Summary
Este artículo describe un método de preparación de muestras basado en la inactivación por calor para preservar los péptidos endógenos evitando la degradación post mortem, seguido de una cuantificación relativa utilizando el etiquetado isotópico más LC-MS.
Abstract
La peptidómica se puede definir como el análisis cualitativo y cuantitativo de péptidos en una muestra biológica. Sus principales aplicaciones incluyen la identificación de los biomarcadores peptídicos de la enfermedad o el estrés ambiental, la identificación de neuropéptidos, hormonas y péptidos intracelulares bioactivos, el descubrimiento de péptidos antimicrobianos y nutracéuticos a partir de hidrolizados de proteínas, y se puede utilizar en estudios para comprender los procesos proteolíticos. El reciente avance en la preparación de muestras, métodos de separación, técnicas de espectrometría de masas y herramientas computacionales relacionadas con la secuenciación de proteínas ha contribuido al aumento del número de péptidos identificados y peptidos caracterizados. Los estudios peptidómicos analizan con frecuencia péptidos que se generan naturalmente en las células. Aquí, se describe un protocolo de preparación de muestras basado en la inactivación por calor, que elimina la actividad de la proteasa, y la extracción con condiciones suaves, por lo que no hay escisión de enlaces peptídicos. Además, también se muestra la cuantificación relativa de péptidos utilizando el etiquetado de isótopos estables por metilación reductiva de aminas. Este método de etiquetado tiene algunas ventajas ya que los reactivos están disponibles comercialmente, son baratos en comparación con otros, químicamente estables y permiten el análisis de hasta cinco muestras en una sola ejecución LC-MS.
Introduction
Las ciencias "ómicas" se caracterizan por el análisis profundo de un conjunto de moléculas, como ADN, ARN, proteínas, péptidos, metabolitos, etc. Estos conjuntos de datos generados a gran escala (genómica, transcriptómica, proteómica, peptidómica, metabolómica, etc.) han revolucionado la biología y han llevado a una comprensión avanzada de los procesos biológicos1. El término peptidómica comenzó a introducirse a principios del siglo 20, y algunos autores se han referido a él como una rama de la proteómica2. Sin embargo, la peptidómica tiene distintas particularidades, donde el interés principal es investigar el contenido de péptidos generados naturalmente durante los procesos celulares, así como la caracterización de la actividad biológica de estas moléculas3,4.
Inicialmente, los estudios de péptidos bioactivos se restringieron a los neuropéptidos y péptidos hormonales a través de la degradación de Edman y el radioinmunoensayo. Sin embargo, estas técnicas no permiten un análisis global, dependiendo del aislamiento de cada péptido en altas concentraciones, tiempo para la generación de anticuerpos, además de la posibilidad de reactividad cruzada5.
El análisis peptidómico solo fue posible después de varios avances en espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida (LC-MS) y proyectos de genoma que entregaron grupos de datos completos para estudios de proteómica / peptidómica6,7. Además, era necesario establecer un protocolo específico de extracción de péptidos para peptidomes porque los primeros estudios que analizaron neuropéptidos a nivel mundial en muestras cerebrales mostraron que la detección se vio afectada por la degradación masiva de proteínas, que ocurren principalmente en este tejido después de 1 min post mortem. La presencia de estos fragmentos peptídicos enmascaró la señal del neuropéptido y no representó el peptidomo in vivo. Este problema se resolvió principalmente con la aplicación de la inactivación por calentamiento rápido de proteasas mediante irradiación por microondas, lo que redujo drásticamente la presencia de estos fragmentos de artefactos y permitió no solo la identificación de fragmentos de neuropéptidos sino que reveló la presencia de un conjunto de péptidos a partir de proteínas citosólicas, mitocondriales y nucleares, diferentes de degradome6,8,9.
Estos procedimientos metodológicos permitieron una expansión del peptídomo más allá de los conocidos neuropéptidos, donde se han identificado cientos de péptidos intracelulares generados principalmente por la acción de proteasomas en levaduras10, pez cebra11, tejidos de roedores12 y células humanas13. Se ha demostrado ampliamente que decenas de estos péptidos intracelulares tienen actividades biológicas y farmacológicas14,15. Además, estos péptidos pueden ser utilizados como biomarcadores de la enfermedad y posiblemente tener importancia clínica, como se demuestra en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con aneurismas sacculares intracraneales16.
Actualmente, además de la identificación de secuencias peptídicas, es posible a través de la espectrometría de masas obtener datos de cuantificación absoluta y relativa. En la cuantificación absoluta, los niveles de péptidos en una muestra biológica se comparan con los estándares sintéticos, mientras que en la cuantificación relativa, los niveles de péptidos se comparan entre dos o más muestras17. La cuantificación relativa se puede realizar utilizando los siguientes enfoques: 1) "libre de etiquetas"18; 2) etiquetado metabólico in vivo o 3) etiquetado químico. Los dos últimos se basan en el uso de formas isotópicas estables incorporadas a péptidos19,20. En el análisis sin etiquetas, los niveles de péptidos se estiman considerando la intensidad de la señal (recuentos espectrales) durante el LC-MS18. Sin embargo, el etiquetado isotópico puede obtener niveles relativos más precisos de péptidos.
Muchos estudios peptidómicos utilizaron reactivos de etiquetado de butirato de trimetilamonio (TMAB) como etiquetado químico, y más recientemente, se ha utilizado la metilación reductiva de aminas (RMA) con formas deuteradas y no deuteradas de formaldehído y reactivos de cianoborohidruro de sodio11,21,22. Sin embargo, las etiquetas TMAB no están disponibles comercialmente, y el proceso de síntesis es muy laborioso. Por otro lado, en el RMA, los reactivos están disponibles comercialmente, son baratos en comparación con otras etiquetas, el procedimiento es simple de realizar y los péptidos etiquetados son estables23,24.
El uso de RMA implica la formación de una base de Schiff al permitir que los péptidos reaccionen con el formaldehído, seguido de una reacción de reducción a través del cianoborohidruro. Esta reacción provoca dimetilación de los grupos amino libres en las cadenas laterales N-terminales y lisina y monometilatos N-terminales prolinas. Como los residuos de prolina son a menudo raros en el N-terminal, prácticamente todos los péptidos con aminas libres en el N-terminal están marcados con dos grupos metilo23,24,25.
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Protocol
El siguiente procedimiento para la extracción de péptidos y la metilación reductiva se adaptó de procedimientos publicados anteriormente24,25,26,27. Este protocolo siguió los lineamientos del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA) y fue aprobado por la Comisión de Ética para el Uso Animal (CEUA) del Instituto de Biociencias de la Universidad Estatal de Sao Paulo. Los pasos del protocolo se muestran en la Figura 1.
NOTA: Prepare todas las soluciones acuosas en agua ultrapura.
1. Extracción de péptidos
- Cultivo celular
- Cultive células SHSY5Y en un plato de 15 cm a 37 °C bajo 5% de CO2 en el medio eagle modificado de Dulbecco que contiene 15% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina.
- Utilice 2-3 placas para cada muestra. Hacer crecer las células al 100% de confluencia.
- Después del tratamiento previsto, lave las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, agregue 10 ml de solución salina tamponada con fosfato, raspe las células y recoja en un tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 800 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 1 mL de agua desionizada ultrapurificada a 80 °C.
- Transfiera el contenido del tubo (lisado celular) a un tubo de microfuge de 2 ml.
- Tejidos animales (principalmente tejido nervioso):
- Anestesiar el macho salvaje adulto Danio rerio (pez cebra) con una dosis letal de MS 222 (100 mg/L) e inmediatamente someterlo a 8 s de radiación de microondas para inactivar la peptidasa y la proteasa.
NOTA: Se puede utilizar un horno microondas de tipo doméstico. Se utilizó un microondas de 900 W durante 8 a 10 s a plena potencia. El microondas utilizado debe ser capaz de elevar la temperatura del cerebro a > 80 ° C en 10 s. La reproducibilidad en el calentamiento entre muestras también se beneficiaría al colocar el tejido en la misma ubicación en el microondas. - Después de la inactivación por calor, recoja todo el cerebro en un tubo de microfuge de 2 ml y congele a -80 ° C hasta el análisis.
- Resuspend la muestra de tejido en 1 ml de agua desionizada ultrapurificada a 80 °C. Sonicar el tejido con una sonda utilizando 30 pulsos (4 Hz) de 1 s.
NOTAS: Para los tejidos hepáticos y renales, use un homogeneizador mecánico a 10,000-30,000 rpm durante 20 s. Para los tejidos musculares, muela el tejido en nitrógeno líquido usando un crisol de porcelana y un mortero. Los siguientes pasos son los mismos para el lisado celular o el tejido homogeneizado.
- Anestesiar el macho salvaje adulto Danio rerio (pez cebra) con una dosis letal de MS 222 (100 mg/L) e inmediatamente someterlo a 8 s de radiación de microondas para inactivar la peptidasa y la proteasa.
- Incubar el lisado celular u homogeneizar el tejido a 80 °C durante 20 min. A continuación, enfríelo en hielo durante 10-30 min.
- Añadir 10 μL de solución madre de HCl de 1 M por cada 1 mL de volumen de muestra para obtener una concentración final de 10 mM. Mezclar por vórtice durante 20 s e incubar aún más en hielo durante 15 min.
NOTA: Antes de acidificar, asegúrese de que la muestra esté completamente enfriada para evitar romper los enlaces peptídicos causados por la acidificación a temperaturas elevadas. - Centrifugar el lisado celular o el tejido homogeneizado a 12.000 x g a 4 °C durante 15 min. Recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de proteína de baja unión y almacenarlo a -80 °C.
- Limpie los dispositivos de ultrafiltración (filtros de corte de 10 kDa) añadiendo agua y centrífuga a 2300 x g durante 3 min. Repita este paso dos veces más.
- Coloque el sobrenadante en los filtros de corte de 10 kDa prelavados y centrífuga a 2.300 x g a 4 °C durante 50 min en una centrífuga refrigerada. El flujo a través representa el extracto peptídico.
- Desalar las muestras en columnas de limpieza de fase invertida de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando soluciones de acetonitrilo (ACN) y ácido trifluoroacético (TFA) como se describe a continuación:
- Equilibrar la columna con 1 mL de 100% ACN.
- Lave la columna con 1 ml de solución de ACN al 5% con TFA al 0,1%.
- Cargue el volumen completo de la muestra en la columna.
- Lavar la columna con 1 ml de solución de ACN al 5% con TFA al 0,1%
- Eluir los péptidos de la columna con una solución de 1,8 ml de ACN al 100% con AGT al 0,15% en tubos de microcentrífuga de baja unión proteica.
- Seque la muestra completamente en una centrífuga al vacío. Ajuste el método de concentración para disolventes orgánicos y la temperatura a 30 °C. El tiempo de concentración se monitorea en exhibición.
- Guarde las muestras a -80°C hasta el siguiente paso.
2. Cuantificación peptídica con fluorescamina
NOTA: La cantidad de péptido se puede estimar utilizando fluorescamina a pH 6.8 como se describió anteriormente11,28. Este método consiste en la unión de una molécula de fluorescamina a las aminas primarias presentes en los residuos de lisina (K) y/o el N-terminal de los péptidos. La reacción se realiza a pH 6.8 para garantizar que la fluorescamina reaccione solo con los grupos amino de los péptidos y no con aminoácidos libres. La fluorescamina se mide utilizando un espectrofluorómetro a una longitud de onda de excitación de 370 nm y una longitud de onda de emisión de 480 nm.
- Preparar diferentes concentraciones del péptido patrón (0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,5 y 0,7 μg/μL) y almacenar las alícuotas a -20 °C.
NOTA: El péptido 5A (LTLRTKL) se sugiere ya que tiene una composición y concentración conocidas. - Preparar la solución madre de fluorescamina (0,3 mg/ml) en acetona. Alícuota rápidamente en tubos de microcentrífuga (1 ml), selle con parafilm y almacene a -20 °C en la oscuridad.
- Preparar 0,2 M tampón de fosfato (PB) a pH 6,8.
NOTA: Prepare 0.2 M PB agregando 0.1 M tampón de fosfato pH 6.8 (26.85 mL de Na2HPO3 1M) y 0.1 M tampón de fosfato pH 6.8 (23.15 mL de NaH2PO3 1M) a 250 mL de agua - Resuspender las muestras de péptidos en 100-200 μL de agua ultrapurificada.
- Pipetear 2,5 μL de las concentraciones de péptidos estándar y muestras en la placa blanca de 96 pocillos para ensayos de fluorescencia por triplicado. Añadir 25 μL de tampón de fosfato de 0,2 M.
- Añadir 12,5 μL de fluorescamina con una pipeta multicanal. Homogeneizar suavemente durante 1 min en el agitador rotador orbital.
- A continuación, agregue 110 μL de agua con una pipeta multicanal para detener la reacción.
NOTA: Transfiera la solución madre de fluorescamina y el agua ultrapura a dos depósitos para pipetear estas soluciones con una pipeta multicanal. - Ajuste los siguientes parámetros de lectura en el espectrofluorómetro: Lea las muestras desde la parte superior, la longitud de onda de excitación a 370 nm y la longitud de onda de emisión a 480 nm.
- Lea la placa en el espectrofluorómetro.
3. Metilación reductiva del etiquetado de aminas
NOTA: Este método de etiquetado isotópico se basa en la dimetilación de grupos amina con formas deuteradas y no deuteradas de reactivos de formaldehído y cianoborohidruro de sodio. El producto final de esta reacción agrega 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da o 36 Da a la masa final de cada péptido en cada sitio de etiquetado disponible (lisina o N-terminal). Esta reacción produce una diferencia m/z en los péptidos marcados con diferentes formas observadas en el espectro MS (Tabla 1).
PRECAUCIÓN: Se debe usar el equipo de seguridad adecuado para manejar estos compuestos, y se debe tener cuidado para minimizar la exposición. Los procedimientos con reactivos de formaldehído y cianoborohidruro de sodio deben realizarse en una campana de humos porque son muy tóxicos (incluido el pesaje del cianoborohidruro de sodio). Durante la reacción de enfriamiento y acidificación, se puede generar un gas tóxico (cianuro de hidrógeno).
- Prepare las siguientes soluciones frescas del stock o reactivos el día del procedimiento en agua ultrapura:
- Diluir el stock de formaldehído al 37% (CH2O) al 4%.
- Diluir el stock de 20% de formaldehído deuterado (CD2O) al 4%.
- Diluir el stock de 20 % de formaldehído C13 deuterado (13CD2O) al 4 %.
- Preparar 0.6 M NaBH3CN.
- Preparar 0,6 m de NaBD3CN.
- Prepare una solución de bicarbonato de amonio al 1%.
- Preparar una solución al 5% de ácido fórmico.
NOTA: En cuanto a la cuantificación relativa de los péptidos, como se pueden realizar diferentes esquemas experimentales dependiendo del número de etiquetas utilizadas, es necesaria la atención durante el procedimiento de etiquetado químico. Se recomienda separar pequeñas alícuotas de las etiquetas en bastidores separados con las muestras respectivas que se etiquetarán para reducir el potencial de error humano al agregar el reactivo incorrecto a los tubos de muestra.
- Prepare cada muestra que contenga hasta 25 μg del péptido. Las muestras no deben contener Tris o Bicarbonato de Amonio.
NOTA: Las cantidades descritas a continuación son suficientes para cada muestra en un volumen de 100 μL.
Continúe con los pasos 3.3-3.8 en una campana de humos. - Añadir 1/10 de volumen de 1 M DE TEAB a las muestras (concentración final de la solución 100 mM de TEAB). Verifique el pH con un papel indicador de pH; debe estar entre 5-8. Ajuste con HCl o NaOH si es necesario.
- Añadir 4 μL de formaldehído no deuterado, deuterado o formaldehído deuterado C13 de acuerdo con el esquema de etiquetado establecido. Mezclar durante 5 s por vórtice.
- Añadir 4 μL de NaBH3CN (0,6 M) o NaBD3CN (0,6 M) según el esquema de etiquetado establecido. Mezclar durante 5 s por vórtice.
- Incubar en una campana extractora de humos durante 2 h a temperatura ambiente, mezclando cada 30 min.
- Repita los pasos 3.4 y 3.5. Incubar las muestras en una campana extractora de humos durante la noche a temperatura ambiente.
- Añadir 16 μL de bicarbonato de amonio (1%) y mezclar por vórtice. Coloque la muestra sobre hielo, agregue 8 μL de ácido fórmico (5%) y mezcle por vórtice durante 5 s.
- Combine las muestras, ajuste el pH a 2-4 y desalar las muestras combinadas en columnas de limpieza de fase invertida como se describió anteriormente en el paso 1.8.
- Seque la muestra completamente en una centrífuga al vacío. Ajuste el método de concentración para disolventes orgánicos y la temperatura a 30 °C. El tiempo de concentración se monitorea en exhibición.
- Conservar las muestras a -20 °C.
4. Cromatografía líquida y espectrometría de masas
- Realizar análisis LC-MS utilizando un sistema nanoHPLC acoplado a un instrumento MS compatible con etiquetas de metilo.
NOTA: Una variedad de instrumentos MS son compatibles con el etiquetado RMA. Un sistema nanoHPLC acoplado a Orbitrap se utiliza normalmente para realizar análisis LC-MS a través de una fuente de iones nanoelectrospray. Primero, la muestra se carga en una precolumna y los péptidos se separan en una columna analítica. La elución de péptidos se realiza mediante un gradiente lineal de 5%-45% de acetonitrilo, en ácido fórmico al 0,1%, durante 90 min, con un flujo de 200 nL/min. El espectrómetro de masas está configurado para funcionar en modo dependiente de datos. Cada escaneo completo se adquiere a una intensidad de 10-30 eV, 2.3 Kv, y luego se seleccionan los diez picos más altos para la fragmentación de disociación inducida por colisión (CID). El tiempo de inyección se establece en la trampa de iones a 100 ms, y la inyección de la transformada de Fourier (FT)-MS se fija con una resolución de 1000 ms 30,000 a m / z 300-1800. Se utiliza un mínimo de 5000 recuentos y una exclusión dinámica de 70 s para realizar el escaneo de fragmentación.
5. Cuantificación relativa de péptidos
NOTA: Los espectros MS se analizan en el software del espectrómetro de masas. Los grupos máximos de péptidos marcados con diferentes etiquetas se identifican en los espectros de EM. La cuantificación relativa se calcula por la intensidad de cada pico monoisotópico. Cada grupo tratado se compara con el grupo de control respectivo.
- Haga doble clic derecho en el archivo de muestra sin procesar para abrir el software de análisis de espectro. Cargue los cromatogramas de tiempo de retención (RT) y espectro MS (EM) en dos pestañas, superior e inferior, respectivamente.
- Haga clic con el botón derecho una vez secuencialmente en los iconos de opciones Pantalla y Masa en la barra de herramientas del software y establezca la precisión de masa en cuatro decimales.
- Coloque el cursor del ratón en cualquier lugar de la pestaña RT. Busque el tiempo de retención del ion correspondiente a analizar y haga clic con el botón derecho del ratón. El espectro MS de la hora seleccionada se mostrará automáticamente en la pestaña EM.
- Coloque el cursor del ratón en cualquier lugar de la pestaña EM. Busque los iones a analizar.
- Haga clic con el botón derecho y manténgalo presionado en una región adyacente a la izquierda cerca de estos iones. Luego, arrastre el mouse hacia la derecha en el rango deseado para ampliar la región de interés.
- Mantenga el mouse colocado en la pestaña EM y haga clic en las flechas del teclado derecha o izquierda para definir el rango de iones a analizar.
- Coloque el cursor del ratón en la pestaña RT de nuevo al principio del intervalo de tiempo deseado.
- Haga clic con el botón derecho y arrastre el ratón hasta el valor de tiempo elegido. Deja el botón. La intensidad acumulada de los iones se mostrará automáticamente en la pestaña EM.
- Recopile los datos de intensidad de m/z, z e iones en una hoja de cálculo.
NOTA: La masa monoisotópica de cada péptido sin grupos metilo añadidos se calcula a partir de la siguiente fórmula:
Masa peptídica no modificada = (m/z a x z) - (C a x T) - (1.008 x z)
m/zais la masa observada al valor de carga para el pico monoisotópico para cada péptido marcado con diferentes combinaciones de etiquetas (a =1, 2, 3, 4 o 5, correspondiente al número de muestra).
z es el estado de carga.
Ca es la masa monoisotópica de un par de grupos metilo:
Para a=1, Ca = 28.0313 (la adición neta de dos grupos CH3 a la amina primaria)
Para a=2, Ca = 30,0439 para dos grupos CHD2
Para a=3, Ca = 32,0564 para dos grupos CD2H
Para a=4, Ca= 34,0690 para dos grupos CD3
Para a=5, Ca = 36,0757 para dos grupos de 13 CD3
T es el número de pares de grupos metilo incorporados al péptido. Esto se puede calcular a partir de la siguiente fórmula cuando se utilizan cinco etiquetas: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. Para los péptidos que contienen una sola amina primaria y, por lo tanto, están marcados con solo dos grupos metilo, presentan superposiciones máximas en los espectros de MS cuando se utilizan etiquetas adyacentes. La intensidad máxima de cada péptido marcado se puede corregir utilizando las ecuaciones descritas por Tashima y Fricker25.
6. Identificación de péptidos
- Para identificar péptidos, analice los datos de MS/MS utilizando un motor de búsqueda de base de datos29,30.
- Para calcular la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando el método de fusión señuelo, busque en una base de datos señuelo.
NOTA: Los parámetros de búsqueda generalmente utilizados no son especificidad enzimática; conjunto de tolerancia de masa del precursor 15-50 ppm; tolerancia de masa de iones fragmentos de 0,5 Da; modificaciones variables: aminas reactivas a partir de residuos de Lys y N-terminal de las etiquetas metiladas isotópicas de péptidos (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) y L5 (+36)), metionina oxidada (+15,99 Da) y acetilación (+42,01 Da). - Luego, ordene los péptidos por su promedio de confianza local para seleccionar los mejores espectros para anotarlos y filtrarlos por FDR ≤5%.
Figura 1: Flujo de trabajo de estudios peptidómicos. Pasos de extracción de péptidos y metilación reductiva de aminas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Los resultados obtenidos de las ejecuciones realizadas en el espectrómetro de masas se almacenan en archivos de datos sin procesar que se pueden abrir en el software del espectrómetro de masas. En los espectros MS, es posible observar grupos máximos que representan péptidos marcados de acuerdo con el esquema de etiquetado utilizado, que van desde 2-5 etiquetas. Por ejemplo, en la Figura 2, los pares de picos detectados en un tiempo cromatográfico se representan en un experimento en el que solo se utilizaron dos etiquetas isotópicas en dos muestras diferentes en la misma ejecución. La Figura 3 muestra otras posibilidades de resultados positivos, utilizando 3 y 4 etiquetas diferentes en cada ejecución de LC-MS. Cuando se utilizan 4 o 5 etiquetas en una ejecución LC/MS, puede haber una superposición de picos de los péptidos marcados con las diferentes etiquetas que deben corregirse para obtener el valor de intensidad real de cada pico (Figura 4).
El etiquetado isotópico también se puede utilizar para mostrar sustratos y productos in vitro para una proteasa o peptidasa dada, como se muestra en la Figura 5. Finalmente, se pueden utilizar diferentes softwares para identificar los péptidos etiquetados, como Peaks Studio o MASCOT. Estas aplicaciones de software fueron creadas para el análisis proteómico; por lo tanto, los datos de cuantificación de proteínas no deben considerarse para el análisis peptidómico, y cada péptido marcado identificado dentro de los parámetros de confiabilidad debe verificarse y luego cuantificarse. Si los péptidos se han detectado y etiquetado con éxito, estos programas proporcionarán una lista de secuencias de péptidos identificadas que contienen las etiquetas. En la Figura 6 se muestra un ejemplo de la identificación de una secuencia peptídica realizada por el programa. En este caso, solo se utilizaron 3 formas diferentes de etiquetas (L1, L3 y L5) para etiquetar tres muestras diferentes por separado, que luego se mezclaron y analizaron mediante espectrometría de masas en una sola tirada.
Figura 2: Espectro MS representativo de un tiempo cromatográfico acumulado en un experimento típico de etiquetado utilizando dimetilación reductiva de aminas. En (A), las flechas rojas indican la presencia de pares máximos de diferentes péptidos marcados con 2 formas isotópicas (L1 y L5) para la comparación entre dos muestras diferentes (S1 y S2). En (B), una imagen ampliada de un espectro de EM del mismo péptido que muestra diferente m / z debido al uso de etiquetas. En este caso, no hubo variación en la intensidad máxima de este péptido presente en estas muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Espectro MS representativo de péptidos marcados con metilación reductiva de aminas utilizando diferentes números de etiquetas. (A) Se utilizó un etiquetado triplex. Es posible observar un espectro MS de un péptido presente en 3 muestras diferentes (S1, S2 y S3) marcadas con etiquetas L1, L3 y L5, respectivamente. En este caso, el nivel del péptido marcado con L5 fue el doble del nivel observado para el mismo péptido marcado con etiquetas L1 y L3. (B) Se realizó un etiquetado quadripex utilizando las etiquetas L1, L2, L3 y L4. En este caso, las muestras de control (S1 y S3) se etiquetaron con L1 y L3, respectivamente, y se compararon con dos muestras experimentales (S2 y S4) etiquetadas con etiquetas L2 y L4. No se observaron diferencias significativas para este péptido entre las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Espectro representativo de EM de un péptido marcado que presenta una superposición máxima. Esta figura muestra el espectro MS de un péptido de carga 3, masa de 2098.87 Da con una sola amina primaria disponible para etiquetado. La diferencia entre los péptidos etiquetados es de solo 2 Da, causando una superposición cuando se usan 4 o 5 etiquetas en la misma ejecución LC / MS. Usando un modelo basado en ecuaciones polinómicas cúbicas, es posible corregir estas superposiciones entre las etiquetas. En el gráfico, las barras rojas muestran el promedio de los valores de intensidad ajustados para este péptido en dos tiradas. Las barras negras muestran el promedio de los valores de intensidad superpuestos. Después de la corrección, este péptido mostró poca variación en la intensidad entre las muestras (barras rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Espectro representativo de MS de péptidos marcados con metilación reductiva de aminas en un estudio de proteólisis. Aquí, los extractos de péptidos se incubaron con neurolisina de 200 nM y 20 nM para caracterizar sus sustratos y productos. Para la confirmación del resultado, se realizaron dos ejecuciones LC/MS con estrategias de etiquetado Forward y Reverse. En la segunda tirada, la posición de las muestras se cambia en el procedimiento de etiquetado en relación con el esquema utilizado en la primera tirada. En A, se muestra un péptido que no cambia (NC) en presencia de la enzima neurolisina. En B, un péptido que desapareció en presencia de una alta concentración de la enzima (S2) y que mostró una pequeña reducción en la baja concentración de la enzima (S4) tanto en el etiquetado hacia adelante como hacia atrás. Este péptido se considera un sustrato (SB) de la enzima. En C un ejemplo de un péptido que se consideraba un producto (PD), porque su concentración se incrementó (S2 y S4) en presencia de la enzima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Espectro representativo de MSMS e identificación de un péptido etiquetado realizado por un motor de búsqueda de base de datos. En este ejemplo, es posible observar 2+ iones con m/z 672,3802, 676,4045 y 680,4241 correspondientes a un péptido de la misma masa marcado con las formas metiladas L1, L3 y L5, respectivamente. Esta secuencia ADQVSASLAKQGL fue identificada a través del espectro MS/MS como un fragmento de la isoforma X1 de la proteína tau asociada a microtúbulos. Este péptido tiene el N-terminal y una lisina disponibles como sitios de etiquetado agregando una diferencia de masa de 8 Daltons entre los péptidos etiquetados. El espectro de EM de este péptido se muestra en la Figura 3A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | H2CO | D2CO | D213CO | NaBH3CN | NaBD3CN | Etiqueta | Misa adicional |
| 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | código | (Da) | |
| 1 | X | X | L1 | 28.0313 | |||
| 2 | X | X | L2 | 30.0439 | |||
| 3 | X | X | L3 | 32.0564 | |||
| 4 | X | X | L4 | 34.069 | |||
| 5 | X | X | L5 | 36.0757 |
Tabla 1: Reactivos de un experimento típico utilizando la combinación indicada de formas deuteradas y no deuteradas de formaldehído y cianoborohidruro de sodio.
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Discussion
En la mayoría de los estudios de peptidómica, uno de los pasos críticos es, sin duda, la preparación de la muestra que debe realizarse cuidadosamente para evitar la presencia de fragmentos peptídicos generados por las proteasas después de unos minutos post mortem. Los estudios iniciales sobre extractos cerebrales preparados a partir de muestras no microondas mostraron un gran número de fragmentos de proteínas presentes en los microfiltratos de 10 kDa. Se han descrito diferentes enfoques para evitar espectros peptídicos de la degradación de proteínas: irradiación focalizada por microondas sacrificio animal6,8, disección criostato seguida de un tampón de extracción en ebullición31 e irradiación de tejidos por microondas post-sacrificio utilizando un horno de microondas tipo doméstico9,26 . Para el cultivo celular y algunos tejidos, la inactivación de la proteasa se puede hacer directamente agregando agua a 80 °C. Sin embargo, algunas muestras, como el tejido nervioso, pueden ser más sensibles al cambio post mortem, y la inactivación de la proteasa por irradiación de microondas se ha indicado como método de elección. Además, otro punto importante durante la extracción de péptidos es asegurarse de que los extractos estén helados antes de agregar ácido para evitar que los enlaces ácido-lábil se rompan, como la escisión de los enlaces Asp-Pro26.
Se pueden utilizar diferentes estrategias para la cuantificación relativa de péptidos, pero ninguna de ellas puede considerarse completamente ideal. Para elegir el método a utilizar, el investigador debe considerar factores como la disponibilidad de horas de uso en el espectrómetro de masas, la disponibilidad comercial y los costos de etiquetado de los reactivos, y la facilidad en el análisis de los datos obtenidos17,25,26,32. El método sin etiquetas ha sido ampliamente utilizado, pero requiere muchas horas en el espectrómetro de masas. Es necesario inyectar réplicas técnicas para cada muestra y depende de la reproducibilidad cromatográfica entre las muestras. Otros reactivos de etiquetado químico, por ejemplo, ITRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) y TMT (etiqueta de masa en tándem), son caros y solo proporcionan cuantificación de péptidos seleccionados para el análisis de EM/EM25,33,34.
La principal limitación de la cuantificación relativa a través del etiquetado químico utilizando RMA es la superposición que se produce para algunos péptidos al realizar un protocolo utilizando 4 o 5 etiquetas en la misma ejecución, lo que resulta en diferencias de masa de 2 Da para péptidos con una sola amina primaria y 1 Da para péptidos con prolina N-terminal y sin residuos internos de lisina. Sin embargo, Tashima y Fricker (2018) desarrollaron un modelo para corregir la superposición isotópica basado en ecuaciones polinómicas cúbicas25, que obtienen la intensidad correcta de los péptidos marcados en las muestras. Además, no todos los péptidos pueden ser vistos por RMA. Por ejemplo, algunos péptidos carecen de una amina libre de N-terminal debido a la acetilación, piroglutamilación u otra modificación. Si las lisinas internas también están ausentes en estos péptidos, no serán marcadas por el reactivo RMA y aparecerán en los espectros m/z como picos individuales no cuantificables27.
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Disclosures
No existen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
El desarrollo y uso de las técnicas descritas aquí fueron apoyados por la subvención del Consejo Nacional de Investigación de Brasil 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) becas 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) y 21/01286-1 (MEME). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del artículo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid - HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer - TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid - TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
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