Summary
I denne artikel beskrives en prøveforberedelsesmetode baseret på varmeinaktivering for at bevare endogene peptider, så man undgår nedbrydning efter mortem, efterfulgt af relativ kvantitet ved hjælp af isotopmærkning plus LC-MS.
Abstract
Peptidomics kan defineres som den kvalitative og kvantitative analyse af peptider i en biologisk prøve. Dens vigtigste anvendelser omfatter identifikation af peptid biomarkører af sygdom eller miljøstress, identificere neuropeptider, hormoner, og bioaktive intracellulære peptider, opdage antimikrobielle og nutraceutical peptider fra protein hydrolysates, og kan bruges i undersøgelser til at forstå de proteolytiske processer. Den seneste fremskridt i prøve forberedelse, separation metoder, massespektrometri teknikker, og beregningsmæssige værktøjer relateret til protein sekventering har bidraget til stigningen i de identificerede peptider antal og peptidomer karakteriseret. Peptidomiske undersøgelser analyserer ofte peptider, der naturligt genereres i celler. Her beskrives en prøveforberedelsesprotokol baseret på varmeinaktivering, hvilket eliminerer proteaseaktivitet og ekstraktion med milde forhold, så der er ingen peptidbindingsspaltning. Derudover er den relative kvantitet af peptider ved hjælp af stabil isotopmærkning ved reduktiv methylering af aminer også vist. Denne mærkningsmetode har nogle fordele, da reagenserne er kommercielt tilgængelige, billige sammenlignet med andre, kemisk stabile, og tillader analyse af op til fem prøver i et enkelt LC-MS-løb.
Introduction
"Omics" videnskaber er karakteriseret ved den dybe analyse af et molekyle sæt, såsom DNA, RNA, proteiner, peptider, metabolitter, osv. Disse genererede store datasæt (genomforskning, transskriptomics, proteomics, peptidomics, metabolomics osv.) har revolutioneret biologien og ført til en avanceret forståelse af biologiske processer1. Udtrykket peptidomics begyndte at blive indført i begyndelsen af det 20. århundrede, og nogle forfattere har omtalt det som en gren af proteomics2. Peptidomics har imidlertid forskellige særegenheder, hvor hovedinteressen er at undersøge det naturligt genererede peptider indhold under cellulære processer, samt karakterisering af biologisk aktivitet af disse molekyler3,4.
Oprindeligt, bioaktiv peptid undersøgelser var begrænset til neuropeptider og hormon peptider gennem Edman nedbrydning og radioimmunoassay. Disse teknikker tillader imidlertid ikke en global analyse, afhængigt af isoleringen af hvert peptid i høje koncentrationer, tid til dannelse af antistoffer, udover krydsreaktivitetsmulighed5.
Peptidomics analyse blev først muliggjort efter flere fremskridt inden for flydende kromatografi koblet massespektrometri (LC-MS) og genom projekter, der leverede omfattende datapuljer for proteomics / peptidomics undersøgelser6,7. Desuden, en specifik peptid ekstraktion protokol for peptidomer skulle etableres, fordi de første undersøgelser, der analyserede neuropeptider globalt i hjerneprøver viste, at detektion blev påvirket af den massive nedbrydning af proteiner, som forekommer hovedsageligt i dette væv efter 1 min post-mortem. Tilstedeværelsen af disse peptidfragmenter maskeret neuropeptid signal og repræsenterede ikke peptidom in vivo. Dette problem blev løst hovedsageligt med anvendelsen af hurtig opvarmning inaktivering af proteaser ved hjælp af mikrobølge bestråling, som drastisk reduceret tilstedeværelsen af disse artefakt fragmenter og tillod ikke kun identifikation af neuropeptid fragmenter, men afslørede tilstedeværelsen af et sæt peptider fra cytosolic, mitokondrie, og nukleare proteiner, forskellige af nedbrydestom6,8,9.
Disse metodiske procedurer tillod en udvidelse af peptidomet ud over de velkendte neuropeptider, hvor hundredvis af intracellulære peptider, der hovedsagelig genereres af virkningen af proteaomer, er blevet identificeret i gær10, zebrafisk11, gnavervæv12 og menneskelige celler13. Snesevis af disse intracellulære peptider har i vid udstrækning vist sig at have både biologiske og farmakologiske aktiviteter14,15. Desuden kan disse peptider anvendes som sygdomsbiomarkører og muligvis have klinisk betydning, som det fremgår af cerebrospinalvæske fra patienter med intrakranielle saccular aneureursms16.
I øjeblikket, ud over identifikation af peptid sekvenser, er det muligt gennem massespektrometri at opnå data om absolut og relativ kvantitet. I den absolutte kvantitet sammenlignes peptidniveauerne i en biologisk prøve med syntetiske standarder, mens peptidniveauerne i den relative kvantitet sammenlignes mellem to eller flere prøver17. Relativ kvantitet kan udføres ved hjælp af følgende tilgange: 1) "label free"18; 2) in vivo metabolisk mærkning eller 3) kemisk mærkning. De sidste to er baseret på brugen af stabile isotopformer indarbejdet i peptider19,20. I etiketfri analyse estimeres peptidniveauerne ved at overveje signalstyrken (spektraltællinger) under LC-MS18. Men isotop mærkning kan opnå mere præcise relative niveauer af peptider.
Mange peptidomiske undersøgelser anvendes trimethylammonium butyrat (TMAB) mærkning reagenser som kemisk mærkning, og for nylig, Reduktiv methylering af aminer (RMA) med deuterated og ikke-deuterated former for formaldehyd og natrium cyanoborohydrid reagenser er blevet brugt11,21,22. TMAB-etiketterne er dog ikke kommercielt tilgængelige, og synteseprocessen er meget besværlig. På den anden side er reagenserne i RMA kommercielt tilgængelige, billige sammenlignet med andre etiketter, proceduren er enkel at udføre, og de mærkede peptider er stabile23,24.
Brugen af RMA indebærer dannelse af en Schiff base ved at tillade peptider til at reagere med formaldehyd, efterfulgt af en reduktion reaktion gennem cyanoborohydrid. Denne reaktion forårsager dimethylation af frie aminogrupper på N-terminaler og lysin sidekæder og monometyater N-terminal prolines. Hvordan proline rester er ofte sjældne på N-terminalen, næsten alle peptider med frie aminer på N-endestationen er mærket med to methylgrupper23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende procedure for peptidudvinding og reduktiv methylering blev tilpasset fra tidligere offentliggjorte procedurer24,25,26,27. Denne protokol fulgte retningslinjerne fra National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA) og blev godkendt af Ethics Commission for Animal Use (CEUA) ved Bioscience Institute of Sao Paulo State University. Protokoltrinnene vises i figur 1.
BEMÆRK: Forbered alle vandige løsninger i ultrapurt vand.
1. Peptid udvinding
- Cellekultur
- Dyrk SHSY5Y-celler i en 15 cm skål ved 37 °C under 5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagles medium, der indeholder 15% fosterkvægsserum og 1% Penicillin-Streptomycin.
- Brug 2-3 plader til hver prøve. Dyrk cellerne til 100% sammenløb.
- Efter den påtænkte behandling vaskes cellerne to gange med fosfatbufferet saltvand. Derefter tilsættes 10 mL phosfat-buffered saltvand, skrab cellerne og samles i et 15 mL rør.
- Centrifugere ved 800 x g i 5 min og fjern supernatanten. Brugpillen i 1 mL ultrarenset deioniseret vand ved 80 °C.
- Overfør indholdet af røret (cellulært lysat) til et 2 mL mikrofugerør.
- Animalsk væv (hovedsagelig nervevæv):
- Bedøve vilde type mandlige voksne Danio rerio (zebrafisk) med en dødelig dosis af MS 222 (100 mg / L) og straks udsætte det for 8 s af mikrobølgestråling til inaktivere peptidase og protease.
BEMÆRK: Der kan bruges mikrobølgeovn af husholdningstypen. En 900 W mikrobølgeovn blev brugt til 8 til 10 s ved fuld kraft. Den anvendte mikrobølgeovn skal kunne hæve hjernetemperaturen til > 80 °C inden for 10 s. Reproducerbarhed i opvarmningen mellem prøverne ville også være til gavn ved at placere vævet på samme sted i mikrobølgeovnen. - Efter varmeinaktivering opsamles hele hjernen i et 2 mL mikrofugerør og fryses ved −80 °C indtil analyse.
- Vævsprøven genbruges i 1 mL af ultrarenset deioniseret vand ved 80 °C. Soniker vævet med en sonde ved hjælp af 30 pulser (4 Hz) af 1 s.
NOTER: Til lever- og nyrevæv skal du bruge en mekanisk homogenisator ved 10.000-30.000 omdr./min. i 20 s. For muskelvæv, male vævet i flydende nitrogen ved hjælp af en porcelæn digel og støder. Følgende trin er de samme for det cellulære lysat eller homogenatvævet.
- Bedøve vilde type mandlige voksne Danio rerio (zebrafisk) med en dødelig dosis af MS 222 (100 mg / L) og straks udsætte det for 8 s af mikrobølgestråling til inaktivere peptidase og protease.
- Inkuberes det cellulære lysat- eller homogenatvæv ved 80 °C i 20 min. Derefter afkøles det på is i 10-30 minutter.
- Der tilsættes 10 μL 1 M HCl-lageropløsning for hver prøvevolumen på 1 mL for at opnå en endelig koncentration på 10 mM. Bland ved vortexing i 20 s og yderligere inkubere på is i 15 min.
BEMÆRK: Før forsurningen skal prøven afkøles fuldstændigt for at undgå at bryde peptidbindingerne forårsaget af forsuring ved forhøjede temperaturer. - Centrifugere det cellulære lysat eller homogenatvævet ved 12.000 x g ved 4 °C i 15 min. Supernatanten opsamles i mikrocentrifugrør med lavt bindende proteinindhold, og opbevar det ved -80 °C.
- Rengør ultrafiltrene (10 kDa cut-off filtre) ved at tilsætte vand og centrifuge ved 2300 x g i 3 min. Gentag dette trin to gange mere.
- Supernatanten placeres i de forvaskede 10 kDa cut-off filtre og centrifuge ved 2.300 x g ved 4 °C i 50 min i en forrimtet centrifuge. Flow-through repræsenterer peptid ekstrakt.
- Prøverne på oprydningssøjler i omvendt fase i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger ved hjælp af acetonitrilopløsninger (ACN) og trifluoracetic acid (TFA) som beskrevet nedenfor:
- Ekvilibrere kolonnen med 1 mL af 100% ACN.
- Vask søjlen med 1 mL opløsning på 5% ACN med 0,1% TFA.
- Indlæs hele prøvens volumen i kolonnen.
- Vask kolonnen med 1 mL opløsning på 5% ACN med 0,1% TFA
- Eluter peptider fra kolonnen med en 1,8 mL opløsning på 100% ACN med 0,15% TFA i protein lav bindende mikrocentrifuge rør.
- Prøven tørres helt i en vakuumcentrifuge. Koncentrationsmetoden for organiske opløsningsmidler og temperatur indstilles til 30 °C. Koncentrationstiden overvåges på displayet.
- Prøverne opbevares ved −80 °C indtil næste trin.
2. Peptid kvantificering med fluorescamin
BEMÆRK: Mængden af peptid kan estimeres ved hjælp af fluorescamin ved pH 6,8 som tidligere beskrevet11,28. Denne metode består af fastgørelse af et fluorescaminmolekyle til de primære aminer, der er til stede i lysinrester (K) og/eller N-terminalen af peptider. Reaktionen udføres ved pH 6.8 for at sikre, at fluorescamin kun reagerer med peptidernes aminogrupper og ikke med frie aminosyrer. Fluorescamin måles ved hjælp af et spektrfluorometer ved en excitationsbølgelængde på 370 nm og en emissionsbølgelængde på 480 nm.
- Der forberedes forskellige koncentrationer af standardpeptid (0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,5 og 0,7 μg/μL) og opbevares aliquots ved -20 °C.
BEMÆRK: Peptid 5A (LTLRTKL) foreslås, da det har en kendt sammensætning og koncentration. - Fluorescaminopløsning (0,3 mg/ml) i acetone. Aliquot hurtigt i mikrocentrifuge rør (1 mL), forsegle ved hjælp af parafilm, og opbevares ved -20 °C i mørke.
- Klargør 0,2 M Fosfatbuffer (PB) ved pH 6.8.
BEMÆRK: Klargør 0,2 M PB ved tilsætning af 0,1 M fosfatbuffer pH 6,8 (26,85 mL Na2HPO3 1M) og 0,1 M fosfatbuffer pH 6,8 (23,15 mL naH2PO3 1M) til 250 mL vand - Brug peptidprøverne igen i 100-200 μL ultrarenset vand.
- Pipette 2,5 μL af standard peptidkoncentrationer og prøver på den hvide 96-brøndsplade til fluorescensanalyser i tredotel. Der tilsættes 25 μL af 0,2 M Fosfatbuffer.
- Der tilsættes 12,5 μL fluorescamin med en multikanalpipette. Homogeniser forsigtigt i 1 min på orbital rotator shaker.
- Derefter tilsættes 110 μL vand med en multikanal pipette for at stoppe reaktionen.
BEMÆRK: Overfør fluorescaminlageropløsningen og ultrapurt vand til to reservoirer for at pipette disse opløsninger med en multikanalpipette. - Juster følgende læseparametre på spektrfluorometeret: Læs prøverne fra toppen, excitationsbølgelængde ved 370 nm og emissionsbølgelængde ved 480 nm.
- Læs pladen på spektrometeret.
3. Reduktiv methylering af aminer mærkning
BEMÆRK: Denne isotop mærkningsmetode er baseret på dimethylation af amingrupper med deutererede og ikke-deutererede former for formaldehyd og natriumcyaniobohydridreagenser. Det endelige produkt af denne reaktion tilføjer 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da eller 36 Da til den endelige masse af hvert peptid på hvert tilgængeligt mærkningssted (lysin eller N-terminal). Denne reaktion giver en m/z forskel i peptider mærket med forskellige former observeret i MS-spektret (tabel 1).
FORSIGTIG: Der skal anvendes korrekt sikkerhedsudstyr til at håndtere disse forbindelser, og der skal udvises forsigtighed for at minimere eksponeringen. Procedurer med formaldehyd og natriumcyanioborhydridreagenser bør udføres i en røghætte, fordi de er meget giftige (herunder vejning af natriumcyanioborhydrid). Under slukningsreaktionen og forsuringen kan der dannes en giftig gas (hydrogencyanid).
- Forbered følgende friske opløsninger fra bestanden eller reagenserne på dagen for proceduren i ultrapurt vand:
- Fortynd bestanden af 37% Formaldehyd (CH2O) til 4%.
- Fortynd bestanden af 20% Formaldehyd Deuterated (CD2O) til 4%.
- Udvandes bestanden af 20 % Deuterated C13 Formaldehyd (13CD2O) til 4%.
- Forbered 0,6 m NaBH3CN.
- Forbered 0,6 m NaBD3CN.
- Forbered en opløsning på 1% Ammonium bicarbonat.
- Forbered en opløsning 5% Myresyre.
BEMÆRK: Med hensyn til den relative kvantitet af peptider, da forskellige forsøgsordninger kan udføres afhængigt af antallet af anvendte etiketter, er det nødvendigt at være opmærksom under den kemiske mærkningsprocedure. Det anbefales at adskille små aliquots af etiketterne i separate stativer med de respektive prøver, der skal mærkes for at reducere risikoen for menneskelige fejl ved at tilføje det forkerte reagens til prøverørene.
- Hver prøve, der indeholder op til 25 μg af peptid. Prøver må ikke indeholde Tris eller Ammonium Bicarbonat.
BEMÆRK: De nedenfor beskrevne mængder er tilstrækkelige for hver prøve i et volumen på 100 μL.
Fortsæt med trin 3.3-3.8 i en røghætte. - Der tilsættes 1/10. volumen på 1 M TEAB til prøverne (endelig koncentration af opløsningen 100 mM TEB). Kontroller pH-værdi-værdi-selskabet med et pH-indikatorpapir. det skal være mellem 5-8. Juster med HCl eller NaOH, hvis det er nødvendigt.
- Tilsæt 4 μL ikke-deuterated, deuterated Formaldehyd eller C13 deuterated Formaldehyd i henhold til den etablerede mærkningsordning. Bland til 5 s ved vortexing.
- Der tilsættes 4 μL NaBH3CN (0,6 M) eller NaBD3CN (0,6 M) i henhold til den etablerede mærkningsordning. Bland til 5 s ved vortexing.
- Inkuber i en røghætte i 2 timer ved stuetemperatur og blandes hvert 30. minut.
- Gentag trin 3.4 og 3.5. Inkuber prøverne i en røghætte natten over ved stuetemperatur.
- Tilsættes 16 μL Ammonium bicarbonat (1%) og blandes ved hvirvlen. Prøven anbringes på is, der tilsættes 8 μL myresyre (5 %), og bland med vortex i 5 s.
- Kombiner prøverne, juster pH-værdi til 2-4, og afsalt de kombinerede prøver på omvendte oprydningssøjler som tidligere beskrevet i trin 1.8.
- Prøven tørres helt i en vakuumcentrifuge. Koncentrationsmetoden for organiske opløsningsmidler og temperatur indstilles til 30 °C. Koncentrationstiden overvåges på displayet.
- Prøverne opbevares ved -20 °C.
4. Flydende kromatografi og massespektrometri
- Udfør LC-MS-analyse ved hjælp af et nanoHPLC-system koblet til et MS-instrument, der er kompatibelt med methyltags.
BEMÆRK: En række MS-instrumenter er kompatible med RMA-mærkning. Et nanoHPLC-system koblet til Orbitrap bruges typisk til at udføre LC-MS-analyse gennem en nanoelektrospray ionkilde. For det første indlæses prøven i en forcolumn og peptider adskilt i en analytisk kolonne. Elution af peptider udføres ved hjælp af en lineær gradient på 5%-45% acetonitril, i 0,1% myresyre, i løbet af 90 min, med en strøm på 200 nL/min. Massespektrometeret er indstillet til at fungere i dataafhængig tilstand. Hver fuld scanning erhverves med en intensitet på 10-30 eV, 2,3 Kv, og derefter vælges de ti højeste toppe til kollisionsfremkaldt dissociation (CID) fragmentering. Injektionstiden er indstillet på ionfælden ved 100 ms, og indsprøjtningen fourier transform (FT)-MS er fastgjort med en opløsning på 1000 ms 30.000 ved m/z 300-1800. Mindst 5000 tæller og en dynamisk udelukkelse på 70 s bruges til at udføre fragmentering scanning.
5. Relativ kvantificering af peptider
BEMÆRK: MS-spektret analyseres i massespektrometersoftwaren. Peak grupper af mærket peptider med forskellige tags er identificeret i MS spektre. Den relative kvantitet beregnes ved intensiteten af hver monoisotopisk top. Hver behandlet gruppe sammenlignes med den respektive kontrolgruppe.
- Højreklik på den rå eksempelfil for at åbne frekvensanalysesoftwaren. Indlæs EM-kromatogrammet Retention Time (RT) og MS Spectrum (EM) i henholdsvis to faner, top og bund.
- Højreklik én gang sekventielt på ikonerne Skærm og Masseindstillinger på softwareværktøjslinjen, og angiv massepræcisionen til fire decimaler.
- Placer musemarkøren et vilkårligt sted under fanen RT. Kig efter opbevaringstiden for den tilsvarende ion, der skal analyseres, og klik på højre museknap. MS-spektret på det valgte tidspunkt vises automatisk under fanen EM.
- Placer musemarkøren et vilkårligt sted under fanen EM. Se efter de ioner, der skal analyseres.
- Højreklik, og hold nede i et tilstødende område til venstre i nærheden af disse ioner. Træk derefter musen til højre på det ønskede område for at zoome ind på interesseområdet.
- Hold musen placeret under fanen EM, og klik på højre eller venstre tastaturpile for at definere det område af ioner, der skal analyseres.
- Placer musemarkøren under fanen RT igen i begyndelsen af det ønskede tidsinterval.
- Højreklik, og træk med musen, indtil den valgte klokkeslætsværdi. Lad knappen ligge. Den akkumulerede intensitet af ionerne vises automatisk under fanen EM.
- Indsamle m/z, z og ion intensitet data på et regneark.
BEMÆRK: Den monoisotopiske masse af hvert peptid uden tilsat methylgrupper beregnes ud fra følgende formel:
Masse uændret peptid = (m/z a x z) - (C a x T) - (1,008 x z)
m/zais den observerede masse til at opkræve værdi for den monoisotopiske top for hvert peptid, der er mærket med forskellige kombinationer af tags (a =1, 2, 3, 4 eller 5, svarende til prøvenummeret).
z er opladning tilstand.
Ca er den monoisotopiske masse af et par methylgrupper:
For a=1, Ca = 28,0313 (nettotilsætning af to CH3-grupper til den primære amin)
For a=2, Ca = 30,0439 for to CHD2-grupper
For a=3= Ca = 32,0564 for to CD2H-grupper
For a=4, Ca= 34,0690 for to CD3-grupper
For a=5, Ca = 36,0757 for to 13 CD3-grupper
T er antallet af par methylgrupper, der er indarbejdet i peptid. Dette kan beregnes ud fra følgende formel, når der bruges fem koder: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. For peptider, der indeholder en enkelt primær amin og derfor er mærket med kun to methylgrupper præsentere peak overlapninger på MS spektre, når tilstødende etiketter anvendes. Topintensiteten for hver mærket peptid kan korrigeres ved hjælp af de ligninger, der er beskrevet af Tashima og Fricker25.
6. Peptid Identifikation
- Hvis du vil identificere peptider, skal du analysere MS/MS-dataene ved hjælp af en databasesøgemaskine29,30.
- Hvis du vil beregne den falske registreringshastighed (FDR) ved hjælp af lokkeduefusionsmetoden, skal du søge i en lokkeduedatabase.
BEMÆRK: De anvendte søgeparametre er ingen enzym specificitet; prækursor masse tolerance sæt 15-50 ppm; fragmention massetolerance på 0,5 Da; variable modifikationer: reaktive aminer fra Lysrester og N-endestation for peptid isotop methylerede etiketter (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) og L5 (+36)), oxideret methionin (+15,99 Da) og acetylation (+42,01 Da). - Sorter derefter peptider efter deres gennemsnit af lokal tillid for at vælge det bedste spektre til at kommentere og filtrere dem efter FDR ≤5%.
Figur 1: Arbejdsgang for peptidomiske undersøgelser. Trin af peptid ekstraktion og reduktiv methylering af aminer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne fra de kørsler, der udføres på massespektrometeret, gemmes i rå datafiler, der kan åbnes i massespektrometersoftwaren. I MS-spektret er det muligt at observere topgrupper, der repræsenterer mærkede peptider i henhold til den anvendte mærkningsordning, lige fra 2-5 etiketter. I figur 2 er par toppe, der opdages i en kromatografisk tid, f.eks. repræsenteret i et forsøg, hvor der kun blev anvendt to isotopetiketter i to forskellige prøver i samme kørsel. Figur 3 viser andre muligheder for positive resultater ved hjælp af 3 og 4 forskellige etiketter i hver LC-MS-kørsel. Når du bruger 4 eller 5 etiketter i en LC/MS-kørsel, kan der være en overlapning af toppe af de mærkede peptider med de forskellige tags, der skal korrigeres for at opnå den reelle intensitetsværdi for hver top (figur 4).
Isotopmærkningen kan også anvendes til at vise substrater og produkter in vitro for en given protease eller peptidase, som vist i figur 5. Endelig kan forskellige software bruges til at identificere de mærkede peptider, såsom Peaks Studio eller MASCOT. Disse softwareapplikationer blev oprettet til proteomisk analyse; Proteinkvantitetsdataene bør derfor ikke tages i betragtning til peptidomicsanalyse, og hvert mærket peptid, der er identificeret inden for pålidelighedsparametrene, skal kontrolleres og kvantificeres derefter. Hvis peptiderne er blevet opdaget og mærket, vil disse programmer give en liste over identificerede peptidsekvenser, der indeholder etiketterne. Figur 6 er vist et eksempel på identifikation af en peptid sekvens udført af programmet. I dette tilfælde blev kun 3 forskellige former af etiketterne (L1, L3 og L5) brugt til at mærke tre forskellige prøver separat, som derefter blev blandet og analyseret af massespektrometri i en enkelt kørsel.
Figur 2: MS-spektrum, der er repræsentativt for en kromatografisk tid akkumuleret i et typisk mærkningseksperiment ved hjælp af reduktiv dimethylation af aminer. I (A) angiver de røde pile tilstedeværelsen af peak par af forskellige peptider mærket med 2 isotopforme (L1 og L5) til sammenligning mellem to forskellige prøver (S1 og S2). I (B) et forstørret billede af et MS-spektrum af samme peptid, der viser forskellige m/z på grund af brugen af etiketter. I dette tilfælde var der ingen variation i topintensiteten for dette peptid til stede i disse prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativt MS-spektrum af mærkede peptider med reduktiv methylering af aminer ved hjælp af forskellige antal tags. (A) Der blev anvendt en triplexmærkning. Det er muligt at observere et MS-spektrum af en peptid, der er til stede i 3 forskellige prøver (S1, S2 og S3) mærket med henholdsvis L1-, L3- og L5-tags. I dette tilfælde var niveauet af mærket peptid med L5 dobbelt så højt som for det samme peptid mærket med L1- og L3-tags. (B) Der blev udført en quadripex-mærkning ved hjælp af etiketterne L1, L2, L3 og L4. I dette tilfælde blev kontrolprøver (S1 og S3) mærket med henholdsvis L1 og L3 og sammenlignet med to forsøgsprøver (S2 og S4) mærket med L2- og L4-etiketter. Der blev ikke observeret signifikante forskelle for dette peptid mellem prøverne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativt MS-spektrum af en mærket peptid, der frembyder et højdepunkt. Denne figur viser MS spektrum af en peptid af afgift 3, masse af 2098.87 Da med en enkelt primær amine til rådighed for mærkning. Forskellen mellem de mærkede peptider er kun 2 Da, hvilket forårsager overlapning, når der anvendes 4 eller 5 etiketter i samme REM/MS-kørsel. Ved hjælp af en model baseret på kubiske polynomiske ligninger er det muligt at rette disse overlapninger mellem etiketterne. I grafen viser de røde søjler gennemsnittet af de intensitetsværdier, der er justeret for dette peptid i to kørsler. De sorte søjler viser gennemsnittet af de overlappende intensitetsværdier. Efter korrektion viste denne peptid ringe variation i intensitet mellem prøver (røde bjælker). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentativt MS-spektrum af mærkede peptider med reduktiv methylering af aminer i en proteolyseundersøgelse. Her blev peptidekstrakter inkuberet med 200 nM og 20 nM neurolysin for at karakterisere deres substrater og produkter. For at bekræfte resultatet blev der udført to LC/MS-kørseler med strategier for fremad- og omvendt mærkning. I anden kørsel ændres prøvernes position i mærkningsproceduren i forhold til det skema, der blev anvendt i første kørsel. I A vises det en peptid, der ikke ændrer sig (NC) i nærværelse af neurolysinenzymet. I B, en peptid, der forsvandt i nærværelse af en høj koncentration af enzymet (S2), og som viste en lille reduktion i den lave koncentration af enzymet (S4) i både fremad og omvendt mærkning. Denne peptid betragtes som et substrat (SB) af enzymet. I C et eksempel på en peptid, der blev betragtet som et produkt (PD), fordi dets koncentration blev øget (S2 og S4) i nærværelse af enzymet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentativt MSMS-spektrum og identifikation af et mærket peptid udført af en databasesøgemaskine. I dette eksempel er det muligt at observere 2+ ioner med m/z 672,3802, 676,4045 og 680,4241 svarende til et peptid af samme masse mærket med henholdsvis L1, L3 og L5 methylerede former. Denne sekvens ADQVSASLAKQGL blev identificeret gennem MS/MS-spektret som et fragment af det mikrotubule-associerede protein tau isoform X1. Denne peptid har N-terminalen og en lysin, der er tilgængelig som mærkningssteder, der tilføjer en masseforskel på 8 Daltons mellem de mærkede peptider. MS-spektret af denne peptid er vist i figur 3A. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøve | H2CO | D2CO | D213CO | NaBH3CN | NaBD3CN | Etiket | Ekstra masse |
| 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | kodeks | - Det er ikke noget, vi har? | |
| 1 | X | X | L1 | 28.0313 | |||
| 2 | X | X | L2 | 30.0439 | |||
| 3 | X | X | L3 | 32.0564 | |||
| 4 | X | X | L4 | 34.069 | |||
| 5 | X | X | L5 | 36.0757 |
Tabel 1: Reagenser af et typisk eksperiment ved hjælp af den angivne kombination af deutererede og ikke-deutererede former for formaldehyd og natriumcyanioborohydrid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de fleste peptidomics undersøgelser er et af de kritiske trin uden tvivl prøvepræparatet, der skal udføres omhyggeligt for at undgå tilstedeværelsen af peptidfragmenter genereret af proteaser efter et par minutter efter mortem. De indledende undersøgelser af hjerneekstrakter fremstillet af ikke-mikrobølgede prøver viste, at et stort antal proteinfragmenter var til stede i 10-kDa-mikrofiltrene. Forskellige tilgange er blevet beskrevet for at undgå peptid spektre fra protein nedbrydning: fokuseret mikrobølge bestråling dyreoffer6,8, kryostat dissektion efterfulgt af en kogende ekstraktion buffer31, og post-offer mikrobølge-bestråling af væv ved hjælp af en husstand type mikrobølgeovn9,26 . For cellekultur og visse væv kan proteaseinaktivering ske direkte ved tilsætning af vand ved 80 °C. Nogle prøver, såsom nervevæv, kan dog være mere følsomme over for post mortem-ændringer, og proteaseaktivering ved mikrobølgebestråling er blevet angivet som en valgmetode. Desuden er et andet vigtigt punkt under peptidudvindingen at sikre, at ekstrakter er iskolde, før der tilsættes syre-labilebindinger i at bryde, som kavalergang af Asp-Pro-bindinger26.
Forskellige strategier kan bruges til relativ kvantificering af peptider, men ingen af dem kan betragtes som helt ideelle. For at vælge den metode, der skal anvendes, skal forskeren overveje faktorer som tilgængelighed af brugstimer i massespektrometeret, kommercielt tilgængelige og omkostninger ved mærkning af reagenser og let at analysere de opnåede data17,25,26,32. Den etiketfri metode har været meget udbredt, men kræver mange timer i massespektrometeret. Det er nødvendigt at injicere tekniske kopier for hver prøve og afhænger af kromatografiske reproducerbarhed blandt prøverne. Andre kemiske mærkning reagenser, for eksempel, ITRAQ (isobariske tags for relativ og absolut kvantitet) og TMT (tandem masse tag), er dyre og kun give kvantitet af peptider udvalgt til MS / MS analyse25,33,34.
Den største begrænsning af relativ kvantificering gennem kemisk mærkning ved hjælp af RMA er overlapningen, der opstår for nogle peptider, når der udføres en protokol ved hjælp af 4 eller 5 etiketter på samme kørsel, hvilket resulterer i masseforskelle på 2 Da for peptider med en enkelt primær amin og 1 Da for peptider med N-terminus proline og ingen interne lysinrester. Tashima og Fricker (2018) udviklede dog en model til at korrigere isotop overlappende baseret på kubiske polynomiske ligninger25, som får den korrekte intensitet af de mærkede peptider i prøverne. Desuden kan ikke alle peptider ses af RMA. For eksempel mangler nogle peptider en N-terminal gratis amin på grund af acetylation, pyroglutamylation eller en anden ændring. Hvis interne lysiner også er fraværende i disse peptider, vil de ikke blive mærket af RMA reagens og vil blive vist på m / z spektre som ikke kvantificerbare enkelt toppe27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der findes ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Udviklingen og anvendelsen af de teknikker, der er beskrevet her, blev støttet af det brasilianske nationale forskningsråds tilskud 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) giver tilskud 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) og 21/01286-1 (MEME). Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsen design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af artiklen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid - HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer - TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid - TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross,, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
