. Peptidomics heeft echter verschillende bijzonderheden, waarbij het belangrijkste belang is om het natuurlijk gegenereerde peptidengehalte tijdens cellulaire processen te onderzoeken, evenals de karakterisering van biologische activiteit van deze moleculen3,4.
Aanvankelijk waren bioactieve peptidestudies beperkt tot de neuropeptiden en hormoonpeptiden door Edman-afbraak en radioimmunoassay. Deze technieken laten echter geen globale analyse toe, afhankelijk van de isolatie van elk peptide in hoge concentraties, tijd voor het genereren van antilichamen, naast kruisreactiviteitsmogelijkheid5.
Peptidomics-analyse werd pas mogelijk gemaakt na verschillende ontwikkelingen in vloeistofchromatografie gekoppelde massaspectrometrie (LC-MS) en genoomprojecten die uitgebreide datapools opleverden voor proteomics/peptidomics studies6,7. Bovendien moest een specifiek peptide-extractieprotocol voor peptidomes worden vastgesteld omdat de eerste studies die neuropeptiden wereldwijd in hersenmonsters analyseerden, aantoonden dat detectie werd beïnvloed door de massale afbraak van eiwitten, die voornamelijk in dit weefsel voorkomen na 1 minuut post-mortem. De aanwezigheid van deze peptidefragmenten maskeerde het neuropeptidesignaal en vertegenwoordigde niet de peptidome in vivo. Dit probleem werd voornamelijk opgelost met de toepassing van snelle verwarmingsinactivatie van proteasen met behulp van microgolfbestraling, die de aanwezigheid van deze artefactfragmenten drastisch verminderde en niet alleen de identificatie van neuropeptidefragmenten mogelijk maakte, maar ook de aanwezigheid van een reeks peptiden uit cytosolische, mitochondriale en nucleaire eiwitten onthulde, verschillend van degradome6,8,9.
Deze methodologische procedures maakten een uitbreiding van de peptidome mogelijk voorbij de bekende neuropeptiden, waar honderden intracellulaire peptiden die voornamelijk worden gegenereerd door de werking van proteasooms zijn geïdentificeerd in gist10, zebravis11, knaagdierweefsels12 en menselijke cellen13. Van tientallen van deze intracellulaire peptiden is uitgebreid aangetoond dat ze zowel biologische als farmacologische activiteiten hebben14,15. Bovendien kunnen deze peptiden worden gebruikt als ziektebiomarkers en hebben ze mogelijk klinische betekenis, zoals aangetoond in hersenvocht van patiënten met intracraniale sacculaire aneurysmata16.
Momenteel is het, naast de identificatie van peptidesequenties, mogelijk om door massaspectrometrie gegevens van absolute en relatieve kwantificering te verkrijgen. In de absolute kwantificering worden de peptideniveaus in een biologisch monster vergeleken met synthetische standaarden, terwijl in de relatieve kwantificering de peptideniveaus worden vergeleken tussen twee of meer monsters17. Relatieve kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van de volgende benaderingen: 1) "labelvrij"18; 2) in vivo metabole etikettering of 3) chemische etikettering. De laatste twee zijn gebaseerd op het gebruik van stabiele isotopische vormen die zijn opgenomen in peptiden19,20. In labelvrije analyse worden de peptideniveaus geschat door rekening te houden met de signaalsterkte (spectrale tellingen) tijdens de LC-MS18. Isotopische etikettering kan echter nauwkeurigere relatieve niveaus van peptiden verkrijgen.
Veel peptidomische studies gebruikten trimethylammoniumbutyraat (TMAB) etiketteringsreagentia als chemische etikettering, en meer recent zijn reductieve methylatie van amines (RMA) met gedeutereerde en niet-gedeutereerde vormen van formaldehyde en natriumcyanoborohydridereagentia gebruikt11,21,22. De TMAB-labels zijn echter niet commercieel verkrijgbaar en het syntheseproces is zeer arbeidsintensief. Aan de andere kant zijn de reagentia in de RMA commercieel verkrijgbaar, goedkoop in vergelijking met andere labels, is de procedure eenvoudig uit te voeren en zijn de gelabelde peptiden stabiel23,24.
Het gebruik van RMA omvat het vormen van een Schiff-base door de peptiden te laten reageren met formaldehyde, gevolgd door een reductiereactie via het cyanoborohydride. Deze reactie veroorzaakt dimethylering van vrije aminogroepen op N-terminals en lysine zijketens en monomethylaten N-terminale prolines. Hoe prolineresiduen vaak zeldzaam zijn op de N-terminal, vrijwel alle peptiden met vrije amines op de N-terminus zijn gelabeld met twee methylgroepen23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedure voor peptide-extractie en reductieve methylatie werd aangepast van eerder gepubliceerde procedures24,25,26,27. Dit protocol volgde de richtlijnen van de National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA) en werd goedgekeurd door de Ethics Commission for Animal Use (CEUA) van het Bioscience Institute van de Sao Paulo State University. De protocolstappen zijn weergegeven in figuur 1.
OPMERKING: Bereid alle waterige oplossingen in ultrapuur water.
1. Peptide extractie
- Celkweek
- Kweek SHSY5Y-cellen in een schaal van 15 cm bij 37 °C onder 5% CO2 in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met 15% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
- Gebruik 2-3 platen voor elk monster. Laat de cellen groeien tot 100% samenvloeiing.
- Was de cellen na de beoogde behandeling tweemaal met een fosfaatgebufferde zoutoplossing. Voeg vervolgens 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing toe, schraap de cellen en verzamel in een buis van 15 ml.
- Centreer bij 800 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspend de pellet in 1 ml ultragezuiverd gedeïoniseerd water bij 80 °C.
- Breng de inhoud van de buis (cellulair lysaat) over naar een microfugebuis van 2 ml.
- Dierlijke weefsels (voornamelijk zenuwweefsel):
- Verdoof de mannelijke volwassen Danio rerio (zebravis) met een dodelijke dosis MS 222 (100 mg/l) en onderwerp deze onmiddellijk aan 8 s microgolfstraling om peptidase en protease te inactiveren.
OPMERKING: U kunt een magnetron van het huishoudelijke type gebruiken. Een 900 W magnetron werd gebruikt voor 8 tot 10 s op vol vermogen. De gebruikte magnetron moet in staat zijn om de hersentemperatuur binnen 10 s te verhogen tot > 80 °C. Reproduceerbaarheid in verwarming tussen monsters zou ook worden bevorderd door het weefsel op dezelfde locatie in de magnetron te plaatsen. - Verzamel na warmte-inactivatie de hele hersenen in een microfugebuis van 2 ml en vries deze in bij −80 °C tot de analyse.
- Resuspend het weefselmonster in 1 ml ultragezuiverd gedeïoniseerd water bij 80 °C. Soniceer het weefsel met een sonde met behulp van 30 pulsen (4 Hz) van 1 s.
OPMERKINGEN: Gebruik voor lever- en nierweefsels een mechanische homogenisator bij 10.000-30.000 tpm gedurende 20 s. Voor spierweefsels maalt u het weefsel in vloeibare stikstof met behulp van een porseleinen smeltkroes en stamper. De volgende stappen zijn hetzelfde voor het cellulaire lysaat of het homogenaatweefsel.
- Verdoof de mannelijke volwassen Danio rerio (zebravis) met een dodelijke dosis MS 222 (100 mg/l) en onderwerp deze onmiddellijk aan 8 s microgolfstraling om peptidase en protease te inactiveren.
- Incubeer het cellulaire lysaat of homogenaatweefsel bij 80 °C gedurende 20 minuten. Koel het vervolgens 10-30 minuten op ijs.
- Voeg 10 μL van 1 M HCl stamoplossing toe voor elke 1 ml monstervolume om een eindconcentratie van 10 mM te verkrijgen. Meng door 20 s te vortexen en incamineer verder op ijs gedurende 15 min.
OPMERKING: Voordat u gaat verzuren, moet u ervoor zorgen dat het monster volledig is afgekoeld om te voorkomen dat de peptidebindingen worden verbroken die worden veroorzaakt door verzuring bij verhoogde temperaturen. - Centrifugeer het cellulaire lysaat of het gehomogeneerde weefsel bij 12.000 x g bij 4 °C gedurende 15 minuten. Verzamel het supernatant in laagbindende eiwitmicrocentrifugebuizen en bewaar het bij -80 °C.
- Reinig de ultrafiltratie-apparaten (10 kDa cut-off filters) door water toe te voegen en centrifugeer bij 2300 x g gedurende 3 min. Herhaal deze stap nog twee keer.
- Plaats het supernatant in de voorgewassen 10 kDa cut-off filters en centrifugeer bij 2.300 x g bij 4 °C gedurende 50 minuten in een gekoelde centrifuge. De doorstroming vertegenwoordigt het peptide-extract.
- Desalt de monsters op omgekeerde fase reinigingskolommen volgens de instructies van de fabrikant met behulp van acetonitril (ACN) en trifluorazijnzuur (TFA) oplossingen zoals hieronder beschreven:
- Breng de kolom in evenwicht met 1 ml van 100% ACN.
- Was de kolom met 1 ml oplossing van 5% ACN met 0,1% TFA.
- Laad het volledige volume van het monster in de kolom.
- Was de kolom met 1 ml oplossing van 5% ACN met 0,1% TFA
- Eluteer de peptiden uit de kolom met een 1,8 ml oplossing van 100% ACN met 0,15% TFA in eiwitarmbindende microcentrifugebuizen.
- Droog het monster volledig in een vacuümcentrifuge. Stel de concentratiemethode voor organische oplosmiddelen en de temperatuur in op 30 °C. De concentratietijd wordt op het display bewaakt.
- Bewaar de monsters bij −80°C tot de volgende stap.
2. Kwantificering van peptiden met fluorescamine
OPMERKING: De hoeveelheid peptide kan worden geschat met behulp van fluorescamine bij pH 6,8 zoals eerder beschreven11,28. Deze methode bestaat uit de aanhechting van een fluorescaminemolecuul aan de primaire amines die aanwezig zijn in de lysine (K) residuen en/of de N-terminal van peptiden. De reactie wordt uitgevoerd bij pH 6,8 om te garanderen dat de fluorescamine alleen reageert met de aminogroepen van de peptiden en niet met vrije aminozuren. De fluorescamine wordt gemeten met behulp van een spectrofluorometer bij een excitatiegolflengte van 370 nm en een emissiegolflengte van 480 nm.
- Bereid verschillende concentraties van het standaardpeptide (0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,5 en 0,7 μg/μL) en bewaar de aliquoten bij -20 °C.
OPMERKING: Het peptide 5A (LTLRTKL) wordt voorgesteld omdat het een bekende samenstelling en concentratie heeft. - Bereid fluorescamine stockoplossing (0,3 mg / ml) in aceton. Aliquot snel in microcentrifugebuizen (1 ml), afdichten met parafilm en bewaren bij -20 °C in het donker.
- Bereid 0,2 M fosfaatbuffer (PB) voor bij pH 6,8.
OPMERKING: Bereid 0,2 M PB door 0,1 M fosfaatbuffer pH 6,8 (26,85 ml Na2HPO3 1M) en 0,1 M fosfaatbuffer pH 6,8 (23,15 ml NaH2PO3 1M) toe te voegen aan 250 ml water - Resuspend de peptidemonsters in 100-200 μL ultragezuiverd water.
- Pipetteer 2,5 μL van de standaard peptideconcentraties en monsters op de witte 96-well plaat voor fluorescentietests in drievoud. Voeg 25 μL 0,2 M fosfaatbuffer toe.
- Voeg 12,5 μL fluorescamine toe met een meerkanaalspipet. Homogeneer voorzichtig gedurende 1 minuut op de orbitale rotator shaker.
- Voeg vervolgens 110 μL water toe met een meerkanaalspipet om de reactie te stoppen.
OPMERKING: Breng de fluorescamine-stamoplossing en het ultrazuivere water over in twee reservoirs om deze oplossingen te pipetteren met een meerkanaalspipet. - Pas de volgende leesparameters op de spectrofluorometer aan: Lees de monsters van bovenaf, excitatiegolflengte bij 370 nm en emissiegolflengte bij 480 nm.
- Lees de plaat op de spectrofluorometer.
3. Reductieve methylering van amines etikettering
OPMERKING: Deze isotopische etiketteringsmethode is gebaseerd op de dimethylering van aminegroepen met gedeutereerde en niet-gedeutereerde vormen van formaldehyde en natriumcyanoboorhydridereagentia. Het eindproduct van deze reactie voegt 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da of 36 Da toe aan de uiteindelijke massa van elk peptide op elke beschikbare etiketteringsplaats (lysine of N-terminal). Deze reactie produceert een m/z-verschil in de peptiden gelabeld met verschillende vormen waargenomen in het MS-spectrum (tabel 1).
LET OP: De juiste veiligheidsuitrusting moet worden gebruikt om deze verbindingen te hanteren en er moet voor worden gezorgd dat de blootstelling tot een minimum wordt beperkt. Procedures met formaldehyde- en natriumcyanoboorhydridereagentia moeten in een zuurkast worden uitgevoerd omdat ze zeer giftig zijn (inclusief het wegen van natriumcyanoboorhydride). Tijdens de blusreactie en verzuring kan een giftig gas (waterstofcyanide) ontstaan.
- Bereid de volgende verse oplossingen uit de voorraad of reagentia op de dag van de procedure in ultrapuur water:
- Verdun de bouillon van 37% formaldehyde (CH2O) tot 4%.
- Verdun de voorraad van 20% Formaldehyde Deuterated (CD2O) tot 4%.
- Verdun de voorraad van 20 % gedeutereerd C13 formaldehyde (13CD2O) tot 4%.
- Bereid 0,6 M NaBH3CN voor.
- Bereid 0,6 m NaBD3CN voor.
- Bereid een oplossing van 1% ammoniumbicarbonaat.
- Bereid een oplossing 5% mierenzuur.
OPMERKING: Met betrekking tot de relatieve kwantificering van peptiden, aangezien verschillende experimentele schema's kunnen worden uitgevoerd afhankelijk van het aantal gebruikte labels, is aandacht nodig tijdens de chemische etiketteringsprocedure. Het wordt aanbevolen om kleine aliquots van de etiketten in afzonderlijke rekken te scheiden met de respectieve monsters die moeten worden geëtiketteerd om de kans op menselijke fouten bij het toevoegen van het verkeerde reagens aan de monsterbuizen te verminderen.
- Bereid elk monster met maximaal 25 μg van het peptide. Monsters mogen geen Tris of ammoniumbicarbonaat bevatten.
OPMERKING: De hieronder beschreven hoeveelheden zijn voldoende voor elk monster in een volume van 100 μL.
Ga verder met de stappen 3.3-3.8 in een zuurkast. - Voeg 1/10e volume van 1 M TEAB toe aan de monsters (eindconcentratie van de oplossing 100 mM TEAB). Controleer de pH met een pH-indicatorpapier; het moet tussen de 5-8 zijn. Pas indien nodig aan met HCl of NaOH.
- Voeg 4 μL niet-gedeutereerde, gedeutereerde formaldehyde of C13-gedeutereerde formaldehyde toe volgens het vastgestelde etiketteringsschema. Meng gedurende 5 s door te vortexen.
- Voeg 4 μL NaBH3CN (0,6 M) of NaBD3CN (0,6 M) toe volgens het vastgestelde etiketteringsschema. Meng gedurende 5 s door te vortexen.
- Incubeer in een zuurkast gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en meng elke 30 minuten.
- Herhaal stap 3.4 en 3.5. Incubeer de monsters 's nachts in een zuurkast bij kamertemperatuur.
- Voeg 16 μL ammoniumbicarbonaat (1%) toe en meng door vortexing. Plaats het monster op ijs, voeg 8 μL mierenzuur (5%) toe en meng met vortex gedurende 5 s.
- Combineer de monsters, pas de pH aan op 2-4 en ontzout de gecombineerde monsters in omgekeerde fase opruimkolommen zoals eerder beschreven in stap 1.8.
- Droog het monster volledig in een vacuümcentrifuge. Stel de concentratiemethode voor organische oplosmiddelen en de temperatuur in op 30 °C. De concentratietijd wordt op het display bewaakt.
- Bewaar de monsters bij -20 °C.
4. Vloeistofchromatografie en massaspectrometrie
- Voer LC-MS-analyse uit met behulp van een nanoHPLC-systeem dat is gekoppeld aan een MS-instrument dat compatibel is met methyltags.
OPMERKING: Een verscheidenheid aan MS-instrumenten is compatibel met RMA-etikettering. Een nanoHPLC-systeem gekoppeld aan Orbitrap wordt meestal gebruikt om LC-MS-analyse uit te voeren via een nano-elektrospulslamionenbron. Eerst wordt het monster in een precolumn geladen en peptiden gescheiden in een analytische kolom. De elutie van peptiden wordt uitgevoerd met behulp van een lineaire gradiënt van 5% -45% acetonitril, in 0,1% mierenzuur, gedurende 90 minuten, met een stroom van 200 nL / min. De massaspectrometer is ingesteld om te functioneren in de gegevensafhankelijke modus. Elke volledige scan wordt verkregen met een intensiteit van 10-30 eV, 2,3 Kv, en vervolgens worden de tien hoogste pieken geselecteerd voor collision-induced dissociation (CID) fragmentatie. De injectietijd wordt ingesteld op de ionenvanger op 100 ms en de Fourier Transform (FT)-MS-injectie wordt vastgesteld met een resolutie van 1000 ms 30.000 bij m/z 300-1800. Een minimum van 5000 tellingen en een dynamische uitsluiting van 70 s wordt gebruikt om fragmentatiescans uit te voeren.
5. Relatieve kwantificering van peptiden
OPMERKING: De MS-spectra worden geanalyseerd in de massaspectrometersoftware. Piekgroepen van gelabelde peptiden met verschillende tags worden geïdentificeerd in de MS-spectra. De relatieve kwantificering wordt berekend door de intensiteit van elke mono-isotopische piek. Elke behandelde groep wordt vergeleken met de respectieve controlegroep.
- Dubbelklik met de rechtermuisknop op het onbewerkte voorbeeldbestand om de spectrumanalysesoftware te openen. Laad de retentietijd (RT) en MS spectrum (EM) chromatogrammen in twee tabbladen, respectievelijk boven en onder.
- Klik eenmaal met de rechtermuisknop achtereenvolgens op de pictogrammen Weergave en Massa in de softwarewerkbalk en stel de massaprecisie in op vier decimalen.
- Plaats de muiscursor ergens op het tabblad RT. Zoek naar de retentietijd van het overeenkomstige ion dat moet worden geanalyseerd en klik met de rechtermuisknop. Het MS-spectrum van de geselecteerde tijd wordt automatisch weergegeven op het tabblad EM.
- Plaats de muiscursor ergens op het tabblad EM. Zoek naar de ionen die moeten worden geanalyseerd.
- Klik met de rechtermuisknop en houd dit vast in een aangrenzend gebied aan de linkerkant in de buurt van deze ionen. Sleep vervolgens de muis naar rechts op het gewenste bereik om in te zoomen op het gewenste gebied.
- Houd de muis op het tabblad EM en klik op de pijlen naar rechts of links om het bereik van de te analyseren ionen te definiëren.
- Plaats de muiscursor opnieuw op het tabblad RT aan het begin van het gewenste tijdsinterval.
- Klik met de rechtermuisknop en sleep de muis tot de gekozen tijdswaarde. Laat de knop staan. De geaccumuleerde intensiteit van de ionen wordt automatisch weergegeven op het em-tabblad.
- Verzamel de m/z-, z- en ionenintensiteitsgegevens op een spreadsheet.
OPMERKING: De mono-isotoopmassa van elk peptide zonder toegevoegde methylgroepen wordt berekend met de volgende formule:
Massa ongewijzigd peptide = (m/z a x z) - (C a x T) - (1,008 x z)
m/zais de waargenomen massa-ladingswaarde voor de mono-isotoop piek voor elk peptide gelabeld met verschillende combinaties van tags (a = 1, 2, 3, 4 of 5, overeenkomend met het monsternummer).
z is de laadstatus.
Ca is de exacte massa van een paar methylgroepen:
Voor a=1, Ca = 28,0313 (de netto toevoeging van twee CH3-groepen aan het primaire amine)
Voor a=2, Ca = 30,0439 voor twee CHD2-groepen
Voor a=3, Ca = 32,0564 voor twee CD2H-groepen
Voor a=4, Ca= 34.0690 voor twee CD3 groepen
Voor a=5, Ca = 36.0757 voor twee 13 CD3 groepen
T is het aantal paren methylgroepen dat in het peptide is opgenomen. Dit kan worden berekend aan de hand van de volgende formule wanneer vijf tags worden gebruikt: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. Voor peptiden die een enkele primaire amine bevatten en daarom zijn gelabeld met slechts twee methylgroepen, vertonen piekoverlappingen op de MS-spectra wanneer aangrenzende labels worden gebruikt. De piekintensiteit van elk gelabeld peptide kan worden gecorrigeerd met behulp van de vergelijkingen beschreven door Tashima en Fricker25.
6. Peptide identificatie
- Om peptiden te identificeren, analyseert u de MS / MS-gegevens met behulp van een databasezoekmachine29,30.
- Als u de foutieve detectiesnelheid (FDR) wilt berekenen met behulp van de lokfusiemethode, zoekt u in een lokdatabase.
OPMERKING: De zoekparameters die over het algemeen worden gebruikt, zijn geen enzymspecificiteit; precursor massatolerantie ingesteld 15-50 ppm; fragmentionenmassatolerantie van 0,5 Da; variabele modificaties: reactieve amines van Leieresiduen en N-terminus van de peptiden isotopisch gemethyleerde labels (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) en L5 (+36)), geoxideerd methionine (+15,99 Da) en acetylering (+42,01 Da). - Sorteer vervolgens de peptiden op hun gemiddelde van lokale betrouwbaarheid om de beste spectra te selecteren om ze te annoteren en filter ze op FDR ≤5%.
Figuur 1: Workflow voor peptidomische studies. Stappen van peptide-extractie en reductieve methylering van amines. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van de runs die op de massaspectrometer worden uitgevoerd, worden opgeslagen in onbewerkte gegevensbestanden die kunnen worden geopend in de massaspectrometersoftware. In de MS-spectra is het mogelijk om piekgroepen te observeren die gelabelde peptiden vertegenwoordigen volgens het gebruikte etiketteringsschema, variërend van 2-5 labels. In figuur 2 worden bijvoorbeeld paren pieken die in een chromatografische tijd zijn gedetecteerd, weergegeven in een experiment waarbij slechts twee isotopische labels werden gebruikt in twee verschillende monsters in dezelfde run. Figuur 3 toont andere mogelijkheden van positieve resultaten, met behulp van 3 en 4 verschillende labels in elke LC-MS run. Bij gebruik van 4 of 5 labels in een LC/MS-run kan er een overlap zijn van pieken van de gelabelde peptiden met de verschillende tags die moeten worden gecorrigeerd om de werkelijke intensiteitswaarde van elke piek te verkrijgen (figuur 4).
De isotopische etikettering kan ook worden gebruikt om substraten en producten in vitro weer te geven voor een bepaald protease of peptidase, zoals weergegeven in figuur 5. Ten slotte kan verschillende software worden gebruikt om de gelabelde peptiden te identificeren, zoals Peaks Studio of MASCOT. Deze softwaretoepassingen zijn gemaakt voor proteomische analyse; daarom mogen de eiwitkwantificeringsgegevens niet in aanmerking worden genomen voor peptidomics-analyse en moet elk gelabeld peptide dat binnen de betrouwbaarheidsparameters is geïdentificeerd, worden gecontroleerd en vervolgens worden gekwantificeerd. Als de peptiden met succes zijn gedetecteerd en gelabeld, zullen deze programma's een lijst met geïdentificeerde peptidesequenties bieden die de labels bevatten. Figuur 6 toont een voorbeeld van de identificatie van een peptidesequentie door het programma. In dit geval werden slechts 3 verschillende vormen van de labels (L1, L3 en L5) gebruikt om drie verschillende monsters afzonderlijk te labelen, die vervolgens in één run werden gemengd en geanalyseerd door massaspectrometrie.
Figuur 2: MS-spectrum representatief voor een chromatografische tijd geaccumuleerd in een typisch etiketteringsexperiment met reductieve dimethylering van amines. In (A) geven de rode pijlen de aanwezigheid aan van piekparen van verschillende peptiden gelabeld met 2 isotopische vormen (L1 en L5) voor vergelijking tussen twee verschillende monsters (S1 en S2). In (B), een vergrote afbeelding van een MS-spectrum van hetzelfde peptide dat verschillende m/z vertoont vanwege het gebruik van labels. In dit geval was er geen variatie in de piekintensiteit voor dit peptide aanwezig in deze monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatief MS-spectrum van gelabelde peptiden met reductieve methylering van amines met behulp van verschillende aantallen tags. (A) Er werd een triplex-etikettering gebruikt. Het is mogelijk om een MS-spectrum van een peptide te observeren dat aanwezig is in 3 verschillende monsters (S1, S2 en S3) gelabeld met respectievelijk L1-, L3- en L5-tags. In dit geval was het niveau van het gelabelde peptide met L5 tweemaal het niveau dat werd waargenomen voor hetzelfde peptide gelabeld met L1- en L3-tags. (B) Een quadripex-etikettering werd uitgevoerd met behulp van de labels L1, L2, L3 en L4. In dit geval werden controlemonsters (S1 en S3) geëtiketteerd met respectievelijk L1 en L3 en vergeleken met twee experimentele monsters (S2 en S4) gelabeld met L2- en L4-labels. Er werden geen significante verschillen waargenomen voor dit peptide tussen de monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatief MS-spectrum van een gelabeld peptide met een piekoverlapping. Deze figuur toont het MS-spectrum van een peptide van lading 3, massa van 2098,87 Da met een enkele primaire amine beschikbaar voor etikettering. Het verschil tussen de gelabelde peptiden is slechts 2 Da, wat een overlap veroorzaakt wanneer 4 of 5 labels worden gebruikt in dezelfde LC / MS-run. Met behulp van een model op basis van kubische polynomiale vergelijkingen is het mogelijk om deze overlappingen tussen de labels te corrigeren. In de grafiek tonen de rode balken het gemiddelde van de intensiteitswaarden die voor dit peptide in twee runs zijn gecorrigeerd. De zwarte balken tonen het gemiddelde van de overlappende intensiteitswaarden. Na correctie vertoonde dit peptide weinig variatie in intensiteit tussen monsters (rode balken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatief MS-spectrum van gelabelde peptiden met reductieve methylering van amines in een proteolysestudie. Hier werden peptide-extracten geïncubeerd met 200 nM en 20 nM neurolysine om hun substraten en producten te karakteriseren. Voor bevestiging van het resultaat werden twee LC/MS runs met Forward en Reverse labeling strategieën uitgevoerd. In de tweede run wordt de positie van de monsters gewijzigd in de etiketteringsprocedure ten opzichte van het schema dat in de eerste run wordt gebruikt. In A wordt een peptide getoond dat niet verandert (NC) in aanwezigheid van het neurolysine-enzym. In B, een peptide dat verdween in de aanwezigheid van een hoge concentratie van het enzym (S2) en dat een kleine vermindering van de lage concentratie van het enzym (S4) vertoonde in zowel voorwaartse als omgekeerde etikettering. Dit peptide wordt beschouwd als een substraat (SB) van het enzym. In C een voorbeeld van een peptide dat als een product (PD) werd beschouwd, omdat de concentratie ervan was verhoogd (S2 en S4) in aanwezigheid van het enzym. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatief MSMS-spectrum en identificatie van een gelabeld peptide uitgevoerd door een databasezoekmachine. In dit voorbeeld is het mogelijk om 2+ ionen waar te nemen met m/z 672.3802, 676.4045 en 680.4241 overeenkomend met een peptide van dezelfde massa gelabeld met respectievelijk de L1, L3 en L5 gemethyleerde vormen. Deze sequentie ADQVSASLAKQGL werd door het MS/MS-spectrum geïdentificeerd als een fragment van het microtubule-geassocieerde eiwit tau isoform X1. Dit peptide heeft de N-terminal en een lysine beschikbaar als labeling sites het toevoegen van een massaverschil van 8 Daltons tussen de gelabelde peptiden. Het MS-spectrum van dit peptide is weergegeven in figuur 3A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Monster | H2CO | D2co | D213co | NaBH3CN | NaBD3CN | Etiket | Extra massa |
| 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | code | (D bis) | |
| 1 | X | X | L1 | 28.0313 | |||
| 2 | X | X | L2 | 30.0439 | |||
| 3 | X | X | L3 | 32.0564 | |||
| 4 | X | X | L4 | 34.069 | |||
| 5 | X | X | L5 | 36.0757 |
Tabel 1: Reagentia van een typisch experiment met de geïndiceerde combinatie van gedeutereerde en niet-gedeutereerde vormen van formaldehyde en natriumcyanoboorhydride.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de meeste peptidomics-studies is een van de kritieke stappen zonder twijfel de monstervoorbereiding die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om de aanwezigheid van peptidefragmenten gegenereerd door proteasen na een paar minuten post-mortem te voorkomen. De eerste studies op hersenextracten bereid uit niet-microgolfmonsters toonden een groot aantal eiwitfragmenten aan die aanwezig waren in de 10-kDa-microfiltraten. Er zijn verschillende benaderingen beschreven om peptidespectra van eiwitafbraak te voorkomen: gerichte microgolfbestraling dierenoffer6,8, cryostaatdissectie gevolgd door een kokende extractiebuffer31 en microgolfbestraling na het offeren van weefsel met behulp van een huishoudelijke microgolfoven9,26 . Voor celkweek en sommige weefsels kan de protease-inactivatie direct worden uitgevoerd door water bij 80 °C toe te voegen. Sommige monsters, zoals zenuwweefsel, kunnen echter gevoeliger zijn voor postmortale verandering en protease-inactivatie door microgolfbestraling is geïndiceerd als een keuzemethode. Bovendien is een ander belangrijk punt tijdens de peptide-extractie om ervoor te zorgen dat extracten ijskoud zijn voordat zuur wordt toegevoegd om te voorkomen dat zuur-labiele bindingen breken, zoals splitsing van Asp-Pro-bindingen26.
Verschillende strategieën kunnen worden gebruikt voor de relatieve kwantificering van peptiden, maar geen van hen kan als volledig ideaal worden beschouwd. Om de te gebruiken methode te kiezen, moet de onderzoeker rekening houden met factoren zoals beschikbaarheid van gebruiksuren in de massaspectrometer, commercieel beschikbaar en kosten voor het etiketteren van reagentia, en gemak bij het analyseren van de verkregen gegevens17,25,26,32. De labelvrije methode is veel gebruikt, maar vereist vele uren in de massaspectrometer. Het is noodzakelijk om technische replicaties voor elk monster te injecteren en is afhankelijk van de chromatografische reproduceerbaarheid tussen de monsters. Andere chemische etiketteringsreagentia, bijvoorbeeld ITRAQ (isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering) en TMT (tandem mass tag), zijn duur en bieden alleen kwantificering van peptiden die zijn geselecteerd voor MS / MS-analyse25,33,34.
De belangrijkste beperking van relatieve kwantificering door chemische etikettering met behulp van RMA is de overlap die optreedt voor sommige peptiden bij het uitvoeren van een protocol met behulp van 4 of 5 labels op dezelfde run, wat resulteert in massaverschillen van 2 Da voor peptiden met een enkele primaire amine en 1 Da voor peptiden met N-terminus proline en geen interne lysineresiduen. Tashima en Fricker (2018) ontwikkelden echter een model om isotopische overlapping te corrigeren op basis van kubische polynomiale vergelijkingen25, die de juiste intensiteit van de gelabelde peptiden in de monsters krijgen. Bovendien zijn niet alle peptiden te zien door RMA. Sommige peptiden missen bijvoorbeeld een N-terminale vrije amine als gevolg van acetylering, pyroglutamylatie of een andere modificatie. Als interne lysines ook afwezig zijn in deze peptiden, worden ze niet gelabeld door het RMA-reagens en verschijnen ze op de m/z-spectra als niet-kwantificeerbare enkele pieken27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen tegenstrijdige financiële belangen.
Acknowledgments
De ontwikkeling en het gebruik van de hier beschreven technieken werden ondersteund door de Braziliaanse National Research Council subsidie 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) subsidies 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) en 21/01286-1 (MEME). De financiers hadden geen rol in de studieopzet, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid - HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer - TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid - TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J.
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A.
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E.
- Baggerman, G., et al.
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L.
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross,, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
