Summary
Este protocolo presenta un ensayo de captación de aminoácidos radiomarcado, que es útil para evaluar el consumo de aminoácidos en células primarias o en huesos aislados.
Abstract
El desarrollo óseo y la homeostasis dependen de la diferenciación y la actividad de los osteoblastos formadores de hueso. La diferenciación de osteoblastos se caracteriza secuencialmente por la proliferación seguida de la síntesis de proteínas y, en última instancia, la secreción de la matriz ósea. La proliferación y la síntesis de proteínas requieren un suministro constante de aminoácidos. A pesar de esto, se sabe muy poco sobre el consumo de aminoácidos en los osteoblastos. Aquí describimos un protocolo muy sensible que está diseñado para medir el consumo de aminoácidos utilizando aminoácidos radiomarcados. Este método está optimizado para cuantificar los cambios en la absorción de aminoácidos que están asociados con la proliferación o diferenciación de osteoblastos, tratamientos con medicamentos o factores de crecimiento, o diversas manipulaciones genéticas. Es importante destacar que este método se puede utilizar indistintamente para cuantificar el consumo de aminoácidos en líneas celulares cultivadas o células primarias in vitro o en ejes óseos aislados ex vivo. Finalmente, nuestro método se puede adaptar fácilmente para medir el transporte de cualquiera de los aminoácidos, así como la glucosa y otros nutrientes radiomarcados.
Introduction
Los aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen un grupo funcional amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) con una cadena lateral variable que es específica para cada aminoácido. En general, los aminoácidos son bien conocidos como el constituyente básico de la proteína. Más recientemente, se han dilucidado nuevos usos y funciones de los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos individuales pueden metabolizarse para generar metabolitos intermedios que contribuyen a la bioenergética, funcionan como cofactores enzimáticos, regulan las especies reactivas de oxígeno o se utilizan para sintetizar otros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muchos estudios demuestran que el metabolismo de los aminoácidos es crítico para la pluripotencia, proliferación y diferenciación celular en diversos contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Los osteoblastos son células secretoras que producen y secretan la matriz ósea extracelular rica en colágeno tipo 1. Para mantener altas tasas de síntesis de proteínas durante la formación ósea, los osteoblastos exigen un suministro constante de aminoácidos. Para satisfacer esta demanda, los osteoblastos deben adquirir activamente aminoácidos. De acuerdo con esto, estudios recientes revelan la importancia de la absorción de aminoácidos y el metabolismo en la actividad de los osteoblastos y la formación ósea 15,16,17,18,19,20.
Los osteoblastos adquieren aminoácidos celulares de tres fuentes principales: medio extracelular, degradación de proteínas intracelulares y biosíntesis de aminoácidos de novo. Este protocolo se centrará en la evaluación de la absorción de aminoácidos del entorno extracelular. Los métodos más comunes para medir la absorción de aminoácidos se basan en aminoácidos radiomarcados (por ejemplo, 3H o 14C) o marcados con isótopos pesados (por ejemplo, 13C). Los ensayos de isotopómeros pesados pueden analizar la absorción y el metabolismo de aminoácidos de manera más exhaustiva y segura, pero requieren más tiempo y tardan varios días en completarse, ya que se tarda un día en preparar y derivar muestras y varios días en analizarlas en el espectrómetro de masas dependiendo del número de muestras21,22. En comparación, los ensayos de captación de aminoácidos radiomarcados no son informativos sobre el metabolismo posterior, pero son baratos y relativamente rápidos, pudiendo completarse dentro de las 2-3 h desde el inicio del experimento23,24. Aquí, describimos un protocolo básico fácilmente modificable diseñado para evaluar la absorción de aminoácidos radiomarcados en células primarias cultivadas o líneas celulares in vitro o ejes óseos individuales ex vivo. La aplicación de estos dos protocolos puede extenderse a otros aminoácidos radiomarcados y otros tipos de células y tejidos asociados al hueso.
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Protocol
Todos los procedimientos con ratones descritos en este documento fueron aprobados por los Comités de Estudios Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas. El protocolo de radiación fue aprobado por el Comité Asesor de Seguridad Radiológica del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas.
1. Captación de aminoácidos en las células (Protocolo I)
- Placa 5 x 104 células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Células en placa en α-MEM que contienen 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 0,1 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep). Coloque pocillos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones en el paso 1.12. Incubar células en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C con 5% deCO2.
- Cultive las células durante 2-3 días hasta que estén confluentes.
- El día del experimento, prepare las siguientes soluciones: 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4 y tampón Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucosa). Precalentar a 37 °C.
- Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 1 mL de 1x PBS, pH 7.4.
NOTA: Este protocolo también es apropiado para dividir rápidamente células no confluentes. En este caso, es importante normalizar la radiactividad al número absoluto de células o al contenido de ADN. Además, considere aumentar el tamaño de la placa de cultivo o matraz para aumentar el número total de células y los valores de cpm. Es importante determinar esto empíricamente sobre una base individual. - Aspirar 1x PBS y lavar las células una vez con 1 ml de KRH.
- Producir 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-glutamina diluyendo 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamina por 1 ml de KRH.
NOTA: Antes de usar materiales radiactivos, comuníquese con la Oficina de Seguridad Radiológica de su institución de origen para obtener aprobaciones. Todos los procedimientos relacionados con la radiación deben realizarse detrás del escudo de plexiglás. - Incubar células con 0,5 mL de KRH que contengan 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-Glutamina durante 5 min.
- Recoger el medio radiactivo y dispensar en el contenedor de residuos líquidos. Lave las células tres veces brevemente con KRH helado para terminar la reacción. Recoja y deseche todos los lavados en el contenedor de residuos líquidos radiactivos.
- Agregue 1 ml de SDS al 1% a cada pocillo y triture 10 veces para lisar y homogeneizar las células. Transfiera los lisados celulares a tubos de 1,5 ml. Deseche las placas de cultivo celular, las pipetas serológicas y las puntas de pipeta en el contenedor de residuos radiactivos sólidos.
- Centrifugar a >10.000 x g durante 10 min. Transfiera los sobrenadantes a viales de centelleo que contengan 8 ml de la solución de centelleo. Mezclar agitando vigorosamente los viales de centelleo. Desechar los tubos y las puntas de pipeta en un contenedor de residuos radiactivos sólidos.
- Lea la radiactividad en recuentos por minuto (cpm) usando un contador de centelleo. Deseche los viales de centelleo en el contenedor de residuos del vial de centelleo.
- Tripsinizar, resuspender y contar las células de las placas no radiactivas restantes de las células (ver paso 1.1) para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Usando un hemocitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental. Normalizar el cpm desde el paso 1.11 hasta el número de células estimado de las placas no radiactivas.
- Después de completar el experimento, descontamine la campana de cultivo celular, el banco y todos los instrumentos con un aerosol descontaminante de radiactividad. Finalmente, realice pruebas de limpieza para asegurarse de que el área de trabajo esté libre de radiación.
2. Captación de aminoácidos en tejidos óseos recién aislados (Protocolo II)
- Precalentar KRH a 37 °C.
- Eutanasia a un ratón de 3 días de edad y quitar la piel de los brazos. Desarticule el húmero del hombro con unas tijeras y diseccione ambos húmeros. Retire todos los tejidos extemporáneos con un bisturí y fórceps. Retire las epífisis del hueso.
NOTA: Además de los humerios, este protocolo se puede adaptar a fémures, tibias y calvarios neonatales, así como a humerios, fémures y tibias aislados de ratones de 2 y 4 meses de edad (datos no publicados). - Enjuague la médula del hueso y pese los ejes óseos para normalizarlos en el paso 2.14.
- Hervir un húmero en 1x PBS a 100 °C durante 10 min para descelularizar el hueso. El hueso hervido descelularizado se utiliza como control negativo.
NOTA: Como control de calidad, la parafina incrusta los huesos hervidos y no hervidos para las tinciones histológicas para confirmar visualmente que la ebullición fue eficaz en la descelularización del hueso. - Equilibrar ambos húmeros en 1 mL de KRH durante 30 min en la incubadora de cultivo celular a 37 °C.
- Hacer una solución de trabajo de 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginina en KRH diluyendo 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginina por 1 mL KRH.
NOTA: Este protocolo es apropiado para evaluar la absorción de cualquier nutriente radiomarcado que se elija. L-[2,3,4-3 H]-glutamina, L-[14CU]-alanina y L-[2,3-3 H]-prolina han sido probados con resultados similares. Se muestran datos de arginina para resaltar la utilidad de este protocolo.
PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos con radiación deben realizarse detrás del escudo de plexiglás mientras se usa el equipo de protección personal (EPP) adecuado. - Incubar el hueso control experimental y hervido por separado en KRH que contenga 4 μCi/ml de L-[2,3,4-3 H]-arginina durante un máximo de 90 min a 37 °C.
NOTA: Es importante determinar empíricamente los tiempos de incubación para diferentes condiciones, incluida la edad de los ratones, los diferentes elementos esqueléticos y los tipos de aminoácidos radiomarcados mediante la realización de un curso de tiempo. La saturación ocurre principalmente después de aproximadamente 3-4 h. La captación debe evaluarse en un punto temporal en la rabia lineal de la absorción. - Retirar el medio radiactivo y desecharlo en el contenedor de residuos radiactivos líquidos. Lave el húmero tres veces usando 1 ml de KRH para terminar la reacción. Deseche todos los lavados en el contenedor de residuos radiactivos líquidos.
- Transfiera cada hueso a un tubo de 1,5 ml. Añadir 500 μL de tampón RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Deseche las placas de cultivo, las pipetas serológicas y las puntas de pipeta en un recipiente de residuos sólidos radiactivos.
- Homogeneiza el húmero picando 100 veces con tijeras en un tampón RIPA.
- Sonicar (Amplitud: 35%, Pulso 1 s) el hueso homogeneizado resultante durante 10 s.
NOTA: También se sabe que la sonicación produce aerosoles. Los pasos de sonicación se pueden realizar en un gabinete de seguridad biológica. Para reducir la formación de aerosoles, es importante no llenar demasiado los tubos. La sonicación de pequeños volúmenes de muestra puede resultar en una sonicación incompleta o pérdida de muestras debido a la formación de espuma. Si se produce formación de espuma, centrifugar la muestra durante 5 minutos para que se asiente. - Aclarar el lisado por centrifugación durante 10 min a >10.000 x g a temperatura ambiente. Transfiera 200 μL del sobrenadante a viales de centelleo que contengan 8 ml de la solución de centelleo. Mezclar agitando vigorosamente los viales de centelleo. Deseche todos los desechos radiactivos sólidos (por ejemplo, tubos usados, puntas de pipetas, placas, etc.) en el contenedor de desechos radiactivos sólidos.
- Lea la radiactividad (cpm) con el contador de centelleo. Deseche los viales de centelleo usados en el contenedor de residuos radiactivos designado para viales de centelleo.
- Resta el cpm del hueso hervido (valor basal) del cpm del hueso experimental. Normalizar la radiactividad con el peso óseo a partir del paso 2.3.
- Rocíe la campana de cultivo celular, los instrumentos y el banco con descontaminante de radiactividad. Realice pruebas de limpieza para confirmar que el área de trabajo está libre de radiación.
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Representative Results
El transporte de aminoácidos está regulado por muchos transportadores de aminoácidos unidos a la membrana que han sido categorizados en distintos sistemas de transporte basados en numerosas características, incluyendo la especificidad del sustrato, la cinética, así como la dependencia de iones y pH25. Por ejemplo, la absorción de glutamina puede estar mediada por los sistemas de transporte dependientes de Na+ A, ASC, γ+L y N o el Sistema L independiente de Na+. Los sistemas dependientes de Na+ se distinguen por la capacidad de sustituir Li+ por Na+ (Sistema N) o sensibilidad al análogo de aminoácido ácido ácido 2-(metilamino)isobutírico (MeAIB) (Sistema A). El propósito de este experimento fue definir la cantidad de consumo de glutamina atribuible a cada sistema de transporte. La captación de glutamina L-[3,4-3 H] se midió en células ST2 confluentes en KRH normal que contenía 120 mM de NaCl, KRH libre de Na+ que contenía 120 mM de cloruro de colina, KRH normal que contenía 5 mM de MeAIB o KRH libre de Na+ que contenía 120 mM de LiCl. La radiactividad total (recuentos por minuto) se normalizó al número celular. La eliminación de Na+ condujo a una reducción del 90% en la absorción de glutamina. Esto indicó que el Sistema L representa el 10% de la absorción de glutamina, mientras que el 90% de la absorción de glutamina es Na+ dependiente en las células ST2 (Figura 2). La presencia de Li + solo aumentó la absorción de glutamina en un 2% en comparación con la condición libre de Na +, mientras que la MEAIB de 5 mM no afectó la absorción de glutamina. Estos datos indican que la mayor parte de la absorción de glutamina está mediada por los sistemas ASC y γ + L, mientras que el sistema N y el sistema A son responsables de aproximadamente el 2% y el 0% de la absorción de glutamina dependiente de Na+, respectivamente.
Modificamos el Protocolo I para caracterizar la absorción de aminoácidos en los ejes óseos ex vivo. En este experimento seguimos el Protocolo II para caracterizar la cinética de captación de arginina en huesos largos aislados de ratones de 3 días (p3) de edad. Para hacer esto, primero diseccionamos ambos húmeros de ratones p3. Se extirparon las epífisis, se hiló la médula y se pesó cada húmero para normalizarla. El húmero contralateral fue designado como un control negativo y fue hervido para matar la actividad celular. El húmero experimental y hervido se incubaron con 4μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-arginina radiomarcados durante un máximo de 2 h. La absorción de arginina aumentó de manera lineal en el transcurso de este experimento (Figura 3A). A modo de comparación, el húmero hervido no exhibió un aumento dinámico de la absorción de arginina en este experimento, sino que tuvo una radiactividad basal que se atribuye a la adsorción de la sonda en la matriz ósea. La captación de arginina normalizada y corregida se muestra en la Figura 3B.
Figura 1: Flujo de trabajo de los ensayos de captación de aminoácidos radiomarcados. Resumen esquemático de ensayos de captación de aminoácidos in vitro (Protocolo I) y en huesos ex vivo (Protocolo II). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Propiedades cinéticas de la captación de L-[3,4-3 H]-glutamina en ST2 in vitro. (A) Ensayos de captación de L-[3,4-3 H]-glutamina realizados en presencia (+) o ausencia (-) de sodio (Na+), MeAIB o litio (Li+) en células ST2. (B) Porcentaje de contribuciones estimadas del Sistema A, N, L o ASC y γ + L a la absorción de glutamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Captación ex vivo de L-[2,3,4-3 H]-arginina en el húmero neonatal. (A) Captación de L-[2,3,4-3 H]-arginina realizada durante un curso de tiempo de 2 h en húmeros vivos y hervidos aislados de ratones C57BL/6 de 3 días de edad. (B) Captación normalizada de L-[2,3,4-3 H]-arginina con húmero hervido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito en este documento proporciona un enfoque rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos en respuesta a diversas permutaciones experimentales, ya sea in vitro o ex vivo. En comparación con los kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de determinación de glutamina y glutamato), este método es mucho más sensible, más rápido y menos laborioso16,17,25. En nuestro protocolo, evaluamos la absorción en el tampón HEPES de Krebs Ringers. Utilizamos este medio, ya que es una fórmula basal que permite modificaciones rápidas y fáciles para probar una amplia gama de condiciones para caracterizar la absorción de aminoácidos. Por ejemplo, para probar si el sistema de transporte es dependiente de Na+, simplemente podemos reemplazar NaCl con cloruro de colina para hacer KRH libre de Na+. Esta flexibilidad es ventajosa para interrogar los diversos sistemas de transporte que median la absorción de aminoácidos individuales. Los medios de crecimiento basal como alfa-MEM también son apropiados para este ensayo. En este caso, normalmente compramos alfa-MEM que carece del aminoácido individual en cuestión, que se reemplaza con el aminoácido radiomarcado para el experimento. Por ejemplo, para evaluar la captación de glutamina utilizamos alfa-MEM libre de glutamina en células estromales primarias de la médula ósea15. KRH tiene algunas limitaciones debido a su composición simple. KRH no es una opción ideal si el objetivo es estudiar sistemas de transporte activo secundarios como simportadores y antiportadores. Por ejemplo, la absorción de leucina a través de Slc7a5/Slc3a2 se produce a cambio de glutamina. En este caso, la absorción de leucina puede estar subestimada debido a la falta de glutamina en KRH; más bien, el uso de medio alfa-MEM libre de leucina sería preferible en este caso. También es importante tener en cuenta que el uso de un contador Geiger no es obligatorio cuando se trabaja con isótopos 3H. Sin embargo, se recomienda mantener el contador Geiger encendido como cortesía para alertar a las personas de que está trabajando con radiación.
Un control crítico y obligatorio para el segundo protocolo es la ebullición del hueso contralateral. Esto es necesario ya que la matriz ósea puede absorber aminoácidos radiactivos independientemente del transporte facilitado por las células óseas. Al descelularizar el hueso, podemos estimar la cantidad de radiación atrapada por la matriz ósea y usarla como radiactividad basal para normalizar la absorción. Otro control importante es pesar los huesos después de la extirpación de las epífisis y la médula. El peso del hueso se utiliza para normalizar la absorción en relación con el tamaño del eje óseo. Esto es importante ya que el tamaño de los huesos puede variar debido a muchos factores que van desde la variabilidad durante la eliminación de las epífisis hasta mutaciones genéticas que afectan el crecimiento. Un método alternativo es cuantificar el contenido de ADN del eje óseo para la normalización. En nuestra experiencia, la normalización del contenido de ADN es comparable al peso del hueso, pero agrega más pasos relacionados con los materiales radiactivos. Por lo tanto, preferimos normalizar el peso óseo.
Estos protocolos se pueden adaptar a líneas celulares, incluyendo ATDC5, MC3T3, 293 u otras células primarias como osteoblastos calvariales, condrocitos, células estromales de médula ósea, macrófagos de médula ósea y osteoclastos. Además, los protocolos son fácilmente adaptables para evaluar otros isótopos radiactivos (por ejemplo, 14C y 35S), así como diferentes nutrientes, incluidos aminoácidos, glucosa y ácidos grasos. Además, el protocolo II también se puede adaptar a huesos adultos y cultivos de pellets, teniendo en cuenta el ajuste al tiempo de incubación. Aunque este protocolo es altamente adaptable, es importante caracterizar la cinética de las nuevas moléculas marcadas con isótopos o en nuevas líneas celulares antes de realizar experimentos. La cinética de transporte puede variar drásticamente entre diferentes moléculas, diferentes isótopos o diferentes tipos de células.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
El laboratorio Karner cuenta con el apoyo de subvenciones R01 del Instituto Nacional de Salud (AR076325 y AR071967) a C.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
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