Summary
Den vuxna myggsalivkörteln (SG) krävs för överföring av alla myggburna patogener till sina mänskliga värdar, inklusive virus och parasiter. Denna video visar effektiv isolering av SGs från larv (L4) scenen Anopheles gambiae myggor och beredning av L4 SGs för ytterligare analys.
Abstract
Myggsalivkörtlar (SGs) är ett nödvändigt gatewayorgan för överföring av insektsburna patogener. Sjukdomsframkallande medel, inklusive virus och Plasmodium parasiter som orsakar malaria, ackumuleras i sekretoriska håligheter av SG-celler. Här är de redo för överföring till sina ryggradsdjur värdar under en efterföljande blodmåltid. Som vuxna körtlar bildas som en utarbetande av larval SG trumman knopp rester som kvarstår bortom tidiga pupal SG histolys, larv SG är ett idealiskt mål för interventioner som begränsar sjukdom överföring. Att förstå larv SG utveckling kan bidra till att utveckla en bättre förståelse för dess morfologi och funktionella anpassningar och stöd i bedömningen av nya insatser som riktar sig till detta organ. Detta videoprotokoll visar en effektiv teknik för att isolera, fixa och färga larv SGs från Anopheles gambiae myggor. Körtlar dissekerade från larver i en 25% etanollösning fixeras i en metanol-glacial ättiksyrablandning, följt av en kall acetontvätt. Efter några sköljningar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan SGs färgas med ett brett spektrum av markörfärger och/eller antisera mot SG-uttryckta proteiner. Denna metod för larval SG isolering kan också användas för att samla vävnad för in situ hybridisering analys, andra transkriptomic tillämpningar och proteomic studier.
Introduction
Malaria är ett stort hot mot folkhälsan som orsakar nästan 230 miljoner infektioner och uppskattningsvis 409 000 dödsfall 20191. Majoriteten av dödsfallen är i Afrika söder om Sahara och orsakas av parasiten Plasmodium falciparum, vars insektsvektor är Anopheles gambiae, ämnet för denna videodemonstration. Även om siffrorna indikerar en betydande minskning av den årliga dödssiffran sedan sekelskiftet (> 300 000 färre årliga dödsfall), minskar de lovande minskningarna av antalet sjukdomar som observerats från 2000 till 2015, vilket tyder på behovet av nya metoder för att begränsa sjukdomsöverföringen2. Bland lovande ytterligare strategier för att kontrollera och eventuellt eliminera malaria är att rikta in sig på myggvektorkapacitet med CRISPR / Cas9-baserad genredigering och gendrift3,4,5. Det är faktiskt inriktningen på myggvektorn (genom utökad användning av långvariga insekticidbehandlade sängnät) som har haft störst inverkan på att minska sjukdomsöverföringen6.
Kvinnliga myggor förvärvar Plasmodium gametocyter från en infekterad människa under en blodmåltid. Efter befruktning, mognad, midgut epitel traversal, befolkning expansion och hemocoel navigering i deras obligate mygg värdar, hundratals till tiotusentals Plasmodium sporozoites invadera mygga SGs och fylla de sekretoriska håligheterna i de ingående sekretoriska cellerna. Väl inne i de sekretoriska håligheterna har parasiterna direkt tillgång till salivkanalen och är därmed redo för överföring till en ny ryggradsdjursvärd vid nästa blodmåltid. Eftersom SGs är avgörande för överföring av malariaframkallande sporozoiter till sina mänskliga värdar, och laboratoriestudier tyder på att SGs inte är nödvändiga för blodmatning, myggöverlevnad eller fecundity7,8,9, representerar de ett idealiskt mål för överföringsblockeringsåtgärder. Vuxna myggA SGs bildas som en utarbetande av "kanalknopp" rester i larv SGs som kvarstår bortom tidig pupal SG histolysis10, vilket gör larven SG ett idealiskt mål för interventioner för att begränsa överföring av sjukdomar i vuxenstadiet.
Att karakterisera larvstadiet av SG-utveckling kan bidra till att utveckla inte bara en bättre förståelse för dess morfologi och funktionella anpassningar utan kan också hjälpa till att bedöma nya interventioner som riktar sig mot detta organ genom genredigering av viktiga SG-regulatorer. Eftersom alla tidigare studier av larv salivary gland arkitektur predate immunostaining och moderna avbildningstekniker10,11, har vi utvecklat ett protokoll för att isolera och färga salivkörtlar med en mängd olika antikroppar och cellmarkörer12. Denna video visar detta tillvägagångssätt för extraktion, fixering och färgning av larval SGs från Anopheles gambiae L4 larver för confocal imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbetande av lösningar och verktyg
- Beredning av dissekeringslösning
- För att förbereda dissekeringslösning, tillsätt 2,5 ml 100% etanol till 7,5 ml destillerad H2O i ett 15 plaströr. Vänd röret 3 gånger för att blanda.
OBS: Denna lösning kan förvaras i rumstemperatur i flera veckor.
- För att förbereda dissekeringslösning, tillsätt 2,5 ml 100% etanol till 7,5 ml destillerad H2O i ett 15 plaströr. Vänd röret 3 gånger för att blanda.
- Beredning av 10x fosfatbuffrat saltlösning (PBS) lager
- För att förbereda 10x PBS-lager, tillsätt 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl och 2 g KCl till 800 ml avjoniserat vatten. Blanda med en omrörningsstång på en omrörningsplatta tills de fasta ämnena är helt upplösta. Justera den slutliga volymen till 1 L med renat vatten.
OBS: Denna lösning kan förvaras i rumstemperatur i flera månader.
- För att förbereda 10x PBS-lager, tillsätt 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl och 2 g KCl till 800 ml avjoniserat vatten. Blanda med en omrörningsstång på en omrörningsplatta tills de fasta ämnena är helt upplösta. Justera den slutliga volymen till 1 L med renat vatten.
- Beredning av 1x PBS
- Tillsätt 10 ml 10x PBS till 90 ml H2O i en steril glasflaska. Stäng locket tätt och vänd 3x för att blanda.
OBS: Lösningen kan förvaras vid 4 °C i flera veckor.
- Tillsätt 10 ml 10x PBS till 90 ml H2O i en steril glasflaska. Stäng locket tätt och vänd 3x för att blanda.
- Förberedelse av fixativ.
- Tillsätt 600 μL metanol till 200 μL ättiksyra. Gör lösningen fräsch varje gång.
- Konstruktion av kittplatta (en vävnadskulturskål fylld med silikongummi)
- Blanda komponenterna (1:50) epoxi (1 g) och vatten (50 ml) och häll blandningen i en Petriskål. Vänta tills komponenterna har torkat innan du använder dem.
OBS: När kittplattan är konstruerad kan den användas i flera år.
- Blanda komponenterna (1:50) epoxi (1 g) och vatten (50 ml) och häll blandningen i en Petriskål. Vänta tills komponenterna har torkat innan du använder dem.
2. Körtel dissekering (figur 1A)
- Samla L4-larver i sent stadium (~ 10 dagar efter kläckning; Bild 2) från matningsbrickor med hjälp av en plastöverföringspipett.
OBS: Se denna användbara onlinehandbok för standard mygghållning och larvkultur13.- Placera en kittplatta på scenen i ett dissekerande mikroskop och överför larver på kittplattan.
OBS: När du aliquoting larver för inledande dissekering, Är det bra att överföra ~ 10 larver på bilden på en gång med hjälp av en plastöverföring pipetten.
- Placera en kittplatta på scenen i ett dissekerande mikroskop och överför larver på kittplattan.
- Placera en droppe dissekeringslösning (1:3 EtOH:H2O) på kittplattan, separat från de 10 larverna.
- Använd en plastöverföringspipetter eller engångsglaspipetter för att placera en L4-larva i 25% EtOH-droppen.
- Ta tång (# 5), en i varje hand, och med den icke-dominerande handen, grepp larvens huvud. Använd den dominerande handen, ta tag i larven med tång strax under huvudet och dra försiktigt med minimal konstant kraft, så att huvudet lossnar från resten av kroppen och körtlarna förblir fästa vid huvudet. Kassera kroppsdelen av larvkroppen.
OBS: När du dissekerar, ställ in en pappershandduk i närheten för att samla larvernas slaktkroppar. - Samla huvudet / körtlarna i 1 ml 1x PBS i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör. Använd 1 ml PBS för ~40 dissekerade körtlar med sina bifogade huvuden. Vänta tills huvudena/SGs sjunker till botten av bufferten.
3. Fixering för antikroppsfärgning (figur1B)
- Töm PBS från toppen av mikrocentrifugeröret med hjälp av en glasöverföringspipett, undvik klibbiga myggvävnader och ta bort så mycket av PBS-lösningen som möjligt utan att skada vävnaderna. Ersätt lösningen med 800 μL av en 3:1 blandning av metanol mot glaciär ättiksyra. Placera röret vid 4 °C över natten (12-24 h rekommenderas; 19 h föredras).
- Följande dag dränerar du lösningen och ersätter den med 1 ml kall 100% aceton. Lämna i 90-talet.
- Ta bort acetonen och skölj försiktigt vävnaderna tre gånger med 1 ml 1x PBS varje gång.
OBS: Proverna ska flyta långsamt upp med flödet och sedan falla tillbaka till botten av röret när varje PBS-tillägg är klart.
4. Immunostaining (figur 1B)
- Tillsätt primär antikropp (t.ex. Rab11) vid lämplig utspädning (1:100) i 200 μL av den totala volymen av 1x PBS. Snurra rörinnehållet försiktigt med pipettspets. Inkubera över natten vid 4 °C.
- Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta tre gånger med 1 ml 1x PBS (försiktigt pipettering lösningen in och ut ur pipetten).
- Tillsätt sekundär antikropp (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) vid lämplig utspädning (1:200) i 200 μL av den totala volymen. Snurra rörinnehållet försiktigt med pipettspets. Inkubera vid rumstemperatur i 90 min.
- Tillsätt färgämnen, såsom Nile Red (lipider, 5 μL 1 μg/μL) och/eller Hoechst (DNA, 3 μL av 1 μg/μL), i 200 μL PBS i detta skede. Inkubera vid rumstemperatur i ytterligare 60 min. Tvätta försiktigt tre gånger med 1x PBS.
5. Montering av färgade körtlar för mikroskopi (figur1C)
- Pipett 200 μL av 100% glycerol på en mikroskopbild.
OBS: Eftersom glycerol är trögflytande, lämna pipettspetsen i vätskan tills den når rätt volym. Ingen vävnad krympning observerades när gå rakt in i 100% glycerol. Emellertid, forskare kan gå igenom 30% och 50% glycerol tvättar i rören innan du flyttar proverna till 100% glycerol. - Överför de färgade huvudena (upp till 20 per bild) med de bifogade körtlarna (tillsammans med andra inre strukturer) till mikroskopbilden med en mjuk borste (figur 3A). Sprid ut proverna så att de fördelas jämnt längs glasrutschbanan.
OBS: Vid insättning av körtlar på en täckbild med en borste kan tång användas för att försiktigt orientera SGs så att de alla är orienterade i samma riktning. - Titta under ett dissekerande mikroskop, separera larvhuvudet från körtlarna med två par tång och dra försiktigt de två vävnaderna i motsatta riktningar.
OBS: Eftersom det är utmanande att helt isolera generaldirektoraten, ta helt enkelt bort huvudena, lämna generaldirektoraten och tillhörande interna strukturer. Även om generaldirektoraten förblir associerade med andra vävnader känns de lätt igen när de färgas med Hoechst och andra markörer (figur 3B, C). - Ta bort och kassera huvudena och upprepa separationsprocessen för varje SG.
OBS: När du tar bort huvuden, ställ in en pappershandduk i närheten för att samla dem. - Placera försiktigt ett 1,5 mm tjockt täcksläde på toppen (undvik luftbubblor) och försegla med klart nagellack.
- Förvara vid 4 °C i en ljussäker behållare.
OBS: Förberedda bilder av färgade körtlar kan hållas vid 4 °C i mörker i upp till sex månader till ett år utan några anmärkningsvärda kvalitetsförändringar. Om glycerol börjar läcka när månaderna går, lyft försiktigt täcket och pipetten i mer glycerol för att fylla hål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Salivkörtlar är relativt lätta att dissekera från alla steg 4 larver. Manliga och kvinnliga larver kan särskiljas i slutet av L4 larvstadiet genom en röd rand längs kvinnornas dorsala bröstkorg men inte män (figur 2). Vi observerar också att antennal morfologi är mycket mer utarbetad hos män än hos kvinnliga L4 larver (Figur 2), liknande de skillnader som observerats i denna struktur hos vuxna myggor. Tillsammans med den betydande totala tillväxten under L4-stadiet bildar salivkörtlarna också en lumen under L412. Salivkörtlar isolerade från tidiga L4-steg larver färgade med Hoechst avslöjar proximala och distala lober åtskilda av en smal förträngning(figur 3B, C). Den formande lumen kommer att sträcka sig hela vägen från salivkanalen i den proximala änden (visas inte) genom den distala loben. Den formande lumen kan ses i den immunstained distala salivkörteln hos en mitten till sen L4 larva (figur 4). De apikala domänerna i de sekretoriska cellerna som omger den bilda lumen har intensiv Nile Red färgning (figur 4B, C) suggestiva av mikrovilli-liknande strukturer. Också observerad nära den apikala ytan är Rab11 färgning (Figur 4C,D, pilar). Rab11 lokaliserar till apical återvinning endosomes. Rab11-färgningen som också ackumuleras längs körtelns basala yta är en artefakt på grund av basalmembranets klibbighet. Liknande bakgrund färgning är vanligt med immunstaining av både larv och vuxna salivkörtlar och har misstagits för äkta signal.
Bild 1: Tecknad visualisering av immunstainingprocessen från körtel dissekering till glidberedning. Förkortningar: SGs = salivkörtlar; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; MeOH = metanol; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; Abs = antikroppar; LH = vänster hand; RH = höger hand. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Manliga och kvinnliga L4-steg Anopheles gambaie larver. (A, B) Tidiga L4 larver. (C, D) Sena L4 larver. Det är en betydande tillväxt under L4-etappen. Kvinnor (A, C) har beskrivits ha en särskiljande röd rand ner dorsal bröstkorgen (C; svart pil) som inte finns hos män (B, D), men också deras antenner är mycket mindre utarbetade (frilly) än de av manliga larver från både tidiga och sena L4 (vita pilar i förstorade bilder). Skalningsstaplar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tidiga L4-salivkörtlar. (A) Tidigt L4 kvinnligt larvhuvud med salivkörtlar och andra inre organ fortfarande fastsatta. Salivkörteln beskrivs. Skalstång = 50 μm. (B, C) Isolerade larvkörtlar färgade med Hoechst. b) Sammansmältning av fluorescerande bilder och Nomarski-bilder som visar formen på de proximala och distala lober och den blå Hoechstfärgningen i kärnor. (C)Hoechst fluorescerande bild belyser endast kärnor. Skalstreck i bottenpaneler = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunstained distala L4 salivkörtel. (A) Körtel har färgats med Hoechst (nukleärt DNA, blått) och (B) Nilen röd (membranmarkör, röd); immunstained för Rab11 (apikal återvinning blåsor, grön) (C). (D) Den sammanslagna bilden. Observera att en lumen finns på scenen som visas (B-D). Pilarna i C och D pekar på den förväntade Rab11-färgningen av blåsor nära den apikala ytan som överlappar Nilen Röd-positiv vesikulär färgning i sammanslagningen (vita pilar). Icke-specifik bakgrundsfärgning runt basalytan (asterisker) observeras också, en vanlig typ av bakgrund observeras i larv- och vuxna salivkörtlar. Skalningsstaplar = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs häri anpassades från ett Drosophila SG dissekeringsprotokoll och ett vuxen myggdissektionsprotokoll14,15,16. De flesta markörer trängde dock inte in i källarmembranet (data visas inte) när man använde vuxen dissekering och SG färgningsmetoder. Anpassningar av vuxenprotokollet inkluderade dissekering av körtlarna i en 25% EtOH-lösning, tvättning av körtlarna med en kombination av MeOH och glacial ättiksyra och med en 90 s acetontvätt. I det ursprungliga vuxenprotokollet dissekerades vuxna SGs i 1x PBS14,15,16. Dissekering i en 25% EtOH-lösning hjälpte till att bevara SGs och förhindrade skador under färgningsperioderna. När du utförde den första dissekeringen var det enklast att orientera larvsnämarna med huvudet mot den icke-dominerande handen och ha den dominerande handen försiktigt dra utåt (eftersom larverna rör sig mycket aktivt). Den förbättrade vävnad penetration uppnås genom att tvätta körtlarna med en MeOH: glacial ättiksyra lösning tyder på att lipidhalten i larv SG källare membranet och/eller cellulära plasma membran skiljer sig från den vuxna SG. 90 s aceton tvätt förbättrade klarheten i körtlar för imaging. Även om fixeringsperioden rekommenderades vara minst 19 h (över natten), fungerade längre perioder lika effektivt.
Morfologin hos SGs kan variera mycket beroende på när larverna dissekeras i det 2-dagars långa L4-stadiet. I tidiga L4-dissektioner (dag 1) visas lumen mycket mindre12. I sena L4-dissektioner (andra halvan av dag 2) är lumen stor och cellerna är långsträckta. Vi fann att den optimala perioden för att arbeta med larver var L4; L1-L3 SGs är helt enkelt för små för manuella dissektioner. I imaging resultat, körtlar dissekeras vid mitten till slutet-L4 visade mindre celler blandade med större, sidledslånga celler, särskilt i den distala säcken.
Tidigare rapporter om Anopheles SG-utveckling har gett mycket vägledning för de aktuella studierna. Dessa rapporter har inkluderat illustrationer av dissekerade embryonala och larv SGs17,18, detaljerad mikroskopisk analys av dissekeradekörtlar 19,20och transkriptomiska studier20,21,22. Funktionerna i Anopheles stephensi SG rapporterades under 1950-talet av två olika grupper10,11. Många av larvkörtlarnas morfologiska egenskaper beskrevs, inklusive den övergripande organisationen av SG, de relativa positionerna för distinkta celltyper i organet (kanal, vuxna SG-prekursorer och larvproximala och distala sekretoriskasäckar) 10,11. Båda grupperna rapporterade också ytterligare morfometriska data, inklusive antalet och fördelningen av sekretoriska celler i varje säck och deras kärnstorlek10,11. Rishikesh visade att, liksom Drosophila larval SGs, är larven SG-kromosomerna från Anopheles stephensi polyteniserade10. Dessa viktiga grundläggande översikter beskrivs breda biologiska aspekter av larval Anopheles SGs.
Metoden som beskrivs häri bör vara användbar för att studera inte bara larv SGs av An. gambiae utan kan också gälla för dem som studerar andra myggarter. Faktum är att samma protokoll framgångsrikt har använts (opublicerat) med An. stephensi, en art som ofta studeras i laboratoriet. En begränsning av protokollet är det begränsade antalet antikroppar som specifikt har genererats mot myggproteiner. Även om användning av Drosophila antikroppar för mycket bevarade proteiner har circumnavigated denna begränsning12, fältet kan dra nytta av mer myggprotein-specifika antikroppar. Att förstå larv SG cellulär och molekylärbiologi kan bidra till nya kontroll- eller målstrategier och möjliggöra upptäckten av nya kandidatmålgener för SG-störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Johns Hopkins Malaria Research Institute för tillgång till och uppfödning av an. gambiae larver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
