Summary
Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.
Abstract
Peptidomik, biyolojik bir örnekteki peptitlerin nitel ve nicel analizi olarak tanımlanabilir. Başlıca uygulamaları arasında hastalık veya çevresel stresin peptit biyobelirteçlerinin tanımlanması, nöropeptidlerin, hormonların ve biyoaktif hücre içi peptitlerin tanımlanması, protein hidrolisatlarından antimikrobiyal ve nutraceutical peptitlerin keşfedilmesi ve proteolitik süreçlerin anlaşılması için yapılan çalışmalarda kullanılabilecektir. Numune hazırlama, ayırma yöntemleri, kütle spektrometresi teknikleri ve protein dizilimi ile ilgili hesaplamalı araçlardaki son gelişmeler, tanımlanan peptit sayısının ve karakterize peptidomların artmasına katkıda bulunmuştur. Peptidomik çalışmalar sıklıkla hücrelerde doğal olarak üretilen peptitleri analiz eder. Burada, ısı inaktivasyonuna dayanan, proteaz aktivitesini ortadan kaldıran ve hafif koşullarla ekstraksiyon yapan bir örnek hazırlama protokolü tanımlanmıştır, bu nedenle peptit bağları bölünmesi yoktur. Ek olarak, aminlerin indirgeyici metilasyonu ile kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak peptitlerin bağıl niceliği de gösterilmiştir. Reaktifler ticari olarak mevcut, diğerlerine göre ucuz, kimyasal olarak kararlı ve tek bir LC-MS çalışmasında beş numunenin analizine izin verdiğinden, bu etiketleme yönteminin bazı avantajları vardır.
Introduction
"Omics" bilimleri, DNA, RNA, proteinler, peptitler, metabolitler vb. Bu büyük ölçekli veri kümeleri (genomik, transkriptomik, proteomik, peptidomik, metabolomik vb.) biyolojide devrim yaratmış ve biyolojik süreçlerin ileri düzeyde anlaşılmasına yol açmıştır1. Peptidomik terimi 20. Bununla birlikte, peptidomiklerin belirgin özellikleri vardır, burada ana ilgi hücresel süreçler sırasında doğal olarak üretilen peptit içeriğini ve bu moleküllerin biyolojik aktivitesinin karakterizasyonunu araştırmaktır3,4.
Başlangıçta, biyoaktif peptit çalışmaları Edman bozulması ve radyoimmünoassay yoluyla nöropeptitler ve hormon peptitleri ile sınırlandırıldı. Bununla birlikte, bu teknikler, her peptitin yüksek konsantrasyonlarda izolasyonuna, antikorların üretilmesi için zamana bağlı olarak, çapraz reaktivite olasılığının yanı sıra küresel bir analize izin vermez5.
Peptidomik analizi ancak Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi (LC-MS) ve proteomik/peptidomik çalışmaları için kapsamlı veri havuzları sağlayan genom projelerinde birkaç ilerlemeden sonra mümkün oldu6,7. Ayrıca, peptidomlar için belirli bir peptit ekstraksiyon protokolünün oluşturulması gerekiyordu, çünkü beyin örneklerinde nöropeptidleri küresel olarak analiz eden ilk çalışmalar, tespitin proteinlerin büyük ölçüde bozulmasından etkilendiğini gösterdi, bu da esas olarak bu dokuda 1 dakika sonra meydana geldi. Bu peptit parçalarının varlığı nöropeptid sinyalini maskeledi ve peptidom in vivo'yu temsil etmedi. Bu sorun esas olarak mikrodalga ışınlama kullanılarak proteazların hızlı ısınma inaktivasyonu uygulaması ile çözüldü, bu da bu eser parçalarının varlığını büyük ölçüde azalttı ve sadece nöropeptid parçalarının tanımlanmasına izin vermedi, aynı zamanda sitosolik, mitokondriyal ve nükleer proteinlerden bir dizi peptidin varlığını ortaya çıkardı, bozulmadan farklı6,8,9.
Bu metodolojik prosedürler, peptidomun, esas olarak proteazomların etkisiyle üretilen yüzlerce hücre içi peptitin maya10, zebra balığı11, kemirgen dokuları12 ve insan hücrelerinde tanımlandığı tanınmış nöropeptitlerin ötesine genişlemesine izin verdi13. Bu hücre içi peptitlerin düzinelercesinin hem biyolojik hem de farmakolojik aktiviteleri olduğu yaygın olarak gösterilmiştir14,15. Ayrıca, bu peptitler intrakraniyal sakküler anevrizması olan hastalardan beyin omurilik sıvısında gösterildiği gibi hastalık biyobelirteçleri olarak kullanılabilir ve muhtemelen klinik öneme sahiptir16.
Şu anda, peptit dizilerinin tanımlanmasına ek olarak, mutlak ve göreceli nicelik verilerini elde etmek için kütle spektrometresi ile mümkündür. Mutlak nicellikte, biyolojik bir numunedeki peptit seviyeleri sentetik standartlarla karşılaştırılırken, göreceli nicelikte peptit seviyeleri iki veya daha fazla örnek arasında karşılaştırılır17. Göreli nicelik aşağıdaki yaklaşımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir: 1) "etiketsiz"18; 2) in vivo metabolik etiketleme veya 3) kimyasal etiketleme. Son ikisi peptitlere dahil edilmiş kararlı izotopik formların kullanımına dayanmaktadır19,20. Etiketsiz analizde, peptit seviyeleri LC-MS18 sırasında sinyal gücü (spektral sayımlar) dikkate alınarak tahmin edilir. Bununla birlikte, izotopik etiketleme daha doğru bağıl peptit seviyeleri elde edebilir.
Birçok peptidomik çalışmada trimetilamimonyum bütirat (TMAB) reaktifleri kimyasal etiketleme olarak etiketlenerek ve daha yakın zamanda, Aminlerin (RMA) döterlenmiş ve döterlenmemiş formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit reaktif formları ile indirgeyici Metilasyonu kullanılmıştır11,21,22. Bununla birlikte, TMAB etiketleri ticari olarak mevcut değildir ve sentez süreci çok zahmetlidir. Öte yandan, RMA'da, reaktifler ticari olarak mevcuttur, diğer etiketlere kıyasla ucuzdur, prosedürün gerçekleştirilmesi kolaydır ve etiketli peptitler kararlıdır23,24.
RMA kullanımı, peptitlerin formaldehit ile reaksiyona girmesine izin vererek bir Schiff tabanı oluşturmayı ve ardından siyanoborohidrit yoluyla bir azaltma reaksiyonunun oluşturulmasını içerir. Bu reaksiyon, N-terminallerinde ve lizin yan zincirlerinde ve monometrilatlar N-terminal prolines'larında serbest amino grupların dimetilasyonuna neden olur. Prolin kalıntılarının N-terminalinde genellikle nasıl nadir olduğu, pratik olarak N-terminusta serbest aminlere sahip tüm peptitler iki metil grubu ile etiketlenmiştir23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Peptit ekstraksiyonu ve indirgeyici metilasyon için aşağıdaki prosedür daha önce yayınlanan prosedürlerden uyarlanmıştır24,25,26,27. Bu protokol, Ulusal Hayvan Deneyi Kontrol Konseyi'nin (CONCEA) yönergelerine uydu ve Sao Paulo Devlet Üniversitesi Biyobilim Enstitüsü Hayvan Kullanımı Etik Komisyonu (CEUA) tarafından onaylandı. protokol adımları Şekil 1'de gösterilmiştir.
NOT: Tüm sulu çözeltileri ultra saf suda hazırlayın.
1. Peptit ekstraksiyonu
- Hücre kültürü
- %15 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unda %5 CO2'nin altında 37 °C'de 15 cm'lik bir tabakta SHSY5Y hücreleri yetiştirin.
- Her numune için 2-3 plaka kullanın. Hücreleri% 100 birleştiğinde büyütün.
- Amaçlanan tedaviden sonra, hücreleri fosfat tamponlu salin ile iki kez yıkayın. Daha sonra, 10 mL Fosfat tamponlu salin ekleyin, hücreleri kazıyın ve 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
- 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Peletin 80 °C'de 1 mL ultra saflaştırılmış deiyonize suda yeniden ıslatılması.
- Tüpün içeriğini (hücresel lisat) 2 mL mikrofuge tüpüne aktarın.
- Hayvan dokuları (çoğunlukla sinir dokusu):
- Vahşi tip erkek yetişkin Danio rerio'yu (zebra balığı) ölümcül dozda MS 222 (100 mg/L) ile uyuşturun ve peptidaz ve proteazı devre dışı bırakmak için hemen 8 s mikrodalga radyasyonuna maruz kalın.
NOT: Ev tipi mikrodalga fırın kullanılabilir. Tam güçte 8 ila 10 s için 900 W mikrodalga kullanıldı. Kullanılan mikrodalga, beyin sıcaklığını 10 s içinde 80 °C'> çıkarabilmelidir. Numuneler arasında ısıtmada tekrarlanabilirlik, dokuyu mikrodalgada aynı yere yerleştirerek de fayda sağlayacaktır. - Isı inaktivasyonundan sonra, tüm beyni 2 mL mikrobuj tüpünde toplayın ve analize kadar −80 ° C'de dondurun.
- Doku örneğini 80 °C'de 1 mL ultra saflaştırılmış deiyonize suda yeniden saklayın. 1 sn'lik 30 darbe (4 Hz) kullanarak dokuyu bir probla sonicate edin.
NOTLAR: Karaciğer ve böbrek dokuları için 20 sn için 10.000-30.000 rpm'de mekanik bir homojenizatör kullanın. Kas dokuları için, bir porselen pota ve pestle kullanarak sıvı nitrojendeki dokuyu öğütün. Aşağıdaki adımlar hücresel lisat veya homojen doku için aynıdır.
- Vahşi tip erkek yetişkin Danio rerio'yu (zebra balığı) ölümcül dozda MS 222 (100 mg/L) ile uyuşturun ve peptidaz ve proteazı devre dışı bırakmak için hemen 8 s mikrodalga radyasyonuna maruz kalın.
- Hücresel lisat veya homojen dokuyu 80 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, 10-30 dakika buzda soğutun.
- 10 mM'lik son konsantrasyon elde etmek için her 1 mL numune hacmi için 10 μL 1 M HCl stok çözeltisi ekleyin. 20 sn boyunca girdap yaparak karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde daha fazla kuluçkaya yatırın.
NOT: Asitleşmeden önce, yüksek sıcaklıklarda asitleşmenin neden olduğu peptit bağlarının kırılmasını önlemek için numunenin tamamen soğutulduğuna emin olun. - Hücresel lisatı veya homojen dokuyu 15 dakika boyunca 4 °C'de 12.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı düşük bağlayıcı protein mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve -80 ° C'de saklayın.
- Ultrafiltrasyon cihazlarını (10 kDa kesme filtreleri) 3 dakika boyunca 2300 x g'da su ve santrifüj ekleyerek temizleyin. Bu adımı iki kez daha yineleyin.
- Süpernatantı önceden yıkanmış 10 kDa kesme filtrelerine ve santrifüje 2.300 x g'da 4 °C'de 50 dakika boyunca refridgerated santrifüjüne yerleştirin. Akış peptit ekstresini temsil eder.
- Numuneleri, aşağıda açıklandığı gibi asetonitril (ACN) ve trifluoroasetik asit (TFA) çözeltileri kullanarak üreticinin talimatlarına göre ters fazlı temizleme sütunlarındaki tuzdan arındırın:
- Sütunu %100 ACN'nin 1 mL'si ile dengeler.
- Sütunu % 0,1 TFA ile% 5 ACN 1 mL çözelti ile yıkayın.
- Örneğin tüm hacmini sütuna yükleyin.
- Sütunu %0,1 TFA ile %5 ACN 1 mL çözelti ile yıkayın
- Protein düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerinde % 0.15 TFA ile% 100 ACN 1.8 mL çözelti ile peptitleri sütundan çıkarın.
- Numuneyi tamamen vakumlu santrifüjde kurulayın. Organik çözücüler ve sıcaklık için konsantrasyon yöntemini 30 °C olarak ayarlayın. Konsantrasyon süresi ekranda izlenir.
- Numuneleri bir sonraki adıma kadar −80°C'de saklayın.
2. Floresan ile peptit nicelemesi
NOT: Peptit miktarı daha önce açıklandığı gibi pH 6.8'de floresan kullanılarak tahmin edilebilir11,28. Bu yöntem, bir floreskamin molekülünün lizin (K) kalıntılarında ve/veya peptitlerin N-terminalinde bulunan birincil aminlere bağlanmasından oluşur. Reaksiyon pH 6.8'de, floresamin'in serbest amino asitlerle değil, sadece peptitlerin amino gruplarıyla reaksiyona sokulduğunu garanti etmek için gerçekleştirilir. Floresan, 370 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve 480 nm emisyon dalga boyunda bir spektrofluorometre kullanılarak ölçülür.
- Standart peptitin farklı konsantrasyonlarını hazırlayın (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5 ve 0.7 μg/μL) ve aliquotları -20 °C'de saklayın.
NOT: Peptit 5A (LTLRTKL) bilinen bir bileşime ve konsantrasyona sahip olduğu için önerilir. - Asetonda floresan stok çözeltisi (0,3 mg/mL) hazırlayın. Mikrosantrifüj tüplerde (1 mL) hızlı bir şekilde aliquot, parafilm kullanarak mühürleyin ve karanlıkta -20 °C'de saklayın.
- pH 6.8'de 0.2 M Fosfat tamponu (PB) hazırlayın.
NOT: 250 mL suya 0,1 M fosfat tampon pH 6,8 (26,85 mL Na2HPO3 1M) ve 0,1 M fosfat tampon pH 6,8 (23,15 mL NaH2PO3 1M) ekleyerek 0,2 M PB hazırlayın - Peptit örneklerini 100-200 μL ultra saflaştırılmış suda yeniden sunun.
- Pipet 2.5 μL standart peptit konsantrasyonları ve örnekleri üç taraflı floresan tahlilleri için beyaz 96 kuyu plakası üzerine. 25 μL 0,2 M Fosfat tamponu ekleyin.
- Çok kanallı pipet ile 12,5 μL floresan ekleyin. Yörüngesel rotator çalkalayıcıda 1 dakika boyunca hafifçe homojenize edin.
- Ardından, reaksiyonun durdurulması için çok kanallı pipetli 110 μL su ekleyin.
NOT: Floresan stok çözeltisini ve ultra saf suyu, bu çözeltileri çok kanallı bir pipetle pipetle borulamak için iki rezervuara aktarın. - Spektrofluorometrede aşağıdaki okuma parametrelerini ayarlayın: Örnekleri yukarıdan okuyun, 370 nm'de ekscitasyon dalga boyu ve 480 nm'de emisyon dalga boyu.
- Spektrofluorometredeki plakayı oku.
3. Aminlerin indirgeyici metilasyonu etiketleme
NOT: Bu izotopik etiketleme yöntemi, formaldehit ve sodyum siyanohidrit reaktiflerinin döterlenmiş ve kısırlaştırılmamış formlarına sahip amin gruplarının dimetilasyonuna dayanmaktadır. Bu reaksiyonun son ürünü, mevcut her etiketleme yerindeki (lizin veya N terminali) her peptitin son kütlesine 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da veya 36 Da ekler. Bu reaksiyon MS spektrumunda gözlenen farklı formlarla etiketlenmiş peptitlerde m/z farkı yaratır (Tablo 1).
DİkKAT: Bu bileşikleri işlemek için uygun güvenlik ekipmanları kullanılmalı ve maruziyeti en aza indirmeye özen verilmelidir. Formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit reaktifleri ile prosedürler, çok toksik oldukları için (sodyum siyanoborohidritin tartılması dahil) bir duman kaputunda yapılmalıdır. Söndürme reaksiyonu ve asitleşme sırasında toksik bir gaz (hidrojen siyanür) üretilebilir.
- İşlem gününde stoktan veya reaktiflerden aşağıdaki taze çözeltileri ultra saf suda hazırlayın:
- % 37 Formaldehit (CH2O) stokunu% 4'e seyreltin.
- % 20 Formaldehit Deuterated (CD2O) stokunu% 4'e seyreltin.
- % 20 Döterlenmiş C13 Formaldehit (13CD2O) stokunu% 4'e seyreltin.
- 0,6 M NaBH3CN hazırlayın.
- 0,6 m NabD3CN hazırlayın.
- % 1 Amonyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın.
- %5 Formik asit çözeltisi hazırlayın.
NOT: Peptitlerin bağıl niceliği ile ilgili olarak, kullanılan etiket sayısına bağlı olarak farklı deneysel şemalar yapılabildiğinden, kimyasal etiketleme prosedürü sırasında dikkat edilmesi gerekir. Numune tüplerine yanlış reaktif eklemede insan hatası potansiyelini azaltmak için etiketlerin küçük aliquot'larının ayrı raflarda, etiketlenecek ilgili örneklerle ayrılması önerilir.
- Peptit 25 μg'ye kadar olan her numuneyi hazırlayın. Numuneler Tris veya Amonyum Bikarbonat içermemelidir.
NOT: Aşağıda açıklanan miktarlar 100 μL hacimdeki her numune için yeterlidir.
Duman kaputunda 3.3-3.8 adımlarına devam edin. - Numunelere 1/10.cilt 1 M TEAB ekleyin (çözeltinin son konsantrasyonu 100 mM TEAB). pH gösterge kağıdı ile pH'ı kontrol edin; 5-8 arasında olmalıdır. Gerekirse HCl veya NaOH ile ayarlayın.
- Belirlenen etiketleme şemasına göre 4 μL döterlenmemiş, döterlenmiş Formaldehit veya C13 döterlenmiş Formaldehit ekleyin. Girdapla 5 sn karıştırın.
- Belirlenen etiketleme şemasına göre 4 μL NaBH3CN (0,6 M) veya NaBD3CN (0,6 M) ekleyin. Girdapla 5 sn karıştırın.
- Her 30 dakikada bir karıştırarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca duman kaputunda kuluçkaya yaslanın.
- 3.4 ve 3.5. Numuneleri oda sıcaklığında bir gecede duman kaputunda kuluçkaya yatırın.
- 16 μL Amonyum bikarbonat (%1) ekleyin ve girdapla karıştırın. Numuneyi buza yerleştirin, 8 μL formik asit ekleyin (%5) ve 5 sn boyunca girdapla karıştırın.
- Örnekleri birleştirin, pH'ı 2-4 olarak ayarlayın ve daha önce adım 1.8'de açıklandığı gibi ters fazlı temizleme sütunlarındaki birleşik örnekleri tuzdan arındırın.
- Numuneyi tamamen vakumlu santrifüjde kurulayın. Organik çözücüler ve sıcaklık için konsantrasyon yöntemini 30 °C olarak ayarlayın. Konsantrasyon süresi ekranda izlenir.
- Numuneleri -20 °C'de saklayın.
4. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi
- Metil etiketlerle uyumlu bir MS cihazına bağlı bir nanoHPLC sistemi kullanarak LC-MS analizi yapın.
NOT: Çeşitli MS cihazları RMA etiketleme ile uyumludur. Orbitrap ile birleştirilmiş bir nanoHPLC sistemi tipik olarak bir nanoelekrospray iyon kaynağı üzerinden LC-MS analizi yapmak için kullanılır. İlk olarak, örnek analitik bir sütunda ayrılmış bir önkolumna ve peptitlere yüklenir. Peptitlerin elüasyonu, 200 nL / dk'lık bir akışla, 90 dakika boyunca% 0.1 formik asitte% 5-45 asetonitril doğrusal bir gradyan kullanılarak gerçekleştirilir. Kütle spektrometresi veriye bağımlı modda çalışmaya ayarlanır. Her tam tarama 10-30 eV, 2.3 Kv şiddette elde edilir ve daha sonra çarpışmaya bağlı ayrışma (CID) parçalanması için en yüksek on tepe seçilir. Enjeksiyon süresi iyon tuzağına 100 ms olarak ayarlanır ve Fourier Transform (FT)-MS enjeksiyonu m/z 300-1800'de 1000 ms 30.000 çözünürlükte sabitlenir. Parçalanma taraması yapmak için en az 5000 sayım ve 70 s dinamik dışlama kullanılır.
5. Peptitlerin bağıl niceliği
NOT: MS spektrumları kütle spektrometresi yazılımında analiz edilir. MS spektrumunda farklı etiketlere sahip etiketli peptitlerin tepe grupları tanımlanır. Göreli nicelik, her monoisotopik tepenin yoğunluğu ile hesaplanır. Tedavi edilen her grup ilgili kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır.
- Spektrum analiz yazılımını açmak için ham örnek dosyaya sağ çift tıklayın. Saklama süresi (RT) ve MS spektrumu (EM) kromatogramlarını sırasıyla üst ve alt olmak üzere iki sekmeye yükleyin.
- Yazılım araç çubuğundaki Görüntü ve Kütle seçenekleri simgelerinde sırayla bir kez sağ tıklatın ve kütle duyarlılığını dört ondalık olarak ayarlayın.
- Fare imlecini RT sekmesinde herhangi bir yere yerleştirin. Analiz edilecek ilgili iyonun saklama süresini arayın ve sağ fare düğmesini tıklatın. Seçilen sürenin MS spektrumu otomatik olarak EM sekmesinde gösterilir.
- Fare imlecini EM sekmesinde herhangi bir yere yerleştirin. Analiz edilecek iyonları arayın.
- Sağ tıklatın ve bu iyonların yakınında soldaki bitişik bir bölgede tutun. Ardından, ilgi çekici bölgeyi yakınlaştırmak için fareyi istediğiniz aralıkta sağa sürükleyin.
- Fareyi EM sekmesinde tutun ve analiz edilecek iyon aralığını tanımlamak için sağ veya sol klavye oklarını tıklatın.
- Fare imlecini RT sekmesini istediğiniz zaman aralığının başına yeniden yerleştirin.
- Fareyi sağ tıklatın ve seçilen saat değerine kadar sürükleyin. Düğmeyi bırak. Iyonların birikmiş yoğunluğu otomatik olarak EM sekmesinde gösterilir.
- Elektronik tablodaki m/z, z ve iyon yoğunluğu verilerini toplayın.
NOT: Metil grupları eklenmeden her peptitin monoisotopik kütlesi aşağıdaki formülden hesaplanır:
Kütle değiştirilmemiş peptit = (m/z a x z) - (C a x T) - (1.008 x z)
m/zais, farklı etiket kombinasyonlarıyla etiketlenmiş her peptit için monoisotopik tepe için değeri şarj etmek için gözlenen kütledir (örnek sayıya karşılık gelen = 1, 2, 3, 4 veya 5).
z şarj durumudur.
Ca, bir çift metil grubunun monoisotopik kütlesi:
a=1 için Ca = 28.0313 (birincil amine iki CH3 grubunun net eklenmesi)
a=2 için Ca = iki CHD2 grubu için 30.0439
a=3 için Ca = iki CD2H grubu için 32.0564
a=4 için Ca= iki CD3 grubu için 34.0690
A=5 için Ca = iki 13 CD3 grubu için 36.0757
T , peptide dahil edilen metil gruplarının sayısıdır. Bu, beş etiket kullanıldığında aşağıdaki formülden hesaplanabilir: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. Tek bir birincil amin içeren ve bu nedenle bitişik etiketler kullanıldığında MS spektrumunda yalnızca iki metil grubuyla etiketlenen peptitler için tepe örtür. Etiketli her peptitin tepe yoğunluğu Tashima ve Fricker25 tarafından açıklanan denklemler kullanılarak düzeltilebilir.
6. Peptit Tanımlama
- Peptitleri tanımlamak için, ms/ms verilerini bir veritabanı arama motoru kullanarak analiz edin29,30.
- Sahte bulma hızını (FDR) yem füzyon yöntemini kullanarak hesaplamak için bir yem veritabanında arama yapın.
NOT: Genellikle kullanılan arama parametreleri enzim özgüllüğü yoktur; öncül kütle toleransı seti 15-50 ppm; 0,5 Da'nın parça iyon kütle toleransı; değişken değişiklikler: Peptit izotopik metillenmiş etiketlerin Lys kalıntılarından ve N-terminusundan reaktif aminler (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+). 32), L4 (+34) ve L5 (+36)), oksitlenmiş metiyonin (+15.99 Da) ve asetilasyon (+42.01 Da). - Ardından, peptitleri yerel güven ortalamalarına göre sıralayarak açıklama eklemek için en iyi spektrumları seçin ve FDR'ye göre filtreleyin ≤5%.
Şekil 1: Peptidomik çalışmalar iş akışı. Peptit ekstraksiyonu ve Aminlerin Indirgeyici Metilasyonu adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kütle spektrometresi üzerinde gerçekleştirilen çalışmalardan elde edilen sonuçlar, kütle spektrometresi yazılımında açılabilen ham veri dosyalarında saklanır. MS spektrumunda, 2-5 etiket arasında değişen etiketli peptitleri temsil eden tepe gruplarını kullanılan etiketleme şemasına göre gözlemlemek mümkündür. Örneğin, Şekil 2'de, kromatografik bir zamanda algılanan tepe çiftleri, aynı çalıştırmada iki farklı örnekte yalnızca iki izotopik etiketin kullanıldığı bir denemede temsil edilir. Şekil 3 , her LC-MS çalıştırmasında 3 ve 4 farklı etiket kullanarak diğer olumlu sonuç olasılıklarını gösterir. Bir LC/MS çalıştırmasında 4 veya 5 etiket kullanırken, etiketli peptitlerin tepelerinin, her tepenin gerçek yoğunluk değerini elde etmek için düzeltilmesi gereken farklı etiketlerle çakışması olabilir (Şekil 4).
İzotopik etiketleme, Şekil 5'te gösterildiği gibi, belirli bir proteaz veya peptidaz için substratları ve ürünleri in vitro olarak göstermek için de kullanılabilir. Son olarak, Peaks Studio veya MASCOT gibi etiketli peptitleri tanımlamak için farklı yazılımlar kullanılabilir. Bu yazılım uygulamaları proteomik analiz için oluşturulmuştur; bu nedenle, protein nicellik verileri peptidomik analizi için dikkate alınmamalı ve güvenilirlik parametreleri içinde tanımlanan her etiketli peptit kontrol edilmeli ve daha sonra ölçülmelidir. Peptitler başarıyla tespit edildiyse ve etiketlendiyse, bu programlar etiketleri içeren tanımlanmış peptit dizilerinin bir listesini sağlayacaktır. Şekil 6'da program tarafından yapılan bir peptit dizisinin tanımlanmasına bir örnek gösterilmiştir. Bu durumda, etiketlerin sadece 3 farklı formu (L1, L3 ve L5) üç farklı örneği ayrı ayrı etiketlemek için kullanıldı, daha sonra tek bir çalışmayla kütle spektrometresi ile karıştırıldı ve analiz edildi.
Şekil 2: Aminlerin indirgeyici dimetilasyonu kullanılarak tipik bir etiketleme deneyinde biriken kromatografik zamanın MS spektrum temsilcisi. (A) içinde kırmızı oklar, iki farklı örnek (S1 ve S2) arasında karşılaştırma için 2 izotopik formla (L1 ve L5) etiketlenmiş farklı peptitlerin tepe çiftlerinin varlığını gösterir. (B) içinde, etiketlerin kullanımı nedeniyle farklı m/z gösteren aynı peptit ms spektrumunun genişletilmiş bir görüntüsü. Bu durumda, bu örneklerde bulunan bu peptit için tepe yoğunluğunda herhangi bir değişiklik yoktu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı sayıda etiket kullanılarak aminlerin indirgeyici metilasyonu ile etiketli peptitlerin temsili MS spektrumu. (A) Tripleks etiketleme kullanılmıştır. Sırasıyla L1, L3 ve L5 etiketleriyle etiketlenmiş 3 farklı örnekte (S1, S2 ve S3) bulunan bir peptitin MS spektrumunun gözlemlenerek mümkündür. Bu durumda, L5 ile etiketli peptit seviyesi, L1 ve L3 etiketleri ile etiketlenmiş aynı peptit için gözlenen seviyenin iki katıydı. (B) L1, L2, L3 ve L4 etiketleri kullanılarak quadripex etiketlemesi gerçekleştirildi. Bu durumda, kontrol örnekleri (S1 ve S3) sırasıyla L1 ve L3 ile etiketlenmiş ve L2 ve L4 etiketleriyle etiketlenmiş iki deneysel örnekle (S2 ve S4) karşılaştırıldı. Bu peptit için numuneler arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tepe çakışması sunan etiketli bir peptitin temsili MS spektrumu. Bu rakam, etiketleme için mevcut tek bir birincil amin ile 3 şarj peptidi, 2098.87 Da kütlesinin MS spektrumu göstermektedir. Etiketli peptitler arasındaki fark sadece 2 Da'dır ve aynı LC/MS çalışmasında 4 veya 5 etiket kullanıldığında çakışmaya neden olan bir çakışmaya neden olandır. Kübik polinom denklemlerine dayalı bir model kullanarak, etiketler arasındaki bu çakışmaları düzeltmek mümkündür. Grafikte, kırmızı çubuklar bu peptit için ayarlanan yoğunluk değerlerinin ortalamasını iki çalıştırmada gösterir. Siyah çubuklar çakışan yoğunluk değerlerinin ortalamasını gösterir. Düzeltmeden sonra, bu peptit numuneler (kırmızı çubuklar) arasındaki yoğunlukta çok az değişiklik gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bir proteoliz çalışmasında aminlerin indirgeyici metilasyonu ile etiketli peptitlerin temsili MS spektrumu. Burada peptit özleri, substratlarını ve ürünlerini karakterize etmek için 200 nM ve 20 nM nörolisin ile inkübe edildi. Sonucun onaylanması için İleri ve Geri etiketleme stratejileri ile iki LC/MS çalışması gerçekleştirildi. İkinci çalıştırmada, örneklerin konumu ilk çalıştırmada kullanılan şemaya göre etiketleme yordamında değiştirilir. A'da, nörolisin enziminin varlığında değişmeyen bir peptit (NC) gösterilir. B'de, enzimin (S2) yüksek konsantrasyonunun varlığında kaybolan ve enzimin (S4) hem ileri hem de ters etiketlemede düşük konsantrasyonunda küçük bir azalma gösteren bir peptit. Bu peptit enzimin bir substratı (SB) olarak kabul edilir. C'de bir ürün (PD) olarak kabul edilen bir peptit örneği, çünkü konsantrasyonu enzimin varlığında artırıldı (S2 ve S4). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Temsili MSMS spektrumu ve veritabanı arama motoru tarafından gerçekleştirilen etiketli peptitin tanımlanması. Bu örnekte, sırasıyla L1, L3 ve L5 metillenmiş formlarla etiketlenmiş aynı kütledeki bir peptide karşılık gelen m/z 672.3802, 676.4045 ve 680.4241 ile 2+ iyonları gözlemlemek mümkündür. Bu dizi ADQVSASLAKQGL, MS/MS spektrumu aracılığıyla mikrotübül ilişkili protein tau izoform X1'in bir parçası olarak tanımlandı. Bu peptit, etiketli peptitler arasında 8 Dalton kütle farkı ekleyen etiketleme siteleri olarak N terminaline ve bir lizine sahiptir. Bu peptitin MS spektrumu Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | H2CO | D2CO | D213CO | Nabh3CN | Nabd3CN | Etiket | Ek Kütle |
| 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | kod | (Da) | |
| 1 | X | X | L1 | 28.0313 | |||
| 2 | X | X | L2 | 30.0439 | |||
| 3 | X | X | L3 | 32.0564 | |||
| 4 | X | X | L4 | 34.069 | |||
| 5 | X | X | L5 | 36.0757 |
Tablo 1: Reaktifler, döterlenmiş ve döterlenmemiş formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit formlarının belirtilen kombinasyonunu kullanarak tipik bir deneyin reaktifleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çoğu peptidomik çalışmada, kritik adımlardan biri, şüphesiz, proteazlar tarafından üretilen peptit parçalarının ölümünden birkaç dakika sonra varlığını önlemek için dikkatlice yapılması gereken örnek preparattır. Mikrodalga olmayan örneklerden hazırlanan beyin özleri üzerinde yapılan ilk çalışmalarda, 10 kDa mikrofiltratlarda çok sayıda protein parçasının bulunduğu görüldü. Protein bozulmasından peptit spektrumunu önlemek için farklı yaklaşımlar tanımlanmıştır: odaklanmış mikrodalga ışınlama hayvan kurban etme6,8, kriyostat diseksiyonu ardından kaynar ekstraksiyon tamponu31 ve kurban sonrası mikrodalga ışınlama ev tipi mikrodalga fırın9,26 . Hücre kültürü ve bazı dokular için proteaz inaktivasyonu doğrudan 80 °C'de su eklenerek yapılabilir. Bununla birlikte, sinir dokusu gibi bazı örnekler ölüm sonrası değişime karşı daha hassas olabilir ve mikrodalga ışınlama ile proteaz inaktivasyonu bir seçim yöntemi olarak belirtilmiştir. Ayrıca, peptit ekstraksiyonu sırasında bir diğer önemli nokta, Asp-Pro bağlarının bölünmesi gibi asit-labile bağlarının kırılmasını önlemek için asit eklemeden önce özlerin buz gibi olduğundan emin olmaktır26.
Peptitlerin göreceli nicelemesi için farklı stratejiler kullanılabilir, ancak hiçbiri tamamen ideal olarak kabul edilemez. Kullanılacak yöntemi seçmek için araştırmacının kütle spektrometresinde kullanım saatlerinin mevcudiyeti, ticari olarak kullanılabilir ve reaktifleri etiketleme maliyetleri ve elde edilen verileri analiz etme kolaylığı gibi faktörleri göz önünde bulundurması gerekir17,25,26,32. Etiketsiz yöntem yaygın olarak kullanılmıştır, ancak kütle spektrometresinde saatler gerektirir. Her örnek için teknik çoğaltmalar enjekte etmek gerekir ve örnekler arasında kromatografik tekrarlanabilirlik bağlıdır. Diğer kimyasal etiketleme reaktifleri, örneğin ITRAQ (göreli ve mutlak nicellik için izobarik etiketler) ve TMT (tandem kütle etiketi), pahalıdır ve yalnızca MS/MS analizi için seçilen peptitlerin nicelliğini sağlar25,33,34.
RMA kullanılarak kimyasal etiketleme yoluyla bağıl nicelemenin en büyük sınırlaması, aynı çalıştırmada 4 veya 5 etiket kullanan bir protokol gerçekleştirirken bazı peptitler için ortaya çıkan örtüşmedir ve bu da tek bir birincil amin içeren peptitler için 2 Da ve N-terminus proline ve iç lizin kalıntısı olmayan peptitler için 1 Da kütle farklılıkları ile sonuçlanır. Bununla birlikte, Tashima ve Fricker (2018), örneklerdeki etiketli peptitlerin doğru yoğunluğunu alan kübik polinom denklemlerine25 dayanarak izotopik örtüşmeyi düzeltmek için bir model geliştirdi. Ayrıca, tüm peptitler RMA tarafından görülemez. Örneğin, bazı peptitler asetilasyon, pyroglutamylation veya başka bir değişiklik nedeniyle N-terminal serbest aminden yoksundir. Bu peptitlerde iç lizinler de yoksa, RMA reaktifi tarafından etiketlenirler ve m/z spektrumunda niteliksiz tek tepeler olarak görünürler27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Rakip finansal çıkarlar yok.
Acknowledgments
Burada açıklanan tekniklerin geliştirilmesi ve kullanımı Brezilya Ulusal Araştırma Konseyi hibe 420811/2018-4 (LMC) tarafından desteklendi; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ve 21/01286-1 (MEME) hibeleri verir. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlanma kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid - HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer - TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid - TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J.
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A.
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E.
- Baggerman, G., et al.
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L.
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross,, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
