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Biochemistry

नमूना तैयारी और सापेक्ष मात्रा Peptidomics अध्ययन के लिए Amines के रिडक्टिव मिथाइलेशन का उपयोग कर

Published: November 4, 2021 doi: 10.3791/62971
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

Summary

यह आलेख अंतर्जात पेप्टाइड्स को अवक्रमण पोस्टमार्टम से बचने के लिए संरक्षित करने के लिए गर्मी-निष्क्रियता के आधार पर एक नमूना तैयारी विधि का वर्णन करता है, इसके बाद आइसोटोपिक लेबलिंग प्लस एलसी-एमएस का उपयोग करके सापेक्ष मात्रा होती है।

Abstract

पेप्टिडोमिक्स को जैविक नमूने में पेप्टाइड्स के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। इसके मुख्य अनुप्रयोगों में रोग या पर्यावरणीय तनाव के पेप्टाइड बायोमार्कर की पहचान करना, न्यूरोपेप्टाइड्स, हार्मोन और बायोएक्टिव इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स की पहचान करना, प्रोटीन हाइड्रोलिसेट्स से रोगाणुरोधी और न्यूट्रास्यूटिकल पेप्टाइड्स की खोज करना शामिल है, और प्रोटियोलिटिक प्रक्रियाओं को समझने के लिए अध्ययन में उपयोग किया जा सकता है। नमूना तैयारी, अलगाव विधियों, मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों और प्रोटीन अनुक्रमण से संबंधित कम्प्यूटेशनल उपकरणों में हाल ही में अग्रिम ने पहचाने गए पेप्टाइड्स संख्या और पेप्टिडोम की विशेषता की वृद्धि में योगदान दिया है। पेप्टिडोमिक अध्ययन अक्सर पेप्टाइड्स का विश्लेषण करते हैं जो स्वाभाविक रूप से कोशिकाओं में उत्पन्न होते हैं। यहां, गर्मी-निष्क्रियता के आधार पर एक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो प्रोटीज गतिविधि को समाप्त करता है, और हल्के स्थितियों के साथ निष्कर्षण करता है, इसलिए कोई पेप्टाइड बांड दरार नहीं है। इसके अलावा, एमाइंस के रिडक्टिव मिथाइलेशन द्वारा स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करके पेप्टाइड्स की सापेक्ष मात्रा भी दिखाई गई है। इस लेबलिंग विधि के कुछ फायदे हैं क्योंकि अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, दूसरों की तुलना में सस्ती, रासायनिक रूप से स्थिर हैं, और एकल एलसी-एमएस रन में पांच नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देता है।

Introduction

"ओमिक्स" विज्ञान को एक अणु सेट के गहरे विश्लेषण की विशेषता है, जैसे कि डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, पेप्टाइड्स, मेटाबोलाइट्स, आदि। इन बड़े पैमाने पर डेटासेट (जीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटिओमिक्स, पेप्टिडोमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, आदि) ने जीव विज्ञान में क्रांति ला दी है और जैविक प्रक्रियाओं की एक उन्नत समझ का नेतृत्व किया है। पेप्टिडोमिक्स शब्द को 20 वीं शताब्दी की शुरुआत में पेश किया जाने लगा, और कुछ लेखकों ने इसे प्रोटिओमिक्स 2 की एक शाखा के रूप में संदर्भित किया है। हालांकि, पेप्टिडोमिक्स की अलग-अलग विशिष्टताएं हैं, जहां मुख्य रुचि सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान स्वाभाविक रूप से उत्पन्न पेप्टाइड्स सामग्री की जांच करना है, साथ ही साथ इन अणुओं की जैविक गतिविधि के लक्षण वर्णन 3,4।

प्रारंभ में, बायोएक्टिव पेप्टाइड अध्ययन एडमैन गिरावट और रेडियोइम्यूनोसे के माध्यम से न्यूरोपेप्टाइड्स और हार्मोन पेप्टाइड्स तक सीमित थे। हालांकि, ये तकनीकें वैश्विक विश्लेषण की अनुमति नहीं देती हैं, जो उच्च सांद्रता में प्रत्येक पेप्टाइड के अलगाव पर निर्भर करती है, एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए समय, क्रॉस-रिएक्टिविटी संभावना 5 के अलावा।

पेप्टिडोमिक्स विश्लेषण केवल तरल क्रोमैटोग्राफी युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) और जीनोम परियोजनाओं में कई प्रगति के बाद संभव हो गया था, जिसने प्रोटिओमिक्स / पेप्टिडोमिक्स अध्ययन 6,7 के लिए व्यापक डेटा पूल वितरित किए थे। इसके अलावा, पेप्टिडोम के लिए एक विशिष्ट पेप्टाइड निष्कर्षण प्रोटोकॉल स्थापित करने की आवश्यकता थी क्योंकि मस्तिष्क के नमूनों में वैश्विक स्तर पर न्यूरोपेप्टाइड्स का विश्लेषण करने वाले पहले अध्ययनों से पता चला कि पता लगाना प्रोटीन के बड़े पैमाने पर गिरावट से प्रभावित था, जो मुख्य रूप से 1 मिनट के पोस्टमार्टम के बाद इस ऊतक में होता है। इन पेप्टाइड टुकड़ों की उपस्थिति ने न्यूरोपेप्टाइड सिग्नल को नकाबपोश किया और विवो में पेप्टिडोम का प्रतिनिधित्व नहीं किया। इस समस्या को मुख्य रूप से माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग करके प्रोटीज के तेजी से हीटिंग निष्क्रियता के आवेदन के साथ हल किया गया था, जिसने इन आर्टिफैक्ट टुकड़ों की उपस्थिति को काफी कम कर दिया और न केवल न्यूरोपेप्टाइड टुकड़ों की पहचान की अनुमति दी, बल्कि साइटोसोलिक, माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु प्रोटीन से पेप्टाइड्स के एक सेट की उपस्थिति का पता चला, जो डिग्रेडोम 6,8,9 से अलग था।

इन methodological प्रक्रियाओं ने प्रसिद्ध न्यूरोपेप्टाइड्स से परे पेप्टिडोम के विस्तार की अनुमति दी, जहां मुख्य रूप से एंटीऑक्सीम की कार्रवाई से उत्पन्न सैकड़ों इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स को खमीर 10, ज़ेब्राफ़िश 11, कृंतक ऊतक12 और मानव कोशिकाओं 13 में पहचाना गया है। इन इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स के दर्जनों को बड़े पैमाने पर जैविक और औषधीय दोनों गतिविधियों के लिए दिखाया गया है14,15। इसके अलावा, इन पेप्टाइड्स का उपयोग रोग बायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है और संभवतः नैदानिक महत्व है, जैसा कि इंट्राक्रैनियल सैकुलर एन्यूरिज्म वाले रोगियों से मस्तिष्कमेरु द्रव में प्रदर्शित किया गया है।

वर्तमान में, पेप्टाइड अनुक्रमों की पहचान के अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पूर्ण और सापेक्ष मात्रा के डेटा प्राप्त करना संभव है। पूर्ण मात्रा में, जैविक नमूने में पेप्टाइड के स्तर की तुलना सिंथेटिक मानकों से की जाती है, जबकि सापेक्ष मात्रा में, पेप्टाइड के स्तर की तुलना दो या अधिक नमूनों के बीच की जाती है17। सापेक्ष मात्रा निम्नलिखित दृष्टिकोणों का उपयोग करके की जा सकती है: 1) "लेबल मुक्त"18; 2) विवो चयापचय लेबलिंग में या 3) रासायनिक लेबलिंग। अंतिम दो पेप्टाइड्स 19,20 में शामिल स्थिर आइसोटोपिक रूपों के उपयोग पर आधारित हैं। लेबल-मुक्त विश्लेषण में, पेप्टाइड के स्तर का अनुमान एलसी-एमएस 18 के दौरान सिग्नल ताकत (वर्णक्रमीय गिनती) पर विचार करके किया जाता है। हालांकि, आइसोटोपिक लेबलिंग पेप्टाइड्स के अधिक सटीक सापेक्ष स्तर प्राप्त कर सकती है।

कई पेप्टिडोमिक अध्ययनों ने रासायनिक लेबलिंग के रूप में ट्राइमिथाइलअमोनियम ब्यूटिरेट (टीएमएबी) लेबलिंग अभिकर्मकों का उपयोग किया, और हाल ही में, फॉर्मेल्डिहाइड और सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड अभिकर्मकों के ड्यूटेरेटेड और गैर-ड्यूटेरेटेड रूपों के साथ एमाइंस (आरएमए) के रिडक्टिव मिथाइलेशन का उपयोग किया गया है11,21,22। हालांकि, टीएमएबी लेबल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, और संश्लेषण प्रक्रिया बहुत श्रमसाध्य है। दूसरी ओर, आरएमए में, अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, अन्य लेबल की तुलना में सस्ती हैं, प्रक्रिया प्रदर्शन करने के लिए सरल है, और लेबल पेप्टाइड्स स्थिर 23,24 हैं।

आरएमए के उपयोग में पेप्टाइड्स को फॉर्मेल्डिहाइड के साथ प्रतिक्रिया करने की अनुमति देकर एक शिफ बेस बनाना शामिल है, इसके बाद साइनोबोरोहाइड्राइड के माध्यम से कमी की प्रतिक्रिया होती है। यह प्रतिक्रिया एन-टर्मिनलों और लाइसिन साइड चेन और मोनोमेथिलेट्स एन-टर्मिनल प्रोलाइन्स पर मुक्त अमीनो समूहों के डाइमिथाइलेशन का कारण बनती है। कैसे प्रोलाइन अवशेष अक्सर एन-टर्मिनल पर दुर्लभ होते हैं, व्यावहारिक रूप से एन-टर्मिनस पर मुफ्त अमीन्स के साथ सभी पेप्टाइड्स को दो मिथाइल समूहों 23,24,25 के साथ लेबल किया जाता है।

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Protocol

पेप्टाइड निष्कर्षण और रिडक्टिव मिथाइलेशन के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया को पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं 24,25,26,27 से अनुकूलित किया गया था। इस प्रोटोकॉल ने पशु प्रयोग नियंत्रण के लिए राष्ट्रीय परिषद (CONCEA) के दिशानिर्देशों का पालन किया और साओ पाउलो स्टेट यूनिवर्सिटी के बायोसाइंस इंस्टीट्यूट में पशु उपयोग के लिए नैतिकता आयोग (CEUA) द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रोटोकॉल चरण चित्र 1 में दिखाए गए हैं।

नोट: अल्ट्राप्योर पानी में सभी जलीय समाधान तैयार करें।

1. पेप्टाइड निष्कर्षण

  1. सेल संस्कृति
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में 15% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त माध्यम में 5% CO2 के तहत 37 °C पर 15 सेमी डिश में SHSY5Y कोशिकाओं की खेती करें।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए 2-3 प्लेटों का उपयोग करें। कोशिकाओं को 100% संगम तक बढ़ाएं।
    3. उपचार के बाद, कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के साथ दो बार धोएं। इसके बाद, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के 10 मिलीलीटर जोड़ें, कोशिकाओं को स्क्रैप करें और 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
    4. 5 मिनट के लिए 800 x g पर centrifugate और supernatant को हटाने। 80 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी के 1 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. ट्यूब की सामग्री (सेलुलर lysate) एक 2 mL microfuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
  2. पशु ऊतक (मुख्य रूप से तंत्रिका ऊतक):
    1. एनेस्थेटिक जंगली प्रकार के पुरुष वयस्क डैनियो रीरियो (ज़ेब्राफ़िश) को एमएस 222 (100 मिलीग्राम / एल) की घातक खुराक के साथ और तुरंत पेप्टिडेज़ और प्रोटीज को निष्क्रिय करने के लिए माइक्रोवेव विकिरण के 8 एस के अधीन।
      नोट: एक घरेलू प्रकार माइक्रोवेव ओवन का उपयोग किया जा सकता है। एक 900 डब्ल्यू माइक्रोवेव का उपयोग पूर्ण शक्ति पर 8 से 10 सेकंड के लिए किया गया था। उपयोग किए गए माइक्रोवेव को मस्तिष्क के तापमान को 10 सेकंड के भीतर 80 डिग्री सेल्सियस > तक बढ़ाने में सक्षम होना चाहिए। नमूनों के बीच हीटिंग में पुनरुत्पादन भी माइक्रोवेव में एक ही स्थान पर ऊतक को रखकर लाभान्वित किया जाएगा।
    2. गर्मी-निष्क्रियता के बाद, पूरे मस्तिष्क को 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें और विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    3. 80 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी के 1 मिलीलीटर में ऊतक के नमूने को फिर से निलंबित करें। 1 s के 30 दालों (4 हर्ट्ज) का उपयोग करके एक जांच के साथ ऊतक sonicate.
      नोट्स: जिगर और गुर्दे के ऊतकों के लिए, 20 सेकंड के लिए 10,000-30,000 आरपीएम पर एक यांत्रिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करें। मांसपेशियों के ऊतकों के लिए, तरल नाइट्रोजन में एक चीनी मिट्टी के बरतन क्रूसिबल और पेस्टल का उपयोग करके ऊतक को पीसें। निम्नलिखित चरण सेलुलर लिसेट या होमोजेनेट ऊतक के लिए समान हैं।
  3. सेलुलर lysate या homogenate ऊतक 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर incubate. इसके बाद, इसे 10-30 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें।
  4. 10 mM की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए नमूना मात्रा के प्रत्येक 1 mL के लिए 1 M HCl स्टॉक समाधान के 10 μL जोड़ें। 20 s के लिए भंवर द्वारा मिश्रण और आगे 15 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन.
    नोट: अम्लीकरण से पहले, सुनिश्चित करें कि उच्च तापमान पर अम्लीकरण के कारण पेप्टाइड बांड को तोड़ने से बचने के लिए नमूना पूरी तरह से ठंडा हो गया है।
  5. सेलुलर लिसेट या होमोजेनेट ऊतक को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। कम बाध्यकारी प्रोटीन microcentrifuge ट्यूबों में supernatant ले लीजिए और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों (10 केडीए कट-ऑफ फिल्टर) को 3 मिनट के लिए 2300 x g पर पानी और सेंट्रीफ्यूज जोड़कर साफ करें। इस चरण को दो बार और दोहराएं।
  7. एक refridgerated centrifuge में 50 मिनट के लिए 4 °C पर 2,300 x g पर 2,300 x g पर पूर्व धोया 10 kDa कट-ऑफ फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज में supernatant जगह. प्रवाह के माध्यम से पेप्टाइड निकालने का प्रतिनिधित्व करता है।
  8. एसिटोनिट्राइल (एसीएन) और ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (टीएफए) समाधानों का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स-फेज क्लीनअप कॉलम पर नमूनों को डीसॉल्ट करें जैसा कि नीचे वर्णित है:
    1. 100% ACN के 1 mL के साथ स्तंभ को संतुलित करें।
    2. 0.1% TFA के साथ 5% ACN के 1 mL समाधान के साथ स्तंभ धोएं।
    3. स्तंभ में नमूने का पूरा वॉल्यूम लोड करें।
    4. 0.1% TFA के साथ 5% ACN के 1 mL समाधान के साथ स्तंभ को धोएं
    5. प्रोटीन कम बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 0.15% टीएफए के साथ 100% एसीएन के 1.8 मिलीलीटर समाधान के साथ कॉलम से पेप्टाइड्स को एल्यूट करें।
  9. एक वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में पूरी तरह से नमूना सूखी. कार्बनिक सॉल्वैंट्स और तापमान के लिए एकाग्रता विधि 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। एकाग्रता समय प्रदर्शन पर निगरानी की जाती है।
    1. अगले चरण तक नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।

2. फ्लोरोस्कामाइन के साथ पेप्टाइड परिमाणीकरण

नोट: पेप्टाइड की मात्रा का अनुमान पीएच 6.8 पर फ्लोरेस्कामाइन का उपयोग करके लगाया जा सकता है जैसा कि पहले वर्णित 11,28 था। इस विधि में लाइसिन (के) अवशेषों और / या पेप्टाइड्स के एन-टर्मिनल में मौजूद प्राथमिक अमीनों के लिए एक फ्लोरेस्कामाइन अणु का लगाव होता है। प्रतिक्रिया पीएच 6.8 पर की जाती है ताकि यह गारंटी दी जा सके कि फ्लोरोस्कामाइन केवल पेप्टाइड्स के अमीनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है और मुक्त अमीनो एसिड के साथ नहीं। फ्लोरोस्कामाइन को 370 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 480 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है।

  1. मानक पेप्टाइड (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5 और 0.7 μg / μL) की विभिन्न सांद्रता तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर एलीकोट स्टोर करें।
    नोट: पेप्टाइड 5A (LTLRTKL) का सुझाव दिया जाता है क्योंकि इसमें एक ज्ञात संरचना और एकाग्रता है।
  2. एसीटोन में फ्लोरोस्कामाइन स्टॉक समाधान (0.3 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (1 एमएल) में जल्दी से एलीकोट करें, पैराफिल्म का उपयोग करके सील करें, और अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पीएच 6.8 पर 0.2 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) तैयार करें।
    नोट: 0.1 एम फॉस्फेट बफर पीएच 6.8 (Na2HPO3 1M का 26.85 mL) और 0.1 M फॉस्फेट बफर pH 6.8 (NaH2PO3 1M का 23.15 mL) को 250 mL पानी में जोड़कर 0.2 M PB तैयार करें
  4. पेप्टाइड नमूनों को अल्ट्रा-शुद्ध पानी के 100-200 μL में फिर से निलंबित कर दिया।
  5. मानक पेप्टाइड सांद्रता के पिपेट 2.5 μL और सफेद 96-अच्छी तरह से प्लेट पर नमूने प्रतिदीप्ति assays के लिए तीन प्रतियों में assays. 0.2 एम फॉस्फेट बफर के 25 μL जोड़ें.
  6. एक multichannel पिपेट के साथ fluorescamine के 12.5 μL जोड़ें. कक्षीय रोटेटर शेकर पर 1 मिनट के लिए धीरे से homogenize.
  7. इसके बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ 110 μL पानी जोड़ें।
    नोट: एक multichannel पिपेट के साथ इन समाधानों pipette करने के लिए दो जलाशयों के लिए fluorescamine स्टॉक समाधान और ultrapure पानी हस्तांतरण।
  8. स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर पर निम्नलिखित पढ़ने के मापदंडों को समायोजित करें: शीर्ष से नमूनों को पढ़ें, 370 एनएम पर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, और 480 एनएम पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य।
  9. स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर पर प्लेट पढ़ें।

3. amines लेबलिंग के रिडक्टिव मिथाइलेशन

नोट: यह आइसोटोपिक लेबलिंग विधि फॉर्मेल्डिहाइड और सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड अभिकर्मकों के ड्यूटेरेटेड और गैर-ड्यूटेरेटेड रूपों के साथ अमाइन समूहों के डाइमिथाइलेशन पर आधारित है। इस प्रतिक्रिया का अंतिम उत्पाद प्रत्येक उपलब्ध लेबलिंग साइट (लाइसिन या एन-टर्मिनल) पर प्रत्येक पेप्टाइड के अंतिम द्रव्यमान में 28 डीए, 30 डीए, 32 डीए, 34 डीए, या 36 डीए जोड़ता है। यह प्रतिक्रिया एमएस स्पेक्ट्रम (तालिका 1) में देखे गए विभिन्न रूपों के साथ लेबल किए गए पेप्टाइड्स में एक एम / जेड अंतर पैदा करती है।

सावधानी: इन यौगिकों को संभालने के लिए उचित सुरक्षा उपकरण का उपयोग किया जाना चाहिए, और जोखिम को कम करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। फॉर्मेल्डिहाइड और सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड अभिकर्मकों के साथ प्रक्रियाओं को धुएं के हुड में किया जाना चाहिए क्योंकि वे बहुत जहरीले होते हैं (सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड का वजन सहित)। शमन प्रतिक्रिया और अम्लीकरण के दौरान, एक विषाक्त गैस (हाइड्रोजन साइनाइड) उत्पन्न हो सकती है।

  1. अल्ट्राप्योर पानी में प्रक्रिया के दिन स्टॉक या अभिकर्मकों से निम्नलिखित ताजा समाधान तैयार करें:
    1. 37% Formaldehyde (CH2O) के स्टॉक को 4% तक पतला करें।
    2. 20% Formaldehyde Deuterated (CD2O) के स्टॉक को 4% तक पतला करें।
    3. 20% Deuterated C13 Formaldehyde (13CD2O) के स्टॉक को 4% तक पतला करें।
    4. 0.6 M NaBH3CN तैयार करें.
    5. 0.6 M NabD3CN तैयार करें.
    6. 1% अमोनियम बाइकार्बोनेट का एक समाधान तैयार करें।
    7. एक समाधान 5% फॉर्मिक एसिड तैयार करें।
      नोट: पेप्टाइड्स की सापेक्ष मात्रा के बारे में, जैसा कि उपयोग किए गए लेबल की संख्या के आधार पर विभिन्न प्रयोगात्मक योजनाओं का प्रदर्शन किया जा सकता है, रासायनिक लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान ध्यान आवश्यक है। नमूना ट्यूबों में गलत अभिकर्मक जोड़ने में मानव त्रुटि की संभावना को कम करने के लिए लेबल किए जाने वाले संबंधित नमूनों के साथ अलग-अलग रैक में लेबल के छोटे एलीकोट को अलग करने की सिफारिश की जाती है।
  2. पेप्टाइड के 25 μg तक युक्त प्रत्येक नमूने को तैयार करें। नमूनों में Tris या अमोनियम बाइकार्बोनेट नहीं होना चाहिए।
    नोट: नीचे वर्णित मात्रा 100 μL की मात्रा में प्रत्येक नमूने के लिए पर्याप्त हैं।
    एक धुएं हुड में 3.3-3.8 चरणों के साथ आगे बढ़ें।
  3. नमूनों में 1 M TEAB की 1/10 वीं मात्रा जोड़ें (TEAB के समाधान 100 mM की अंतिम एकाग्रता)। एक पीएच संकेतक कागज के साथ पीएच की जाँच करें; यह 5-8 के बीच होना चाहिए। यदि आवश्यक हो तो HCl या NaOH के साथ समायोजित करें।
  4. स्थापित लेबलिंग योजना के अनुसार गैर-deuterated, deuterated Formaldehyde या C13 deuterated Formaldehyde के 4 μL जोड़ें। भंवर द्वारा 5 s के लिए मिश्रण.
  5. स्थापित लेबलिंग योजना के अनुसार NaBH3CN (0.6 M) या NaBD3CN (0.6 M) के 4 μL जोड़ें. भंवर द्वारा 5 s के लिए मिश्रण.
  6. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक धुएं के हुड में इनक्यूबेट करें, हर 30 मिनट में मिश्रण करें।
  7. चरण 3.4 और 3.5 को दोहराएँ। कमरे के तापमान पर रात भर एक धुएं हुड में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  8. अमोनियम बाइकार्बोनेट (1%) के 16 μL जोड़ें और भंवर द्वारा मिश्रण। बर्फ पर नमूना रखें, फॉर्मिक एसिड (5%) के 8 μL जोड़ें, और 5 s के लिए भंवर द्वारा मिश्रण करें।
  9. नमूनों को संयोजित करें, पीएच को 2-4 में समायोजित करें और चरण 1.8 में पहले वर्णित के रूप में उलट-चरण क्लीनअप स्तंभों पर संयुक्त नमूनों को डीसाल्ट करें।
  10. एक वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में पूरी तरह से नमूना सूखी. कार्बनिक सॉल्वैंट्स और तापमान के लिए एकाग्रता विधि 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। एकाग्रता समय प्रदर्शन पर निगरानी की जाती है।
  11. नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।

4. तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. मिथाइल टैग के साथ संगत एक एमएस साधन के लिए युग्मित एक nanoHPLC प्रणाली का उपयोग कर एलसी-एमएस विश्लेषण प्रदर्शन।
    नोट: एमएस उपकरणों की एक किस्म RMA लेबलिंग के साथ संगत हैं। Orbitrap के लिए युग्मित एक nanoHPLC प्रणाली आमतौर पर एक नैनोइलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्रोत के माध्यम से एलसी-एमएस विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है। सबसे पहले, नमूना एक प्रीकॉलम और पेप्टाइड्स में लोड किया जाता है जो एक विश्लेषणात्मक कॉलम में अलग होता है। पेप्टाइड्स का क्षालन 5% -45% एसिटोनिट्राइल के रैखिक ढाल का उपयोग करके किया जाता है, 0.1% फॉर्मिक एसिड में, 90 मिनट के दौरान, 200 एनएल / मिनट के प्रवाह के साथ। द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर डेटा-निर्भर मोड में कार्य करने के लिए सेट किया गया है। प्रत्येक पूर्ण स्कैन को 10-30 ईवी, 2.3 केवी की तीव्रता पर अधिग्रहित किया जाता है, और फिर दस उच्चतम चोटियों को टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) विखंडन के लिए चुना जाता है। इंजेक्शन का समय आयन जाल पर 100 एमएस पर सेट किया गया है, और फूरियर ट्रांसफॉर्म (एफटी) -एमएस इंजेक्शन को एम / जेड 300-1800 पर 1000 एमएस 30,000 के रिज़ॉल्यूशन के साथ तय किया गया है। विखंडन स्कैनिंग करने के लिए न्यूनतम 5000 गिनती और 70 s के गतिशील बहिष्करण का उपयोग किया जाता है।

5. पेप्टाइड्स की सापेक्ष मात्रा

नोट: एमएस स्पेक्ट्रा मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण कर रहे हैं। एमएस स्पेक्ट्रा में विभिन्न टैग के साथ लेबल किए गए पेप्टाइड्स के पीक समूहों की पहचान की जाती है। सापेक्ष मात्रा की गणना प्रत्येक मोनोआइसोटोपिक शिखर की तीव्रता से की जाती है। प्रत्येक उपचारित समूह की तुलना संबंधित नियंत्रण समूह से की जाती है।

  1. स्पेक्ट्रम विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलने के लिए कच्चे नमूना फ़ाइल पर राइट-क्लिक करें। अवधारण समय (RT) और MS स्पेक्ट्रम (EM) क्रोमैटोग्राम को क्रमशः दो टैब, ऊपर और नीचे, में लोड करें।
  2. सॉफ़्टवेयर टूलबार में प्रदर्शन और मास विकल्प आइकन पर एक बार अनुक्रमिक रूप से राइट-क्लिक करें और द्रव्यमान परिशुद्धता को चार दशमलव पर सेट करें।
  3. माउस कर्सर को RT टैब पर कहीं भी रखें. विश्लेषण करने के लिए संबंधित आयन के प्रतिधारण समय के लिए देखो और सही माउस बटन पर क्लिक करें। चयनित समय का एमएस स्पेक्ट्रम स्वचालित रूप से EM टैब में दिखाया जाएगा।
  4. माउस कर्सर को EM टैब पर कहीं भी रखें. आयनों का विश्लेषण करने के लिए देखें।
  5. राइट-क्लिक करें और इन आयनों के पास बाईं ओर एक आसन्न क्षेत्र में पकड़ो। फिर, माउस को रुचि के क्षेत्र को ज़ूम करने के लिए वांछित सीमा पर दाईं ओर खींचें।
  6. माउस को ईएम टैब पर स्थित रखें और विश्लेषण किए जाने वाले आयनों की सीमा को परिभाषित करने के लिए दाएं या बाएं कीबोर्ड तीर पर क्लिक करें।
  7. माउस कर्सर RT टैब को फिर से इच्छित समय अंतराल की शुरुआत में रखें.
  8. राइट-क्लिक करें और माउस को चुने गए समय मान तक खींचें. बटन छोड़ दें। आयनों की संचित तीव्रता स्वचालित रूप से EM टैब पर दिखाई जाएगी।
  9. स्प्रेडशीट पर m/z, z, और आयन तीव्रता डेटा एकत्र करें.
    नोट:: जोड़े गए मिथाइल समूहों के बिना प्रत्येक पेप्टाइड के मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान की गणना निम्न सूत्र से की जाती है:

    द्रव्यमान असंशोधित पेप्टाइड = (m/z a x z) - (C a x T) - (1.008 x z)

    m/zais     प्रत्येक पेप्टाइड के लिए मोनोआइसोटोपिक चोटी के लिए मूल्य चार्ज करने के लिए मनाया गया द्रव्यमान टैग के विभिन्न संयोजनों के साथ लेबल किया गया है (ए = 1, 2, 3, 4 या 5, नमूना संख्या के अनुरूप)।
    z चार्ज स्टेट है।
    Ca मिथाइल समूहों की एक जोड़ी का मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान है:
    a = 1 के लिए, Ca = 28.0313 (प्राथमिक अमाइन के लिए दो CH3 समूहों का शुद्ध जोड़)
    a = 2 के लिए, Ca = 30.0439 दो CHD2 समूहों के लिए
    a = 3 के लिए, Ca = 32.0564 दो CD2H समूहों के लिए
    a = 4 के लिए, Ca = 34.0690 दो CD3 समूहों के लिए
    a = 5 के लिए, Ca = 36.0757 दो 13 CD3 समूहों के लिए
    टी पेप्टाइड में शामिल मिथाइल समूहों के जोड़े की संख्या है। जब पांच टैग का उपयोग किया जाता है तो इसकी गणना निम्नलिखित सूत्र से की जा सकती है: T = z * (m / z5 - m / z1) / 8। पेप्टाइड्स के लिए जिसमें एक एकल प्राथमिक अमाइन होता है और इसलिए केवल दो मिथाइल समूहों के साथ लेबल किया जाता है, जब आसन्न लेबल का उपयोग किया जाता है तो एमएस स्पेक्ट्रा पर पीक ओवरलैप मौजूद होता है। प्रत्येक लेबल पेप्टाइड की चरम तीव्रता को ताशिमा और Fricker25 द्वारा वर्णित समीकरणों का उपयोग करके सही किया जा सकता है।

6. पेप्टाइड पहचान

  1. पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए, डेटाबेस खोज इंजन 29,30 का उपयोग करके एमएस / एमएस डेटा का विश्लेषण करें।
  2. डिकॉय संलयन विधि का उपयोग करके झूठी खोज दर (FDR) की गणना करने के लिए, एक डिकॉय डेटाबेस खोजें.
    नोट: आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले खोज पैरामीटर कोई एंजाइम विशिष्टता नहीं हैं; अग्रदूत बड़े पैमाने पर सहिष्णुता सेट 15-50 पीपीएम; 0.5 Da के टुकड़ा आयन द्रव्यमान सहिष्णुता; चर संशोधनों: लाइस अवशेषों और पेप्टाइड्स आइसोटोपिक मेथिलेटेड लेबल (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) और L5 (+36)), ऑक्सीकृत मेथिओनिन (+15.99 Da) और एसिटिलेशन (+42.01 Da) के एन-टर्मिनस से प्रतिक्रियाशील अमाइन्स।
  3. फिर, पेप्टाइड्स को स्थानीय आत्मविश्वास के अपने औसत से सॉर्ट करें ताकि एनोटेट करने के लिए सबसे अच्छा स्पेक्ट्रा का चयन किया जा सके और उन्हें एफडीआर ≤5% द्वारा फ़िल्टर किया जा सके।

Figure 1
चित्रा 1: Peptidomic अध्ययन वर्कफ़्लो. पेप्टाइड निष्कर्षण और अमाइन के रिडक्टिव मिथाइलेशन के चरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर किए गए रन से प्राप्त परिणाम कच्चे डेटा फ़ाइलों में संग्रहीत किए जाते हैं जिन्हें द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ़्टवेयर में खोला जा सकता है। एमएस स्पेक्ट्रा में, उपयोग की जाने वाली लेबलिंग योजना के अनुसार लेबल किए गए पेप्टाइड्स का प्रतिनिधित्व करने वाले पीक समूहों का निरीक्षण करना संभव है, जो 2-5 लेबल से लेकर हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा 2 में, क्रोमैटोग्राफिक समय में पाए गए चोटियों के जोड़े को एक प्रयोग में दर्शाया गया है जहां एक ही रन में दो अलग-अलग नमूनों में केवल दो आइसोटोपिक लेबल का उपयोग किया गया था। चित्रा 3 सकारात्मक परिणामों की अन्य संभावनाओं को दर्शाता है, प्रत्येक एलसी-एमएस रन में 3 और 4 अलग-अलग लेबल का उपयोग करके। एलसी / एमएस रन में 4 या 5 लेबल का उपयोग करते समय, लेबल किए गए पेप्टाइड्स की चोटियों का ओवरलैप हो सकता है, जिसमें विभिन्न टैग होते हैं जिन्हें प्रत्येक चोटी के वास्तविक तीव्रता मूल्य को प्राप्त करने के लिए सही करने की आवश्यकता होती है (चित्रा 4)।

आइसोटोपिक लेबलिंग का उपयोग किसी दिए गए प्रोटीज या पेप्टिडेज़ के लिए विट्रो में सब्सट्रेट और उत्पादों को दिखाने के लिए भी किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। अंत में, लेबल किए गए पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए विभिन्न सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि चोटियों स्टूडियो या MASCOT। इन सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोगों को प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए बनाया गया था; इसलिए, प्रोटीन मात्रा डेटा को पेप्टिडोमिक्स विश्लेषण के लिए नहीं माना जाना चाहिए, और विश्वसनीयता मापदंडों के भीतर पहचाने जाने वाले प्रत्येक लेबल पेप्टाइड की जांच की जानी चाहिए और फिर परिमाणित किया जाना चाहिए। यदि पेप्टाइड्स का सफलतापूर्वक पता लगाया गया है और लेबल किया गया है, तो ये प्रोग्राम लेबल वाले पहचाने गए पेप्टाइड अनुक्रमों की एक सूची प्रदान करेंगे। चित्रा 6 को प्रोग्राम द्वारा किए गए पेप्टाइड अनुक्रम की पहचान का एक उदाहरण दिखाया गया है। इस मामले में, लेबल के केवल 3 अलग-अलग रूपों (एल 1, एल 3, और एल 5) का उपयोग तीन अलग-अलग नमूनों को अलग-अलग लेबल करने के लिए किया गया था, जिन्हें तब एक ही रन में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मिश्रित और विश्लेषण किया गया था।

Figure 2
चित्रा 2: एक क्रोमैटोग्राफिक समय के एमएस स्पेक्ट्रम प्रतिनिधि एक ठेठ लेबलिंग प्रयोग में जमा amines के रिडक्टिव dimethylation का उपयोग कर. (ए) में, लाल तीर दो अलग-अलग नमूनों (एस 1 और एस 2) के बीच तुलना के लिए 2 आइसोटोपिक रूपों (एल 1 और एल 5) के साथ लेबल किए गए विभिन्न पेप्टाइड्स के शिखर जोड़े की उपस्थिति का संकेत देते हैं। (बी) में, एक ही पेप्टाइड के एमएस स्पेक्ट्रम की एक बढ़ी हुई छवि लेबल के उपयोग के कारण अलग-अलग एम / जेड दिखाती है। इस मामले में, इन नमूनों में मौजूद इस पेप्टाइड के लिए चोटी की तीव्रता में कोई भिन्नता नहीं थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टैग की विभिन्न संख्याओं का उपयोग करके एमाइन्स के रिडक्टिव मेथिलिकरण के साथ लेबल किए गए पेप्टाइड्स के प्रतिनिधि एमएस स्पेक्ट्रम। (ए) एक ट्रिपलएक्स लेबलिंग का उपयोग किया गया था। क्रमशः एल 1, एल 3 और एल 5 टैग के साथ लेबल किए गए 3 अलग-अलग नमूनों (एस 1, एस 2 और एस 3) में मौजूद पेप्टाइड के एमएस स्पेक्ट्रम का निरीक्षण करना संभव है। इस मामले में, L5 के साथ लेबल किए गए पेप्टाइड का स्तर L1 और L3 टैग के साथ लेबल किए गए एक ही पेप्टाइड के लिए देखे गए स्तर से दोगुना था। (बी) एक क्वाड्रिपेक्स लेबलिंग एल 1, एल 2, एल 3 और एल 4 लेबल का उपयोग करके किया गया था। इस मामले में, नियंत्रण नमूने (S1 और S3) को क्रमशः L1 और L3 के साथ लेबल किया गया था, और L2 और L4 लेबल के साथ लेबल किए गए दो प्रयोगात्मक नमूनों (S2 और S4) के साथ तुलना की गई थी। नमूनों के बीच इस पेप्टाइड के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक लेबल पेप्टाइड के प्रतिनिधि एमएस स्पेक्ट्रम एक चोटी ओवरलैप प्रस्तुत करते हैं। यह आंकड़ा चार्ज 3 के पेप्टाइड के एमएस स्पेक्ट्रम को दर्शाता है, लेबलिंग के लिए उपलब्ध एक एकल प्राथमिक अमाइन के साथ 2098.87 डीए का द्रव्यमान। लेबल किए गए पेप्टाइड्स के बीच का अंतर केवल 2 डीए है, जिससे एक ओवरलैप होता है जब एक ही एलसी / एमएस रन में 4 या 5 लेबल का उपयोग किया जाता है। क्यूबिक बहुपद समीकरणों पर आधारित एक मॉडल का उपयोग करके, लेबल के बीच इन ओवरलैप को सही करना संभव है। ग्राफ में, लाल सलाखों दो रन में इस पेप्टाइड के लिए समायोजित तीव्रता मूल्यों का औसत दिखाते हैं। काली पट्टियाँ अतिव्यापी तीव्रता मानों का औसत दिखाती हैं. सुधार के बाद, इस पेप्टाइड ने नमूनों (लाल सलाखों) के बीच तीव्रता में थोड़ी भिन्नता दिखाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक प्रोटियोलिसिस अध्ययन में अमाइन के रिडक्टिव मेथिलिकरण के साथ लेबल किए गए पेप्टाइड्स के प्रतिनिधि एमएस स्पेक्ट्रम। यहां, पेप्टाइड अर्क को उनके सब्सट्रेट और उत्पादों को चिह्नित करने के लिए 200 एनएम और 20 एनएम न्यूरोलिसिन के साथ इनक्यूबेट किया गया था। परिणाम की पुष्टि के लिए, फॉरवर्ड और रिवर्स लेबलिंग रणनीतियों के साथ दो एलसी / एमएस रन किए गए थे। दूसरे रन में नमूनों की स्थिति लेबलिंग प्रक्रिया में पहले रन में उपयोग की जाने वाली योजना के संबंध में बदल जाती है। ए में, यह एक पेप्टाइड दिखाया गया है जो न्यूरोलिसिन एंजाइम की उपस्थिति में नहीं बदलता है (एनसी)। बी में, एक पेप्टाइड जो एंजाइम (एस 2) की उच्च एकाग्रता की उपस्थिति में गायब हो गया और जिसने आगे और रिवर्स लेबलिंग दोनों में एंजाइम (एस 4) की कम एकाग्रता में एक छोटी सी कमी दिखाई। इस पेप्टाइड को एंजाइम का एक सब्सट्रेट (एसबी) माना जाता है। सी में एक पेप्टाइड का एक उदाहरण जिसे एक उत्पाद (पीडी) माना जाता था, क्योंकि एंजाइम की उपस्थिति में इसकी एकाग्रता (एस 2 और एस 4) बढ़ गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि MSMS स्पेक्ट्रम और एक लेबल पेप्टाइड की पहचान एक डेटाबेस खोज इंजन द्वारा प्रदर्शन किया. इस उदाहरण में, क्रमशः एल 1, एल 3 और एल 5 मेथिलेटेड रूपों के साथ लेबल किए गए एक ही द्रव्यमान के पेप्टाइड के अनुरूप एम / जेड 672,3802, 676,4045 और 680,4241 के साथ 2 + आयनों का निरीक्षण करना संभव है। इस अनुक्रम ADQVSASLAKQGL को एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम के माध्यम से सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन ताऊ आइसोफोर्म एक्स 1 के एक टुकड़े के रूप में पहचाना गया था। इस पेप्टाइड में एन-टर्मिनल और एक लाइसिन लेबलिंग साइटों के रूप में उपलब्ध है जो लेबल किए गए पेप्टाइड्स के बीच 8 डाल्टन के बड़े पैमाने पर अंतर को जोड़ता है। इस पेप्टाइड के एमएस स्पेक्ट्रम को चित्र 3 ए में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना H2CO D2CO D213CO NaBH3CN NaBD3CN लेबल अतिरिक्त मास
2 x 4 μL 2 x 4 μL 2 x 4 μL 2 x 4 μL 2 x 4 μL कोड (दा)
1 X X L1 28.0313
2 X X L2 30.0439
3 X X L3 32.0564
4 X X L4 34.069
5 X X L5 36.0757

तालिका 1: फॉर्मेल्डिहाइड और सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड के ड्यूटेरेटेड और गैर-ड्यूटेरेटेड रूपों के संकेतित संयोजन का उपयोग करके एक विशिष्ट प्रयोग के अभिकर्मक।

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Discussion

अधिकांश पेप्टिडोमिक्स अध्ययनों में, महत्वपूर्ण चरणों में से एक, बिना किसी संदेह के, नमूना तैयारी है जिसे कुछ मिनटों के पोस्टमार्टम के बाद प्रोटीज द्वारा उत्पन्न पेप्टाइड टुकड़ों की उपस्थिति से बचने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। गैर-माइक्रोवेव किए गए नमूनों से तैयार मस्तिष्क के अर्क पर प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि 10-केडीए माइक्रोफिल्ट्रेट्स में बड़ी संख्या में प्रोटीन के टुकड़े मौजूद हैं। प्रोटीन क्षरण से पेप्टाइड स्पेक्ट्रा से बचने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है: केंद्रित माइक्रोवेव विकिरण पशु बलिदान 6,8, क्रायोस्टेट विच्छेदन एक उबलते निष्कर्षण बफर 31 के बाद, और एक घरेलू प्रकार के माइक्रोवेव ओवन का उपयोग करके ऊतक के पोस्ट-बलिदान माइक्रोवेव-विकिरण 9,26 . सेल संस्कृति और कुछ ऊतकों के लिए, प्रोटीज निष्क्रियता को सीधे 80 डिग्री सेल्सियस पर पानी जोड़कर किया जा सकता है। हालांकि, कुछ नमूने, जैसे कि तंत्रिका ऊतक, पोस्टमार्टम परिवर्तन के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकते हैं, और माइक्रोवेव विकिरण द्वारा प्रोटीज निष्क्रियता को एक विकल्प विधि के रूप में इंगित किया गया है। इसके अलावा, पेप्टाइड निष्कर्षण के दौरान एक और महत्वपूर्ण बिंदु यह सुनिश्चित करना है कि एसिड-लैबिल बॉन्ड को तोड़ने से रोकने के लिए एसिड जोड़ने से पहले अर्क बर्फ-ठंडे हैं, जैसे एएसपी-प्रो बॉन्ड 26 की दरार।

पेप्टाइड्स के सापेक्ष परिमाणीकरण के लिए विभिन्न रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन उनमें से किसी को भी पूरी तरह से आदर्श नहीं माना जा सकता है। उपयोग की जाने वाली विधि को चुनने के लिए, शोधकर्ता को द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में उपयोग के घंटों की उपलब्धता, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और लेबलिंग अभिकर्मकों की लागत, और प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने में आसानी जैसे कारकों पर विचार करना चाहिए17,25,26,32। लेबल-मुक्त विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है लेकिन द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में कई घंटों की आवश्यकता होती है। प्रत्येक नमूने के लिए तकनीकी प्रतिकृतियों को इंजेक्ट करना आवश्यक है और नमूनों के बीच क्रोमैटोग्राफिक पुनरुत्पादन पर निर्भर करता है। अन्य रासायनिक लेबलिंग अभिकर्मक, उदाहरण के लिए, ITRAQ (सापेक्ष और पूर्ण मात्रा के लिए आइसोबेरिक टैग) और टीएमटी (अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग), महंगे हैं और केवल एमएस / एमएस विश्लेषण 25,33,34 के लिए चयनित पेप्टाइड्स की मात्रा प्रदान करते हैं।

आरएमए का उपयोग करके रासायनिक लेबलिंग के माध्यम से सापेक्ष परिमाणीकरण की प्रमुख सीमा ओवरलैप है जो कुछ पेप्टाइड्स के लिए होती है जब एक ही रन पर 4 या 5 लेबल का उपयोग करके प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप एक एकल प्राथमिक अमाइन के साथ पेप्टाइड्स के लिए 2 डीए और एन-टर्मिनस प्रोलाइन के साथ पेप्टाइड्स के लिए 1 डीए और एन-टर्मिनस प्रोलाइन और कोई आंतरिक लाइसिन अवशेष नहीं होते हैं। हालांकि, ताशिमा और फ्रिकर (2018) ने क्यूबिक बहुपद समीकरण25 के आधार पर आइसोटोपिक ओवरलैपिंग को सही करने के लिए एक मॉडल विकसित किया, जो नमूनों में लेबल पेप्टाइड्स की सही तीव्रता प्राप्त करता है। इसके अलावा, सभी पेप्टाइड्स को आरएमए द्वारा नहीं देखा जा सकता है। उदाहरण के लिए, कुछ पेप्टाइड्स में एसिटिलेशन, पायरोग्लुटामिलेशन, या किसी अन्य संशोधन के कारण एन-टर्मिनल मुक्त अमाइन की कमी होती है। यदि इन पेप्टाइड्स में आंतरिक लाइसिन भी अनुपस्थित हैं, तो उन्हें आरएमए अभिकर्मक द्वारा लेबल नहीं किया जाएगा और एम / जेड स्पेक्ट्रा पर अपरिमाणित एकल चोटियों 27 के रूप में दिखाई देगा।

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Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित मौजूद नहीं है।

Acknowledgments

यहां वर्णित तकनीकों के विकास और उपयोग को ब्राजील के राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद अनुदान 420811/ 2018-4 (एलएमसी) द्वारा समर्थित किया गया था; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (www.fapesp.br) अनुदान 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) और 21/01286-1 (MEME)। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के निर्णय, या लेख की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa cut-off filters Merck Millipore UFC801024 Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Acetonitrile Sigma-Aldrich 1000291000
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 11213
analytical column (EASY-Column) EASY-Column (SC200)  10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 MS-222
Fluorescamine Sigma-Aldrich F9015
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde-13C, d2, solution Sigma-Aldrich 596388
Formaldehyde-d2 solution Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Sigma-Aldrich 33015
Fume hood Quimis Q216
Hydrochloric acid - HCl Sigma-Aldrich 258148
LoBind-Protein retention tubes Eppendorf EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific LTQ Velos
Microwave oven Panasonic NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC Thermo Fisher Scientific LC140
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions Inc. VERSION 8.5
Phosphate-buffered saline Invitrogen 3002 tablets
precolumn (EASY-Column) Thermo Fisher Scientific (SC001) 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1
Refrigerated centrifuge Hermle Z326K for conical tubes
Refrigerated centrifuge Vision VS15000CFNII for microtubes
Reversed-phase cleanup columns   (Oasis HLB 1 cc Cartridge) Waters 186000383 Oasis HLB 1 cc Cartridge
Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN Sigma-Aldrich 190020
Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN Sigma-Aldrich 156159
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763 NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S3139
Sonicator Qsonica Q55-110
Standard peptide Proteimax amino acid sequence: LTLRTKL
Triethylammonium buffer - TEAB 1 M Sigma-Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid - TFA Sigma-Aldrich T6508
Ultra purified water Milli-Q Direct-Q 3UV
Vacuum centrifuge GeneVac MiVac DNA concentrator
Water bath Cientec 266
Xcalibur Software ThermoFisher Scientific OPTON-30965

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जैव रसायन अंक 177
नमूना तैयारी और सापेक्ष मात्रा Peptidomics अध्ययन के लिए Amines के रिडक्टिव मिथाइलेशन का उपयोग कर
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Correa, C. N., Fiametti, L. O., Mazzi Esquinca, M. E., Castro, L. M. d. Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies. J. Vis. Exp. (177), e62971, doi:10.3791/62971 (2021).

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