Summary
Denne artikkelen beskriver en prøveprepareringsmetode basert på varmeinaktivering for å bevare endogene peptider som unngår nedbrytning etter mortem, etterfulgt av relativ kvantisering ved hjelp av isotopisk merking pluss LC-MS.
Abstract
Peptidomikk kan defineres som kvalitativ og kvantitativ analyse av peptider i en biologisk prøve. Dens viktigste anvendelser inkluderer å identifisere peptidbiomarkører av sykdom eller miljøstress, identifisere nevropeptider, hormoner og bioaktive intracellulære peptider, oppdage antimikrobielle og nutraceutical peptider fra proteinhydrolysater, og kan brukes i studier for å forstå de proteolytiske prosessene. Det nylige fremskrittet innen prøvepreparering, separasjonsmetoder, massespektrometriteknikker og beregningsverktøy relatert til proteinsekvensering har bidratt til økningen av det identifiserte peptidnummeret og peptidomer karakterisert. Peptidomiske studier analyserer ofte peptider som er naturlig generert i celler. Her beskrives en prøveforberedelsesprotokoll basert på varmeinaktivering, som eliminerer proteaseaktivitet og ekstraksjon med milde forhold, så det er ingen peptidbindinger spalting. I tillegg er den relative mengden peptider ved hjelp av stabil isotopmerking ved reduktiv metylering av aminer også vist. Denne merkingsmetoden har noen fordeler ettersom reagensene er kommersielt tilgjengelige, billige sammenlignet med andre, kjemisk stabile og tillater analyse av opptil fem prøver i en enkelt LC-MS-kjøring.
Introduction
"Omics" vitenskaper er preget av den dype analysen av et molekylsett, som DNA, RNA, proteiner, peptider, metabolitter, etc. Disse genererte store datasett (genomikk, transkripsjon, proteomikk, peptidomikk, metabolomikk, etc.) har revolusjonert biologien og ført til en avansert forståelse av biologiske prosesser1. Begrepet peptidomikk begynte å bli introdusert tidlig på 1900-tallet, og noen forfattere har referert til det som en gren av proteomikk2. Peptidomi har imidlertid distinkte særegenheter, hvor hovedinteressen er å undersøke det naturlig genererte peptidinnholdet under cellulære prosesser, samt karakterisering av biologisk aktivitet av disse molekylene3,4.
I utgangspunktet var bioaktive peptidstudier begrenset til nevropeptider og hormonpeptider gjennom Edman nedbrytning og radioimmunoassay. Imidlertid tillater disse teknikkene ikke en global analyse, avhengig av isolasjon av hvert peptid i høye konsentrasjoner, tid for generering av antistoffer, i tillegg til kryssreaktivitetsmulighet5.
Peptidomikkanalyse ble først gjort mulig etter flere fremskritt innen væskekromatografi koblet massespektrometri (LC-MS) og genomprosjekter som leverte omfattende datapooler for proteomikk/peptidomikkstudier6,7. Videre måtte det etableres en spesifikk peptidekstraksjonsprotokoll for peptidomer fordi de første studiene som analyserte nevropeptider globalt i hjerneprøver, viste at deteksjon ble påvirket av massiv nedbrytning av proteiner, som hovedsakelig forekommer i dette vevet etter 1 min post-mortem. Tilstedeværelsen av disse peptidfragmentene maskerte nevropeptidsignalet og representerte ikke peptidomet in vivo. Dette problemet ble løst hovedsakelig ved bruk av rask oppvarming av proteaser ved hjelp av mikrobølgebestråling, noe som drastisk reduserte tilstedeværelsen av disse artefaktfragmentene og tillot ikke bare identifisering av nevropeptidfragmenter, men avslørte tilstedeværelsen av et sett med peptider fra cytosyosolic, mitokondrie og kjerneproteiner, forskjellig fra degradome6,8,9.
Disse metodologiske prosedyrene tillot en utvidelse av peptidomet utover de kjente nevropeptidene, hvor hundrevis av intracellulære peptider generert hovedsakelig ved virkningen av proteasomer har blitt identifisert i gjær10, sebrafisk11, gnagervev12 og menneskelige celler13. Dusinvis av disse intracellulære peptidene har vist seg å ha både biologiske og farmakologiske aktiviteter14,15. Videre kan disse peptidene brukes som sykdomsbiomarkører og muligens ha klinisk betydning, som vist i cerebrospinalvæske fra pasienter med intrakraniell saccular aneurisme16.
For tiden, i tillegg til identifisering av peptidsekvenser, er det mulig gjennom massespektrometri å skaffe data om absolutt og relativ kvantifisering. I absolutt kvantasjon sammenlignes peptidnivåene i en biologisk prøve med syntetiske standarder, mens peptidnivåene i den relative mengden sammenlignes mellom to eller flere prøver17. Relativ kvantgering kan utføres ved hjelp av følgende tilnærminger: 1) "etikettfri"18; 2) in vivo metabolsk merking eller 3) kjemisk merking. De to siste er basert på bruk av stabile isotopiske former innlemmet i peptider19,20. I etikettfri analyse estimeres peptidnivåene ved å vurdere signalstyrken (spektraltall) under LC-MS18. Imidlertid kan isotopisk merking oppnå mer nøyaktige relative nivåer av peptider.
Mange peptotomiske studier brukte trimethylammonium butyrate (TMAB) merking reagenser som kjemisk merking, og mer nylig, Reduktiv metylering av aminer (RMA) med deuterated og ikke-deutered former for formaldehyd og natrium cyanoborohydrid reagenser har blitt brukt11,21,22. TMAB-etikettene er imidlertid ikke kommersielt tilgjengelige, og synteseprosessen er veldig arbeidskrevende. På den annen side, i RMA, er reagensene kommersielt tilgjengelige, billige sammenlignet med andre etiketter, prosedyren er enkel å utføre, og de merkede peptidene er stabile23,24.
Bruken av RMA innebærer å danne en Schiff-base ved å la peptidene reagere med formaldehyd, etterfulgt av en reduksjonsreaksjon gjennom cyanoborohydridet. Denne reaksjonen forårsaker dimetylering av frie aminogrupper på N-terminaler og lysin sidekjeder og monometylater N-terminal prolines. Hvordan prolinrester ofte er sjeldne på N-terminalen, er praktisk talt alle peptider med frie aminer på N-terminus merket med to metylgrupper23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyre for peptidutvinning og reduktiv metylering ble tilpasset fra tidligere publiserte prosedyrer24,25,26,27. Denne protokollen fulgte retningslinjene fra National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA) og ble godkjent av Etikkkommisjonen for dyrebruk (CEUA) ved Bioscience Institute of Sao Paulo State University. Protokolltrinnene vises i figur 1.
MERK: Forbered alle vandige løsninger i ultrarent vann.
1. Peptid ekstraksjon
- Cellekultur
- Dyrk SHSY5Y-celler i en 15 cm tallerken ved 37 °C under 5 % CO2 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium som inneholder 15 % fosterbovint serum og 1 % penicillin-streptomycin.
- Bruk 2-3 plater for hver prøve. Utvid cellene til 100% samløp.
- Etter behandling beregnet, vask cellene to ganger med fosfatbufret saltvann. Deretter legger du til 10 ml fosfatbufret saltvann, skraper cellene og samler seg i et 15 ml rør.
- Sentrifugat ved 800 x g i 5 min og fjern supernatanten. Resuspend pellet i 1 ml ultrarenset deionisert vann ved 80 °C.
- Overfør innholdet i røret (cellulær lysat) til et 2 ml mikrofugerør.
- Dyrevev (hovedsakelig nervevev):
- Bedøv villtype mannlig voksen Danio rerio (sebrafisk) med en dødelig dose MS 222 (100 mg /L) og umiddelbart utsette den for 8 s mikrobølgestråling for å inaktivere peptidase og protease.
MERK: En mikrobølgeovn av husholdningstype kan brukes. En 900 W mikrobølgeovn ble brukt i 8 til 10 s med full effekt. Mikrobølgeovnen som brukes må kunne øke hjernetemperaturen til > 80 °C innen 10 s. Reproduserbarhet i oppvarming mellom prøver vil også være til nytte ved å plassere vevet på samme sted i mikrobølgeovnen. - Etter varmeinaktivering, samle hele hjernen i et 2 ml mikrofugerør og frys ved -80 °C til analyse.
- Resuspend vevsprøven i 1 ml ultrarenset deionisert vann ved 80 °C. Soniker vevet med en sonde ved hjelp av 30 pulser (4 Hz) på 1 s.
MERKNADER: For lever- og nyrevev, bruk en mekanisk homogenisator ved 10.000-30.000 rpm i 20 s. For muskelvev, slip vevet i flytende nitrogen ved hjelp av en porselen digel og pestle. Følgende trinn er de samme for cellulær lysat eller homogenatvev.
- Bedøv villtype mannlig voksen Danio rerio (sebrafisk) med en dødelig dose MS 222 (100 mg /L) og umiddelbart utsette den for 8 s mikrobølgestråling for å inaktivere peptidase og protease.
- Inkuber det cellulære lysat- eller homogenatvevet ved 80 °C i 20 minutter. Deretter kjøler du den ned på is i 10-30 min.
- Tilsett 10 μL 1 M HCl lagerløsning for hver 1 ml prøvevolum for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 mM. Bland med virvel i 20 s og inkuber videre på is i 15 min.
MERK: Før forsuring må prøven avkjøles helt for å unngå å bryte peptidbindingene forårsaket av forsuring ved forhøyede temperaturer. - Sentrifuger det cellulære lysatet eller homogenatvevet ved 12 000 x g ved 4 °C i 15 minutter. Samle supernatanten i mikrosenterrør med lavt bindende protein og oppbevar det ved -80 °C.
- Rengjør ultrafiltreringsanordningene (10 kDa avkuttede filtre) ved å tilsette vann og sentrifuge ved 2300 x g i 3 minutter. Gjenta dette trinnet to ganger til.
- Plasser supernatanten i de forhåndsvaskede 10 kDa avkuttede filtrene og sentrifugen ved 2300 x g ved 4 °C i 50 minutter i en oppusset sentrifuge. Gjennomstrømningen representerer peptidekstraktet.
- Avsalt prøvene på omvendt fase opprydding kolonner i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av acetonitril (ACN) og trifluoroacetic acid (TFA) løsninger som beskrevet nedenfor:
- Likevekt kolonnen med 1 ml 100 % ACN.
- Vask kolonnen med 1 ml oppløsning på 5% ACN med 0,1% TFA.
- Last inn hele volumet for eksemplet i kolonnen.
- Vask kolonnen med 1 ml oppløsning på 5% ACN med 0,1% TFA
- Elute peptidene fra kolonnen med en 1,8 ml løsning på 100% ACN med 0,15% TFA i protein lavt bindende mikrosenter.
- Tørk prøven helt i en vakuumsentrifuge. Still inn konsentrasjonsmetoden for organiske løsningsmidler og temperatur ved 30 °C. Konsentrasjonstiden overvåkes på displayet.
- Oppbevar prøvene ved −80 °C til neste trinn.
2. Peptid kvantifisering med fluorescamin
MERK: Mengden peptid kan estimeres ved hjelp av fluorescamin ved pH 6.8 som tidligere beskrevet11,28. Denne metoden består av vedlegg av et fluorescaminmolekyl til de primære aminene som er tilstede i lysin (K) rester og / eller N-terminalen av peptider. Reaksjonen utføres ved pH 6.8 for å garantere at fluorescaminet reagerer bare med aminogruppene i peptidene og ikke med frie aminosyrer. Fluorescamine måles ved hjelp av et spektrofluorometer ved en eksitasjonsbølgelengde på 370 nm og en utslippsbølgelengde på 480 nm.
- Forbered forskjellige konsentrasjoner av standard peptid (0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,5 og 0,7 μg/μL) og oppbevar aliquots ved -20 °C.
MERK: Peptid 5A (LTLRTKL) foreslås siden det har en kjent sammensetning og konsentrasjon. - Klargjør fluorescamin lageroppløsning (0,3 mg/ml) i aceton. Aliquot raskt i mikrocentrifuge rør (1 ml), forsegle ved hjelp av parafilm, og lagre ved -20 °C i mørket.
- Klargjør 0,2 M Fosfatbuffer (PB) ved pH 6,8.
MERK: Forbered 0,2 M PB ved å tilsette 0,1 M fosfatbuffer pH 6,8 (26,85 ml Na2HPO3 1M) og 0,1 M fosfatbuffer pH 6,8 (23,15 ml NaH2PO3 1M) til 250 ml vann - Resuspend peptidprøvene i 100-200 μL ultrarenset vann.
- Pipette 2,5 μL av standard peptidkonsentrasjoner og prøver på den hvite 96-brønnsplaten for fluorescensanalyser i triplikat. Tilsett 25 μL 0,2 M fosfatbuffer.
- Tilsett 12,5 μL fluorescamin med en flerkanals pipette. Homogeniser forsiktig i 1 min på orbital rotator shaker.
- Deretter tilsetter du 110 μL vann med en flerkanals pipette for å stoppe reaksjonen.
MERK: Overfør fluorescaminbestandsløsningen og ultrarent vann til to reservoarer for å pipette disse løsningene med en flerkanals pipette. - Juster følgende leseparametere på spektrofluorometeret: Les prøvene fra toppen, eksitasjonsbølgelengden ved 370 nm og utslippsbølgelengde ved 480 nm.
- Les platen på spektrofluorometeret.
3. Reduktiv metylering av aminer merking
MERK: Denne isotopiske merkingsmetoden er basert på dimetylering av amingrupper med deutererte og ikke-deuterte former for formaldehyd- og natriumcyoborohydridreagenser. Det endelige produktet av denne reaksjonen legger til 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da eller 36 Da til den endelige massen av hvert peptid på hvert tilgjengelige merkested (lysin eller N-terminal). Denne reaksjonen gir en m/z-forskjell i peptidene merket med ulike former observert i MS-spekteret (tabell 1).
FORSIKTIG: Riktig sikkerhetsutstyr bør brukes til å håndtere disse forbindelsene, og det må utvises forsiktighet for å minimere eksponeringen. Prosedyrer med formaldehyd og natriumcyoborohydridreagenser bør utføres i en avtrekkshette fordi de er svært giftige (inkludert veiing av natriumcyaniborohydrid). Under slukkereaksjonen og forsuringen kan det genereres en giftig gass (hydrogencyanid).
- Forbered følgende friske løsninger fra lageret eller reagensene på prosedyrens dag i ultrarent vann:
- Fortynn lageret på 37% Formaldehyd (CH2O) til 4%.
- Fortynn lageret på 20% Formaldehyd Deuterated (CD2O) til 4%.
- Fortynn lageret på 20 % deutert C13 Formaldehyd (13CD2O) til 4 %.
- Forbered 0,6 m nabh3cn.
- Forbered 0,6 m nabd3cn.
- Forbered en løsning på 1% Ammonium bikarbonat.
- Forbered en løsning 5% maursyre.
MERK: Når det gjelder relativ kvantgering av peptider, da forskjellige eksperimentelle ordninger kan utføres avhengig av antall etiketter som brukes, er det nødvendig med oppmerksomhet under den kjemiske merkingsprosedyren. Det anbefales å skille små aliquots av etikettene i separate stativer med de respektive prøvene som skal merkes for å redusere potensialet for menneskelig feil ved å legge til feil reagens til prøverørene.
- Forbered hver prøve som inneholder opptil 25 μg av peptidet. Prøver må ikke inneholde Tris eller Ammonium Bikarbonat.
MERK: Mengdene beskrevet nedenfor er tilstrekkelige for hver prøve i et volum på 100 μL.
Fortsett med trinn 3.3-3.8 i en avtrekkshette. - Tilsett 1/10. volum 1 M TEAB i prøvene (sluttkonsentrasjon av oppløsningen 100 mM TEAB). Kontroller pH med et pH-indikatorpapir; Den må være mellom 5 og 8. Juster med HCl eller NaOH om nødvendig.
- Tilsett 4 μL ikke-deutert, deutert Formaldehyd eller C13 deuterated Formaldehyd i henhold til den etablerte merkingsordningen. Bland i 5 s ved virveling.
- Tilsett 4 μL NaBH3CN (0,6 M) eller NaBD3CN (0,6 M) i henhold til det etablerte merkeskjemaet. Bland i 5 s ved virveling.
- Inkuber i en avtrekkshette i 2 timer ved romtemperatur, bland hvert 30.
- Gjenta trinn 3.4 og 3.5. Inkuber prøvene i en avtrekkshette over natten ved romtemperatur.
- Tilsett 16 μL ammoniumbikarbonat (1 %) og bland ved virveling. Legg prøven på is, tilsett 8 μL maursyre (5%), og bland med virvel i 5 s.
- Kombiner prøvene, juster pH til 2-4 og avsalt de kombinerte prøvene på omvendt faseoppryddingskolonner som tidligere beskrevet i trinn 1.8.
- Tørk prøven helt i en vakuumsentrifuge. Still inn konsentrasjonsmetoden for organiske løsningsmidler og temperatur ved 30 °C. Konsentrasjonstiden overvåkes på displayet.
- Oppbevar prøvene ved -20 °C.
4. Flytende kromatografi og massespektrometri
- Utfør LC-MS-analyse ved hjelp av et nanoHPLC-system koblet til et MS-instrument som er kompatibelt med metylkoder.
MERK: En rekke MS-instrumenter er kompatible med RMA-merking. Et nanoHPLC-system koblet til Orbitrap brukes vanligvis til å utføre LC-MS-analyse gjennom en nanoelektrosprayionkilde. For det første lastes prøven inn i en precolumn og peptider separert i en analytisk kolonne. Elution av peptider utføres ved hjelp av en lineær gradient på 5%-45% acetonitril, i 0,1% maursyre, i løpet av 90 min, med en strøm på 200 nL / min. Massespektrometeret er satt til å fungere i dataavhengig modus. Hver full skanning er anskaffet med en intensitet på 10-30 eV, 2.3 Kv, og deretter velges de ti høyeste toppene for kollisjonsindusert dissosiasjon (CID) fragmentering. Injeksjonstiden er satt på ionfellen på 100 ms, og Fourier Transform (FT)-MS-injeksjonen er festet med en oppløsning på 1000 ms 30 000 ved m/z 300-1800. Minimum 5000 tellinger og en dynamisk utelukkelse på 70 s brukes til å utføre fragmenteringsskanning.
5. Relativ kvantasjon av peptider
MERK: MS-spektraet analyseres i massespektrometerprogramvaren. Toppgrupper av merkede peptider med forskjellige koder identifiseres i MS-spektraet. Den relative kvantasjonen beregnes av intensiteten til hver monoisotopiske topp. Hver behandlede gruppe sammenlignes med den respektive kontrollgruppen.
- Høyreklikk på raw-eksempelfilen for å åpne spektrumanalyseprogramvaren. Last inn oppbevaringstiden (RT) og MS-spektrumet (EM) kromatogrammer i henholdsvis to kategorier, topp og bunn.
- Høyreklikk én gang sekvensielt på skjerm - og massealternativikonene på programvareverktøylinjen, og sett massepresisjonen til fire desimaler.
- Plasser musepekeren hvor som helst i kategorien RT . Se etter oppbevaringstiden for den tilsvarende ionen som skal analyseres, og klikk på høyre museknapp. MS-spekteret for det valgte tidspunktet vises automatisk i EM-kategorien.
- Plasser musepekeren hvor som helst i EM-fanen. Se etter ionene som skal analyseres.
- Høyreklikk og hold i et tilstøtende område til venstre i nærheten av disse ionene. Deretter drar du musen til høyre i ønsket område for å zoome området av interesse.
- Hold musen plassert på EM-fanen og klikk på høyre eller venstre tastaturpiler for å definere rekkevidden av ioner som skal analyseres.
- Plasser musepekeren på RT-fanen igjen i begynnelsen av ønsket tidsintervall.
- Høyreklikk og dra musen til den valgte tidsverdien. La knappen være. Den akkumulerte intensiteten til ionene vises automatisk i EM-fanen.
- Samle dataene for m/z-, z- og ion-intensitet i et regneark.
MERK: Den monoisopiske massen av hvert peptid uten tilsatte metylgrupper beregnes ut fra følgende formel:
Masse umodifisert peptid = (m/z a x z) - (C a x T) - (1,008 x z)
m/zais den observerte massen for å lade verdi for den monoisotopiske toppen for hvert peptid merket med forskjellige kombinasjoner av tagger (en =1, 2, 3, 4 eller 5, tilsvarende prøvenummeret).
z er ladetilstand.
Ca er den monoisopiske massen av et par metylgrupper:
For a=1, Ca = 28,0313 (netto tilsetning av to CH3-grupper til primæramin)
For a=2, Ca = 30,0439 for to CHD2-grupper
For a=3, Ca = 32,0564 for to CD2H-grupper
For a=4, Ca= 34,0690 for to CD3-grupper
For a=5, Ca = 36,0757 for to 13 CD3-grupper
T er antall par metylgrupper innlemmet i peptidet. Dette kan beregnes ut fra følgende formel når fem koder brukes: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. For peptider som inneholder et enkelt primært amin og derfor er merket med bare to metylgrupper til stede toppoverlappinger på MS-spektra når tilstøtende etiketter brukes. Toppintensiteten til hvert merket peptid kan korrigeres ved hjelp av ligningene beskrevet av Tashima og Fricker25.
6. Identifikasjon av peptid
- Hvis du vil identifisere peptider, analyserer du MS/MS-dataene ved hjelp av en databasesøkemotor29,30.
- Hvis du vil beregne den falske søkehastigheten (FDR) ved hjelp av fusjonsmetoden decoy , søker du i en lokkedatabase.
MERK: Søkeparametrene som vanligvis brukes er ingen enzymspesifikk; forløper massetoleranse satt 15-50 ppm; fragment ion masse toleranse på 0,5 Da; variable modifikasjoner: reaktive aminer fra Lysrester og N-terminus av peptidene isotopiske metylerte etiketter (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+3 L4 (+34) og L5 (+36)), oksidert metionin (+15,99 Da) og acetylering (+42,01 Da). - Deretter sorterer du peptidene etter gjennomsnittet av lokal tillit for å velge det beste spektraet for å kommentere og filtrere dem etter FDR-≤5%.
Figur 1: Arbeidsflyt for peptidomiske studier. Trinn for peptidutvinning og reduktiv metylering av aminer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene oppnådd fra kjøringene som utføres på massespektrometeret, lagres i rådatafiler som kan åpnes i massespektrometerprogramvaren. I MS-spektra er det mulig å observere toppgrupper som representerer merkede peptider i henhold til merkeskjemaet som brukes, alt fra 2-5 etiketter. I figur 2 er for eksempel par med topper som oppdages i en kromatografisk tid, representert i et eksperiment der bare to isotopiske etiketter ble brukt i to forskjellige prøver i samme kjøring. Figur 3 viser andre muligheter for positive resultater ved å bruke 3 og 4 forskjellige etiketter i hver LC-MS-kjøring. Når du bruker 4 eller 5 etiketter i en LC/MS-kjøring, kan det være en overlapping av toppene i de merkede peptidene med de forskjellige kodene som må korrigeres for å oppnå den reelle intensitetsverdien for hver topp (figur 4).
Den isotopiske merkingen kan også brukes til å vise substrater og produkter in vitro for en gitt protease eller peptidase, som vist i figur 5. Til slutt kan forskjellig programvare brukes til å identifisere de merkede peptidene, for eksempel Peaks Studio eller MASCOT. Disse programmene ble opprettet for proteomisk analyse; Derfor bør proteinmengdedataene ikke vurderes for peptidomikkanalyse, og hvert merket peptid identifisert innenfor pålitelighetsparametrene må kontrolleres og deretter kvantifiseres. Hvis peptidene har blitt oppdaget og merket, vil disse programmene gi en liste over identifiserte peptidsekvenser som inneholder etikettene. Figur 6 vises som et eksempel på identifikasjonen av en peptidsekvens utført av programmet. I dette tilfellet ble bare 3 forskjellige former for etikettene (L1, L3 og L5) brukt til å merke tre forskjellige prøver separat, som deretter ble blandet og analysert av massespektrometri i en enkelt kjøring.
Figur 2: MS-spektrumrepresentant for en kromatografisk tid akkumulert i et typisk merkingseksperiment ved hjelp av reduktiv dimetylering av aminer. I (A) angir de røde pilene tilstedeværelsen av topppar av forskjellige peptider merket med 2 isotopiske former (L1 og L5) for sammenligning mellom to forskjellige prøver (S1 og S2). I (B) viser et forstørret bilde av et MS-spektrum av samme peptid forskjellig m/z på grunn av bruk av etiketter. I dette tilfellet var det ingen variasjon i toppintensiteten for dette peptidet som finnes i disse prøvene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt MS-spekter av merkede peptider med reduktiv metylering av aminer ved hjelp av forskjellig antall tagger. (A) En triplex-merking ble brukt. Det er mulig å observere et MS-spekter av et peptid til stede i 3 forskjellige prøver (S1, S2 og S3) merket med henholdsvis L1-, L3- og L5-koder. I dette tilfellet ble nivået på det merkede peptidet med L5 dobbelt så høyt som observert for samme peptid merket med L1- og L3-koder. (B) En quadripex-merking ble utført ved hjelp av L1-, L2-, L3- og L4-etikettene. I dette tilfellet ble kontrollprøver (S1 og S3) merket med henholdsvis L1 og L3, og sammenlignet med to eksperimentelle prøver (S2 og S4) merket med L2- og L4-etiketter. Det ble ikke observert signifikante forskjeller for dette peptidet mellom prøvene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativt MS-spekter av et merket peptid som presenterer en toppoverlapping. Denne figuren viser MS-spekteret av et peptid med kostnad 3, masse av 2098.87 Da med en enkelt primær amin tilgjengelig for merking. Forskjellen mellom de merkede peptidene er bare 2 Da, noe som forårsaker overlapping når 4 eller 5 etiketter brukes i samme LC / MS-kjøring. Ved hjelp av en modell basert på kubiske polynomligninger er det mulig å korrigere disse overlappingene mellom etikettene. I grafen viser de røde stolpene gjennomsnittet av intensitetsverdiene justert for dette peptidet i to løp. De svarte stolpene viser gjennomsnittet av verdiene for overlappende intensitet. Etter korreksjon viste dette peptidet liten variasjon i intensitet mellom prøver (røde stenger). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representativt MS-spekter av merkede peptider med reduktiv metylering av aminer i en proteolysestudie. Her ble peptidekstrakter inkubert med 200 nM og 20 nM nevrolysin for å karakterisere deres substrater og produkter. For bekreftelse av resultatet ble to LC/MS-kjøringer med Forward and Reverse-merkingsstrategier utført. I andre kjøring endres plasseringen av prøvene i etikettprosedyren i forhold til oppsettet som brukes i første kjøring. I A er det vist et peptid som ikke endres (NC) i nærvær av nevrolysinenzymet. I B, et peptid som forsvant i nærvær av en høy konsentrasjon av enzymet (S2) og som viste en liten reduksjon i den lave konsentrasjonen av enzymet (S4) i både fremover og omvendt merking. Dette peptidet regnes som et substrat (SB) av enzymet. I C et eksempel på et peptid som ble ansett som et produkt (PD), fordi konsentrasjonen ble økt (S2 og S4) i nærvær av enzymet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representativt MSMS-spektrum og identifisering av et merket peptid utført av en databasesøkemotor. I dette eksemplet er det mulig å observere 2+ ioner med m/z 672 3802, 676 4045 og 680 4241 tilsvarende et peptid av samme masse merket med henholdsvis L1-, L3- og L5-metylerte former. Denne sekvensen ADQVSASLAKQGL ble identifisert gjennom MS/MS-spekteret som et fragment av det mikrotubule-assosierte proteinet tau isoform X1. Dette peptidet har N-terminalen og en lysin tilgjengelig som merkingssteder som legger til en masseforskjell på 8 Daltons mellom de merkede peptidene. MS-spekteret til dette peptidet er vist i figur 3A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Eksempel | H2CO | D2CO | D213CO | NaBH3CN | NaBD3CN | Etikett | Ekstra masse |
| 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | kode | (Da) | |
| 1 | X | X | L1 | 28.0313 | |||
| 2 | X | X | L2 | 30.0439 | |||
| 3 | X | X | L3 | 32.0564 | |||
| 4 | X | X | L4 | 34.069 | |||
| 5 | X | X | L5 | 36.0757 |
Tabell 1: Reagenser av et typisk eksperiment ved hjelp av den angitte kombinasjonen av deutererte og ikke-deuterte former for formaldehyd og natriumcyoborohydrid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de fleste peptidomikkstudier er et av de kritiske trinnene uten tvil prøvepreparatet som bør utføres nøye for å unngå tilstedeværelse av peptidfragmenter generert av proteaser etter noen minutter etter mortem. De første studiene på hjerneekstrakter utarbeidet fra ikke-mikrobølgede prøver viste et stort antall proteinfragmenter som skulle være til stede i mikrofiltreringene på 10 kDa. Ulike tilnærminger har blitt beskrevet for å unngå peptidspektra fra proteinforringelse: fokusert mikrobølgebestråling dyr offer6,8, kryostat disseksjon etterfulgt av en kokende ekstraksjon buffer31, og post-offer mikrobølgeovn-bestråling av vev ved hjelp av en husholdningstype mikrobølgeovn9,26 . For cellekultur og noen vev kan proteaseinaktivering gjøres direkte ved å tilsette vann ved 80 °C. Noen prøver, for eksempel nervevev, kan imidlertid være mer følsomme for endring etter mortem, og protease inaktivering ved mikrobølgebestråling har blitt indikert som en valgmetode. Videre er et annet viktig punkt under peptidutvinningen å sørge for at ekstrakter er iskalde før du tilsetter syre for å forhindre at syre-labile bindinger bryter, som spalting av Asp-Pro-bindinger26.
Ulike strategier kan brukes til relativ kvantifisering av peptider, men ingen av dem kan betraktes som helt ideelle. For å velge metoden som skal brukes, må forskeren vurdere faktorer som tilgjengelighet av brukstimer i massespektrometeret, kommersielt tilgjengelige og kostnader ved merking av reagenser, og lette å analysere dataene som er oppnådd17,25,26,32. Den etikettfrie metoden har blitt mye brukt, men krever mange timer i massespektrometeret. Det er nødvendig å injisere tekniske replikeringer for hver prøve og avhenger av kromatografisk reproduserbarhet blant prøvene. Andre kjemiske merking reagenser, for eksempel ITRAQ (isobariske koder for relativ og absolutt kvantasjon) og TMT (tandemmasse tag), er dyre og gir bare kvantasjon av peptider valgt for MS / MS analyse25,33,34.
Den største begrensningen for relativ kvantifisering gjennom kjemisk merking ved hjelp av RMA er overlappingen som oppstår for noen peptider når du utfører en protokoll ved hjelp av 4 eller 5 etiketter på samme løp, noe som resulterer i masseforskjeller på 2 Da for peptider med en enkelt primær amin og 1 Da for peptider med N-terminus proline og ingen interne lysinrester. Tashima og Fricker (2018) utviklet imidlertid en modell for å korrigere isotopisk overlapping basert på kubiske polynomligninger25, som får riktig intensitet av de merkede peptidene i prøvene. Videre kan ikke alle peptider ses av RMA. For eksempel mangler noen peptider en N-terminalfri amin på grunn av acetylering, pyroglutamylering eller en annen modifikasjon. Hvis interne lysiner også er fraværende i disse peptidene, vil de ikke bli merket av RMA-reagenset og vil vises på m / z-spektraet som uoverkommelige enkelttopper27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finnes ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Utviklingen og bruken av teknikkene beskrevet her ble støttet av Det brasilianske nasjonale forskningsrådets tilskudd 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) tilskudd 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) og 21/01286-1 (MEME). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeidelse av artikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid - HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer - TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid - TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J.
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A.
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E.
- Baggerman, G., et al.
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L.
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross,, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
