Summary
Denna artikel beskriver en provberedningsmetod baserad på värme-inaktivering för att bevara endogena peptider undvika nedbrytning post-mortem, följt av relativ mängd med isotopisk märkning plus LC-MS.
Abstract
Peptidomik kan definieras som kvalitativ och kvantitativ analys av peptider i ett biologiskt prov. Dess huvudsakliga tillämpningar inkluderar identifiering av peptid biomarkörer för sjukdom eller miljöbelastning, identifiera neuropeptider, hormoner, och bioaktiva intracellulära peptider, upptäcka antimikrobiella och nutraceutical peptider från protein hydrolysat, och kan användas i studier för att förstå de proteolytiska processerna. Den senaste tidens framsteg inom provberedning, separationsmetoder, masspektrometritekniker och beräkningsverktyg relaterade till proteinsekvensering har bidragit till ökningen av det identifierade peptidertalet och peptidomer som karakteriseras. Peptidomiska studier analyserar ofta peptider som genereras naturligt i celler. Här beskrivs ett provberedningsprotokoll baserat på värmeinaktivering, vilket eliminerar proteasaktivitet och extraktion med milda förhållanden, så det finns ingen peptidbindning klyvning. Dessutom visas den relativa kvantiteten av peptider med stabil isotopmärkning genom reduktiv metylering av aminer. Denna märkningsmetod har vissa fördelar eftersom reagenserna är kommersiellt tillgängliga, billiga jämfört med andra, kemiskt stabila och möjliggör analys av upp till fem prover i en enda LC-MS-körning.
Introduction
"Omics" vetenskaper kännetecknas av djup analys av en molekyluppsättning, såsom DNA, RNA, proteiner, peptider, metaboliter etc. Dessa genererade storskaliga datamängder (genomik, transkriptomik, proteomik, peptidomik, metabolomik, etc.) har revolutionerat biologin och lett till en avancerad förståelse av biologiska processer1. Termen peptidomics började introduceras i början av 1900-talet, och vissa författare har hänvisat till det som en gren av proteomik2. Peptidomik har dock distinkta särdrag, där huvudintresset är att undersöka det naturligt genererade peptideinnehållet under cellulära processer, liksom karakteriseringen av biologisk aktivitet hos dessa molekyler3,4.
Ursprungligen begränsades bioaktiva peptidstudier till neuropeptider och hormonpeptider genom Edman-nedbrytning och radioimmunoassay. Dessa tekniker tillåter dock inte en global analys, beroende på isoleringen av varje peptid i höga koncentrationer, tid för generering av antikroppar, förutom korsreaktivitetsmöjlighet5.
Peptidomics analys gjordes endast möjligt efter flera framsteg i flytande kromatografi kopplad masspektrometri (LC-MS) och genomprojekt som levererade omfattande datapooler för proteomik/peptidomik studier6,7. Dessutom behövde ett specifikt peptidextraktionsprotokoll för peptidomer fastställas eftersom de första studierna som analyserade neuropeptider globalt i hjärnprover visade att detektion påverkades av den massiva nedbrytningen av proteiner, som främst förekommer i denna vävnad efter 1 min obduktion. Förekomsten av dessa peptidfragment maskerade neuropeptidsignalen och representerade inte peptidome in vivo. Detta problem löstes främst med tillämpning av snabb uppvärmning inaktivering av proteaser med hjälp av mikrovåg bestrålning, vilket drastiskt minskade förekomsten av dessa artefakt fragment och tillät inte bara identifiering av neuropeptid fragment men avslöjade förekomsten av en uppsättning peptider från cytosoliska, mitokondriella och nukleära proteiner, olika av degradome6,8,9.
Dessa metodologiska förfaranden tillät en utvidgning av peptidom bortom de välkända neuropeptiderna, där hundratals intracellulära peptider som främst genereras av proteasomernas verkan har identifierats i jäst10, zebrafisk11, gnagare vävnader12 och mänskliga celler13. Dussintals av dessa intracellulära peptider har i stor utsträckning visat sig ha både biologiska och farmakologiska aktiviteter14,15. Dessutom kan dessa peptider användas som sjukdomsbiomarkörer och eventuellt ha klinisk betydelse, vilket visats i ryggmärgsvätskan från patienter med intrakraniell saccular aneurysms16.
För närvarande, förutom identifiering av peptidsekvenser, är det möjligt genom masspektrometri att erhålla data om absolut och relativ mängd. I den absoluta kvantiteten jämförs peptidnivåerna i ett biologiskt prov med syntetiska standarder, medan peptidnivåerna jämförs mellan två eller flera prover17 i den relativa kvantiteten. Relativ kvantitet kan utföras med följande metoder: 1) "etikettfri"18; 2) in vivo metabolisk märkning eller 3) kemisk märkning. De två sista är baserade på användningen av stabila isotopformer som ingår i peptider19,20. I etikettfri analys uppskattas peptidnivåerna med hänsyn till signalstyrkan (spektralantal) under LC-MS18. Isotopmärkning kan dock få mer exakta relativa nivåer av peptider.
Många peptidomiska studier använde trimetylammonium butyrat (TMAB) märkning reagenser som kemisk märkning, och på senare tid, Reduktiv metylering av amines (RMA) med deutererade och icke-deutererade former av formaldehyd och natrium cyanoborohydrid reagenser har använts11,21,22. TMAB-etiketterna är dock inte kommersiellt tillgängliga, och syntesprocessen är mycket mödosam. Å andra sidan, i RMA, reagenserna är kommersiellt tillgängliga, billiga jämfört med andra etiketter, förfarandet är enkelt att utföra och de märkta peptiderna är stabila23,24.
Användningen av RMA innebär att bilda en Schiff-bas genom att låta peptiderna reagera med formaldehyd, följt av en reduktionsreaktion genom cyanoborohydrid. Denna reaktion orsakar dimetylering av fria aminogrupper på N-terminaler och lysin sidokedjor och monometylater N-terminal prolines. Hur prolinrester ofta är sällsynta på N-terminalen, praktiskt taget alla peptider med fria aminer på N-ändstationen är märkta med två metylgrupper23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande förfarande för peptidextraktion och reduktiv metylering anpassades från tidigare publicerade förfaranden24,25,26,27. Detta protokoll följde riktlinjerna från National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA) och godkändes av Ethics Commission for Animal Use (CEUA) vid Bioscience Institute vid Sao Paulo State University. Protokollstegen visas i figur 1.
OBS: Förbered alla vattenlösningar i ultrapurvatten.
1. Peptid extraktion
- Cellkultur
- Odla SHSY5Y-celler i en 15 cm skål vid 37 °C under 5% CO2 i Dulbeccos modifierade Eagles medium som innehåller 15% fetalt bovinserum och 1% Penicillin-Streptomycin.
- Använd 2-3 plattor för varje prov. Odla cellerna till 100% sammanflöde.
- Efter behandling avsedd, tvätta cellerna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning. Tillsätt sedan 10 ml fosfatbuffrad saltlösning, skrapa cellerna och samla in i ett 15 ml-rör.
- Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter och ta bort supernatanten. Återanvänd pelleten i 1 ml ultrarenat avjoniserat vatten vid 80 °C.
- Överför innehållet i röret (cellulär lysate) till ett 2 mL mikrofugerör.
- Djurvävnader (främst nervvävnad):
- Bedöva den vuxna Danio rerio (zebrafisk) med en dödlig dos av MS 222 (100 mg/L) och omedelbart utsätta den för 8 s mikrovågsstrålning för att inaktivera peptidas och proteas.
OBS: En mikrovågsugn av hushållstyp kan användas. En 900 W mikrovågsugn användes för 8 till 10 s vid full effekt. Mikron som används måste kunna höja hjärntemperaturen till > 80 °C inom 10 s. Reproducerbarhet vid uppvärmning mellan proverna skulle också gynnas av att vävnaden placeras på samma plats i mikrovågsugnen. - Efter värmeinaktivering, samla hela hjärnan i ett 2 mL mikrobränslerör och frys vid −80 °C tills analys.
- Återanvänd vävnadsprovet i 1 ml ultrarenat avjoniserat vatten vid 80 °C. Sonikera vävnaden med en sond med 30 pulser (4 Hz) av 1 s.
ANMÄRKNINGAR: För lever- och njurvävnader, använd en mekanisk homogenisator vid 10 000-30 000 rpm i 20 s. För muskelvävnader, slipa vävnaden i flytande kväve med en porslinsdegel och pestle. Följande steg är desamma för den cellulära lysat eller homogenvävnaden.
- Bedöva den vuxna Danio rerio (zebrafisk) med en dödlig dos av MS 222 (100 mg/L) och omedelbart utsätta den för 8 s mikrovågsstrålning för att inaktivera peptidas och proteas.
- Inkubera den cellulära lysat eller homogenvävnaden vid 80 °C i 20 minuter. Kyl sedan det på is i 10-30 min.
- Tillsätt 10 μL 1 M HCl lagerlösning för varje 1 ml provvolym för att erhålla en slutlig koncentration på 10 mM. Blanda genom att virvla i 20 s och inkubera ytterligare på is i 15 min.
OBS: Innan försurningen, se till att provet är helt kylt för att undvika att bryta peptidbindningarna som orsakas av försurning vid förhöjda temperaturer. - Centrifugera den cellulära lysat eller homogenvävnaden vid 12 000 x g vid 4 °C i 15 minuter. Samla supernatanten i lågbindande proteinmikrocentrifugerör och förvara den vid -80 °C.
- Rengör ultrafiltreringsanordningarna (10 kDa-brytfilter) genom att tillsätta vatten och centrifug vid 2300 x g i 3 minuter. Upprepa det här steget två gånger till.
- Placera supernatanten i de förtvättade 10 kDa-skärfiltren och centrifugera vid 2 300 x g vid 4 °C i 50 minuter i en refridgetrerad centrifug. Genomflödet representerar peptidextraktet.
- Avsalta proverna på rensningspelare i omvänd fas enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av lösningar för acetonitril (ACN) och trifluoretiksyra (TFA) enligt beskrivningen nedan:
- Balansera kolonnen med 1 ml 100% ACN.
- Tvätta kolonnen med 1 ml-lösning på 5% ACN med 0,1% TFA.
- Läs in hela volymen för exemplet i kolumnen.
- Tvätta kolonnen med 1 ml-lösning på 5% ACN med 0,1% TFA
- Elute peptiderna från kolonnen med en 1,8 ml lösning på 100% ACN med 0,15% TFA i protein lågbindande mikrocentrifugerör.
- Torka provet helt i en vakuumcentrifuger. Ställ in koncentrationsmetoden för organiska lösningsmedel och temperatur till 30 °C. Koncentrationstiden övervakas på displayen.
- Förvara proverna vid −80°C till nästa steg.
2. Peptidkvantifiering med fluorescamin
OBS: Mängden peptid kan uppskattas med fluorescamin vid pH 6,8 enligt tidigare beskrivna11,28. Denna metod består av fastsättning av en fluorescaminmolekyl till de primära aminer som finns i lysin (K) rester och/eller N-terminalen av peptider. Reaktionen utförs vid pH 6,8 för att garantera att fluorescaminet endast reagerar med peptidernas aminogrupper och inte med fria aminosyror. Fluorescamine mäts med hjälp av en spektrofluorometer vid en excitationsvåglängd på 370 nm och en emissionsvåglängd på 480 nm.
- Förbered olika koncentrationer av standardpeptiden (0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,5 och 0,7 μg/μL) och förvara alikvoterna vid -20 °C.
OBS: Peptiden 5A (LTLRTKL) föreslås eftersom den har en känd sammansättning och koncentration. - Förbered fluorescaminbuljonglösning (0,3 mg/ml) i aceton. Aliquot snabbt i mikrocentrifugerör (1 ml), försegla med parafilm och förvara vid -20 °C i mörker.
- Förbered 0,2 M fosfatbuffert (PB) vid pH 6,8.
OBS: Förbered 0,2 M PB genom att tillsätta 0,1 M fosfatbuffert pH 6,8 (26,85 ml Na2HPO3 1M) och 0,1 M fosfatbuffert pH 6,8 (23,15 ml NaH2PO3 1M) till 250 ml vatten - Återanvänd peptidproverna i 100-200 μL ultrarenat vatten.
- Pipett 2,5 μL av de vanliga peptidkoncentrationerna och proverna på den vita 96-brunnsplattan för fluorescensanalyser i tre exemplar. Tillsätt 25 μL 0,2 M fosfatbuffert.
- Tillsätt 12,5 μL fluorescamin med en flerkanalspipett. Homogenisera försiktigt i 1 min på orbital rotator shaker.
- Tillsätt sedan 110 μL vatten med en flerkanalspipett för att stoppa reaktionen.
OBS: Överför fluorescaminbuljonglösningen och ultrapure vatten till två reservoarer för att pipettera dessa lösningar med en flerkanalspipett. - Justera följande avläsningsparametrar på spektrofluorometern: Läs proverna uppifrån, excitationsvåglängden vid 370 nm och emissionsvåglängden vid 480 nm.
- Läs plattan på spektrofluorometern.
3. Reduktiv metylering av aminer märkning
OBS: Denna isotopmärkningsmetod är baserad på dimetylering avaminegrupper med deutererade och icke-deutererade former av formaldehyd och natriumcyanoborohydridereagenser. Slutprodukten av denna reaktion lägger till 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da eller 36 Da till den slutliga massan av varje peptid vid varje tillgänglig märkningsplats (lysin eller N-terminal). Denna reaktion ger en m/z-skillnad i peptiderna märkta med olika former som observerats i MS-spektrumet (tabell 1).
VARNING: Lämplig säkerhetsutrustning bör användas för att hantera dessa föreningar, och försiktighet bör iakttas för att minimera exponeringen. Förfaranden med formaldehyd och natriumcyanoborohydride reagenser bör utföras i en rökhuv eftersom de är mycket giftiga (inklusive vägning av natriumcyanoborohydrid). Under släckningsreaktionen och försurningen kan en giftig gas (vätecyanid) genereras.
- Förbered följande färska lösningar från beståndet eller reagenserna på dagen för proceduren i ultrapurvatten:
- Späd ut beståndet av 37% Formaldehyd (CH2O) till 4%.
- Späd beståndet av 20% Formaldehyd deuterated (CD2O) till 4%.
- Späd ut beståndet av 20 % Deutererad C13 Formaldehyd (13CD2O) till 4 %.
- Förbered 0,6 M NaBH3CN.
- Förbered 0,6 m NaBD3CN.
- Förbered en lösning av 1% Ammonium bikarbonat.
- Förbered en lösning 5% myrsyra.
OBS: När det gäller den relativa kvantiteten av peptider, eftersom olika experimentella system kan utföras beroende på antalet etiketter som används, är uppmärksamhet nödvändig under det kemiska märkningsförfarandet. Det rekommenderas att små alikvoter av etiketterna separeras i separata rack med respektive prov som ska märkas för att minska risken för mänskliga fel vid tillsats av fel reagens i provrören.
- Förbered varje prov som innehåller upp till 25 μg av peptiden. Proverna får inte innehålla Tris eller Ammonium bikarbonat.
OBS: De kvantiteter som beskrivs nedan är tillräckliga för varje prov i en volym av 100 μL.
Fortsätt med steg 3.3-3.8 i en rökhuv. - Tillsätt 1/10:e volymen 1 M TEAB till proverna (slutlig koncentration av lösningen 100 mM TEAB). Kontrollera pH-värdet med ett pH-indikatorpapper. det måste vara mellan 5-8. Justera med HCl eller NaOH om det behövs.
- Tillsätt 4 μL icke-deutererad, deutererad formaldehyd eller C13 deutererad formaldehyd enligt det fastställda märkningssystemet. Blanda i 5 s genom att virvla.
- Tillsätt 4 μL NaBH3CN (0,6 M) eller NaBD3CN (0,6 M) enligt det fastställda märkningssystemet. Blanda i 5 s genom att virvla.
- Inkubera i en rökhuv i 2 h vid rumstemperatur, blanda var 30: e minut.
- Upprepa steg 3.4 och 3.5. Inkubera proverna i en rökhuv över natten vid rumstemperatur.
- Tillsätt 16 μL ammoniumbikarbonat (1%) och blanda genom virvel. Placera provet på is, tillsätt 8 μL myrsyra (5%) och blanda genom virvel i 5 s.
- Kombinera proverna, justera pH till 2-4 och avsalta de kombinerade proverna på rensningskolumner i omvänd fas enligt beskrivningen i steg 1.8.
- Torka provet helt i en vakuumcentrifuger. Ställ in koncentrationsmetoden för organiska lösningsmedel och temperatur till 30 °C. Koncentrationstiden övervakas på displayen.
- Förvara proverna vid -20 °C.
4. Vätskekromatografi och masspektrometri
- Utför LC-MS-analys med hjälp av ett nanoHPLC-system kopplat till ett MS-instrument som är kompatibelt med metyltaggar.
OBS: En mängd olika MS-instrument är kompatibla med RMA-märkning. Ett nanoHPLC-system kopplat till Orbitrap används vanligtvis för att utföra LC-MS-analys via en nanoelektrosprayjonkälla. För det första laddas provet i en prekolumn och peptider separerade i en analytisk kolumn. Elution av peptider utförs med en linjär gradient på 5%-45% acetonitril, i 0,1% myrsyra, under 90 min, med ett flöde av 200 nL/min. Masspektrometern är inställd på att fungera i databeroende läge. Varje fullständig skanning förvärvas med en intensitet av 10-30 eV, 2.3 Kv, och sedan väljs de tio högsta topparna för kollisionsinducerad dissociation (CID) fragmentering. Injektionstiden sätts på jonfällan vid 100 ms och Fourier Transform (FT)-MS-injektionen fixeras med en upplösning på 1000 ms 30 000 vid m/z 300-1800. Minst 5000 räkningar och ett dynamiskt undantag på 70 s används för att utföra fragmenteringsskanning.
5. Relativ mängd peptider
OBS: MS-spektrat analyseras i massspektrometerprogramvaran. Toppgrupper av märkta peptider med olika taggar identifieras i MS-spektrat. Den relativa kvantiteten beräknas med intensiteten hos varje monoisotop. Varje behandlad grupp jämförs med respektive kontrollgrupp.
- Högerklicka på råprovfilen för att öppna spektrumanalysprogramvaran. Läs in kromatogrammen Retentionstid (RT) och MS spectrum (EM) i två flikar, upptill och nedtill.
- Högerklicka en gång sekventiellt på ikonerna För bildskärms- och massalternativ i programverktygsfältet och ställ in massprecisionen till fyra decimaler.
- Placera muspekaren var som helst på fliken RT. Leta efter kvarhållningstiden för motsvarande jon som ska analyseras och klicka på höger musknapp. MS-spektrumet för den valda tiden visas automatiskt på fliken EM.
- Placera muspekaren var som helst på fliken EM. Leta efter jonerna som ska analyseras.
- Högerklicka och håll ned i en intilliggande region till vänster nära dessa joner. Dra sedan musen åt höger på önskat intervall för att zooma in intresseområdet.
- Håll musen placerad på fliken EM och klicka på höger eller vänster tangentbordspilar för att definiera det jonområde som ska analyseras.
- Placera muspekaren på rt-fliken igen i början av önskat tidsintervall.
- Högerklicka och dra musen tills det valda tidsvärdet. Lämna knappen. Jonernas ackumulerade intensitet visas automatiskt på fliken EM.
- Samla in m/z-, z- och jonintensitetsdata i ett kalkylblad.
OBS: Den monoisotopic massan av varje peptid utan tillsatta metylgrupper beräknas utifrån följande formel:
Massa oförändrad peptid = (m/z a x z) - (C a x T) - (1.008 x z)
m/zais den observerade massan för att ladda värde för den monoisotopic topp för varje peptid märkt med olika kombinationer av taggar (a =1, 2, 3, 4 eller 5, motsvarande provnumret).
z är laddningstillstånd.
Ca är den monoisotopic massan av ett par metylgrupper:
För a=1, Ca = 28,0313 (nettotillskott av två CH3-grupper till den primära amin)
För a=2, Ca = 30,0439 för två CHD2-grupper
För a=3, Ca = 32,0564 för två CD2H-grupper
För a=4, Ca= 34.0690 för två CD3-grupper
För a=5, Ca = 36,0757 för två 13 CD3-grupper
T är antalet par av metylgrupper som ingår i peptiden. Detta kan beräknas utifrån följande formel när fem taggar används: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. För peptider som innehåller en enda primäramin och därför är märkta med endast två metylgrupper finns toppöverlappningar på MS-spektrat när angränsande etiketter används. Toppintensiteten hos varje märkt peptid kan korrigeras med hjälp av de ekvationer som beskrivs av Tashima och Fricker25.
6. Peptididentifiering
- För att identifiera peptider analyserar du MS/MS-data med hjälp av en databassökmotor29,30.
- Om du vill beräkna den falska identifierings hastigheten (FDR) med metoden lockbetefusion söker du i en lockbetesdatabas.
OBS: De sökparametrar som vanligtvis används är ingen enzymspecifikitet; föregångare masstolerans set 15-50 ppm; Fragmentjonmassatolerans på 0,5 da. variabla modifieringar: reaktiva aminer från Lysrester och N-ändstation av peptidernas isotopmetylerade etiketter (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) och L5 (+36)), oxiderat metonin (+15,99 Da) och acetylering (+42,01 Da). - Sortera sedan peptiderna efter deras genomsnitt av lokalt förtroende för att välja det bästa spektrat för att kommentera och filtrera dem efter FDR ≤5%.
Bild 1: Peptidomic studies arbetsflöde. Steg av peptid extraktion och reduktiv metylering av aminer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten från de körningar som utförs på masspektrometern lagras i rådatafiler som kan öppnas i masspektrometerprogramvaran. I MS-spektrat är det möjligt att observera toppgrupper som representerar märkta peptider enligt det märkningsschema som används, allt från 2-5 etiketter. I figur 2 representeras till exempel par av toppar som detekteras under en kromatografisk tid i ett experiment där endast två isotopetiketter användes i två olika prover i samma omgång. Figur 3 visar andra möjligheter till positiva resultat, med hjälp av 3 och 4 olika etiketter i varje LC-MS-körning. Vid användning av 4 eller 5 etiketter i en LC/MS-körning kan det finnas en överlappning av toppar av de märkta peptiderna med de olika taggarna som måste korrigeras för att erhålla det verkliga intensitetsvärdet för varje topp (figur 4).
Isotopmärkningen kan också användas för att visa substrat och produkter in vitro för ett givet proteas eller peptidas, enligt figur 5. Slutligen kan olika program användas för att identifiera de märkta peptiderna, till exempel Peaks Studio eller MASCOT. Dessa program skapades för proteomisk analys; Därför bör proteinkvantitetsdata inte beaktas för peptidomikanalys, och varje märkt peptid som identifieras inom tillförlitlighetsparametrarna måste kontrolleras och sedan kvantifieras. Om peptiderna framgångsrikt har upptäckts och märkts, kommer dessa program att ge en lista över identifierade peptidsekvenser som innehåller etiketterna. Figur 6 visas ett exempel på identifiering av en peptidsekvens som gjorts av programmet. I det här fallet användes endast 3 olika former av etiketterna (L1, L3 och L5) för att märka tre olika prover separat, som sedan blandades och analyserades av masspektrometri i en enda körning.
Figur 2: MS-spektrum som är representativt för en kromatografisk tid som ackumulerats i ett typiskt märkningsexperiment med reduktiv dimetylering av aminer. I (A) anger de röda pilarna närvaron av topppar av olika peptider märkta med 2 isotopformer (L1 och L5) för jämförelse mellan två olika prover (S1 och S2). I (B), en förstorad bild av ett MS-spektrum av samma peptid som visar olika m/z på grund av användningen av etiketter. I detta fall fanns det ingen variation i toppintensiteten för denna peptid närvarande i dessa prover. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativt MS-spektrum av märkta peptider med reduktiv metylering av aminer med hjälp av olika antal taggar. (A) En triplexmärkning användes. Det är möjligt att observera ett MS-spektrum av en peptid som finns i 3 olika prover (S1, S2 och S3) märkta med L1- eller L3- respektive L5-taggar. I detta fall var nivån av den märkta peptiden med L5 dubbelt så hög som den nivå som observerats för samma peptid märkt med L1- och L3-taggar. B) En quadripex-märkning utfördes med etiketterna L1, L2, L3 och L4. I detta fall var kontrollprover (S1 och S3) märkta med L1 respektive L3 och jämfördes med två experimentella prover (S2 och S4) märkta med L2- och L4-etiketter. Inga signifikanta skillnader observerades för denna peptid mellan proverna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativt MS-spektrum av en märkt peptid som uppvisar en toppöverlappning. Denna siffra visar MS-spektrumet av en peptid av laddning 3, massa 2098.87 Da med en enda primär amin tillgänglig för märkning. Skillnaden mellan de märkta peptiderna är endast 2 Da, vilket orsakar en överlappning när 4 eller 5 etiketter används i samma LC/MS-körning. Med hjälp av en modell baserad på kubiska polynomekvationer är det möjligt att korrigera dessa överlappningar mellan etiketterna. I diagrammet visar de röda staplarna medelvärdet av intensitetsvärdena justerade för denna peptid i två körningar. De svarta staplarna visar medelvärdet av de överlappande intensitetsvärdena. Efter korrigering visade denna peptid liten variation i intensitet mellan prover (röda barer). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativt MS-spektrum av märkta peptider med reduktiv metylering av aminer i en proteolysstudie. Här inkuberades peptidextrakt med 200 nM och 20 nM neurolysin för att karakterisera deras substrat och produkter. För bekräftelse av resultatet utfördes två LC/MS-körningar med framåt- och omvänd märkningsstrategier. I den andra körningen ändras provernas position i märkningsförfarandet i förhållande till det schema som användes i den första körningen. I A visas en peptid som inte förändras (NC) i närvaro av enzymet neurolysin. I B, en peptid som försvann i närvaro av en hög koncentration av enzymet (S2) och som visade en liten minskning av den låga koncentrationen av enzymet (S4) i både framåt och omvänd märkning. Denna peptid anses vara ett substrat (SB) av enzymet. I C ett exempel på en peptid som ansågs vara en produkt (PD), eftersom dess koncentration ökades (S2 och S4) i närvaro av enzymet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Representativt MSMS-spektrum och identifiering av en märkt peptid som utförs av en databassökmotor. I det här exemplet är det möjligt att observera 2+ joner med m/z 672,3802, 676,4045 och 680,4241 motsvarande en peptid av samma massa märkt med L1, L3 respektive L5 metylerade former. Denna sekvens ADQVSASLAKQGL identifierades genom MS/MS spektrumet som ett fragment av microtubule-associerade proteinet tau isoform X1. Denna peptid har N-terminalen och en lysin tillgänglig som märkningsställen som lägger till en massskillnad på 8 Dalton mellan de märkta peptiderna. MS-spektrumet för denna peptid visas i figur 3A. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Prov | H2CO | D2CO | D213CO | NaBH3CN | NaBD3CN | Etikett | Ytterligare massa |
| 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | kod | (Da) | |
| 1 | X | X | L1 | 28.0313 | |||
| 2 | X | X | L2 | 30.0439 | |||
| 3 | X | X | L3 | 32.0564 | |||
| 4 | X | X | L4 | 34.069 | |||
| 5 | X | X | L5 | 36.0757 |
Tabell 1: Reagenser från ett typiskt experiment med den angivna kombinationen av deutererade och icke-deutererade former av formaldehyd och natriumcyanoborohydrid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de flesta peptidomikstudier är ett av de kritiska stegen utan tvekan provberedningen som bör utföras noggrant för att undvika förekomst av peptidfragment som genereras av proteaser efter några minuter efter döden. De första studierna på hjärnextrakt som framställts av icke-mikrovågsprover visade att ett stort antal proteinfragment fanns i 10-kDa-mikrofiltraterna. Olika metoder har beskrivits för att undvika peptidspektra från proteinnedbrytning: fokuserad mikrovågsbestrålningsdjuroffer6,8, kryostatdissekering följt av en kokande extraktionsbuffert31 och mikrovågsbestrålning efter offer av vävnad med hjälp av en mikrovågsugn av hushållstyp9,26 . För cellodling och vissa vävnader kan proteasinaktiveringen göras direkt genom att tillsätta vatten vid 80 °C. Vissa prover, såsom nervvävnad, kan dock vara mer känsliga för postmortala förändringar, och proteas inaktivering genom mikrovågsbestrålning har angetts som en valmetod. Dessutom är en annan viktig punkt under peptidextraktionen att se till att extrakten är iskalla innan de tillsätts syra för att förhindra att syra-labila bindningar bryts, som klyvning av Asp-Pro-bindningar26.
Olika strategier kan användas för relativ kvantifiering av peptider, men ingen av dem kan anses vara helt idealisk. För att välja vilken metod som ska användas måste forskaren beakta faktorer som tillgänglighet av användningstimmar i masspektrometern, kommersiellt tillgänglig och kostnader för märkning av reagenser, och underlätta analysen av de data som erhållits17,25,26,32. Den etikettfria metoden har använts i stor utsträckning men kräver många timmar i masspektrometern. Det är nödvändigt att injicera tekniska replikat för varje prov och beror på kromatografisk reproducerbarhet bland proverna. Andra kemiska märkningsreagenser, till exempel ITRAQ (isobariska taggar för relativ och absolut mängd) och TMT (tandemmassatagg), är dyra och ger endast mängd peptider som valts ut för MS/MS-analys25,33,34.
Den största begränsningen av relativ kvantifiering genom kemisk märkning med RMA är den överlappning som uppstår för vissa peptider när man utför ett protokoll med 4 eller 5 etiketter vid samma körning vilket resulterar i massskillnader på 2 Da för peptider med en enda primär amin och 1 Da för peptider med N-terminus proline och inga inre lysinrester. Tashima och Fricker (2018) utvecklade dock en modell för att korrigera isotopisk överlappning baserad på kubiska polynomiska ekvationer25, som får rätt intensitet av de märkta peptiderna i proverna. Dessutom kan inte alla peptider ses av RMA. Till exempel saknar vissa peptider en N-terminalfri amin på grund av acetylering, pyroglutamylation eller annan modifiering. Om interna lysiner också saknas i dessa peptider, kommer de inte att märkas av RMA reagens och kommer att visas på m/z spektra som icke kvantifierbara enstaka toppar27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Utvecklingen och användningen av de tekniker som beskrivs här stöddes av Brasiliens nationella forskningsråds anslag 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) bidrag 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) och 21/01286-1 (MEME). Finansiärerna hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda artikeln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid - HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer - TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid - TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J.
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A.
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E.
- Baggerman, G., et al.
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L.
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross,, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
