Summary

Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

Published: April 13, 2022
doi:

Summary

Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcato, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia nelle cellule primarie che nelle ossa isolate.

Abstract

Lo sviluppo osseo e l’omeostasi dipendono dalla differenziazione e dall’attività degli osteoblasti che formano l’osso. La differenziazione degli osteoblasti è caratterizzata sequenzialmente dalla proliferazione seguita dalla sintesi proteica e, infine, dalla secrezione della matrice ossea. La proliferazione e la sintesi proteica richiedono un costante apporto di aminoacidi. Nonostante questo, si sa molto poco sul consumo di aminoacidi negli osteoblasti. Qui descriviamo un protocollo molto sensibile progettato per misurare il consumo di aminoacidi utilizzando aminoacidi radiomarcati. Questo metodo è ottimizzato per quantificare i cambiamenti nell’assorbimento degli aminoacidi associati alla proliferazione o alla differenziazione degli osteoblasti, ai trattamenti farmacologici o dei fattori di crescita o a varie manipolazioni genetiche. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato in modo intercambiabile per quantificare il consumo di aminoacidi in linee cellulari in coltura o cellule primarie in vitro o in alberi ossei isolati ex vivo. Infine, il nostro metodo può essere facilmente adattato per misurare il trasporto di uno qualsiasi degli amminoacidi, nonché del glucosio e di altri nutrienti radiomarcati.

Introduction

Gli amminoacidi sono composti organici che contengono un gruppo funzionale amminico (-NH2) e carbossilico (-COOH) con una catena laterale variabile specifica per ciascun amminoacido. In generale, gli amminoacidi sono ben noti come costituenti di base delle proteine. Più recentemente, sono stati chiariti nuovi usi e funzioni degli amminoacidi. Ad esempio, i singoli amminoacidi possono essere metabolizzati per generare metaboliti intermedi che contribuiscono alla bioenergetica, funzionano come cofattori enzimatici, regolano le specie reattive dell’ossigeno o sono usati per sintetizzare altri amminoacidi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Molti studi dimostrano che il metabolismo degli aminoacidi è fondamentale per la pluripotenza, la proliferazione e la differenziazione cellulare in vari contesti 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Gli osteoblasti sono cellule secretorie che producono e secernono la matrice ossea extracellulare ricca di collagene di tipo 1. Per sostenere alti tassi di sintesi proteica durante la formazione ossea, gli osteoblasti richiedono un apporto costante di aminoacidi. Per soddisfare questa domanda, gli osteoblasti devono acquisire attivamente aminoacidi. Coerentemente con questo, studi recenti rivelano l’importanza dell’assorbimento e del metabolismo degli aminoacidi nell’attività degli osteoblasti e nella formazione ossea 15,16,17,18,19,20.

Gli osteoblasti acquisiscono aminoacidi cellulari da tre fonti principali: ambiente extracellulare, degradazione intracellulare delle proteine e biosintesi de novo degli aminoacidi. Questo protocollo si concentrerà sulla valutazione dell’assorbimento di aminoacidi dall’ambiente extracellulare. I metodi più comuni per misurare l’assorbimento di aminoacidi si basano su amminoacidi radiomarcati (ad esempio, 3H o 14C) o marcati con isotopi pesanti (ad esempio, 13C). I saggi di isotopomeri pesanti possono analizzare l’assorbimento degli amminoacidi e il metabolismo in modo più approfondito e sicuro, ma richiedono più tempo e richiedono più giorni per essere completati poiché ci vuole un giorno per preparare e derivatizzare i campioni e più giorni per analizzare sullo spettrometro di massa a seconda del numero di campioni21,22. In confronto, i saggi di assorbimento degli aminoacidi radiomarcati non sono informativi sul metabolismo a valle, ma sono economici e relativamente veloci, potendo essere completati entro 2-3 ore dall’inizio dell’esperimento23,24. Qui, descriviamo un protocollo di base facilmente modificabile progettato per valutare l’assorbimento di aminoacidi radiomarcati in cellule primarie in coltura o linee cellulari in vitro o singoli alberi ossei ex vivo. L’applicazione di questi due protocolli può essere estesa ad altri aminoacidi radiomarcati e ad altri tipi cellulari e tessuti associati all’osso.

Protocol

Tutte le procedure sui topi descritte nel presente documento sono state approvate dai comitati di studi sugli animali presso l’Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas. Il protocollo sulle radiazioni è stato approvato dal Comitato consultivo per la sicurezza delle radiazioni presso l’Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas. 1. Assorbimento di aminoacidi nelle cellule (Protocollo I) Piastra 5 x 104 cellule ST2 in cias…

Representative Results

Il trasporto di aminoacidi è regolato da molti trasportatori di aminoacidi legati alla membrana che sono stati classificati in sistemi di trasporto distinti basati su numerose caratteristiche, tra cui la specificità del substrato, la cinetica e la dipendenza da ioni e pH25. Ad esempio, l’assorbimento di glutammina può essere mediato dai sistemi di trasporto Na+-dipendenti A, ASC, γ+L e N o dal sistema Na+-indipendente L. I sistemi Na+-dipendenti si distinguono per la capa…

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce un approccio rapido e sensibile per valutare l’assorbimento di aminoacidi in risposta a varie permutazioni sperimentali sia in vitro che ex vivo. Rispetto ai kit disponibili in commercio (ad esempio, Glutamine and Glutamate Determination Kit), questo metodo è molto più sensibile, più veloce e meno laborioso16,17,25. Nel nostro protocollo, valutiamo l’assorbimento nel buff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il laboratorio Karner è supportato dalle sovvenzioni R01 del National Institute of Health (AR076325 e AR071967) a C.M.K.

Materials

0.25% trypsin Gibco 25200
12-well plate Corning 3513
1mL syringe BD precision 309628
30G Needle BD precision 305106
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi PerkinElmer NET1123001MC
Beckman LS6500 scintillation counter
Calcium chloride Sigma C1016
choline chloride Sigma C7077
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
Dissection Tool Forceps, scissors, scapels
DPBS Gibco 14190
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma E9884
HEPES(1M) Gibco 15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine PerkinElmer NET551250UC
Liquid scintilation vials Sigma Z190535
lithium chloride solution, 8M Sigma L7026
Magnesium chloride Sigma M8266
MEMα Gibco 12561
Microcentrifuge tube, 15mL Biotix 89511-256
NP-40 Sigma 492016
Potassium chloride Sigma P3911
Sodium bicarbonate Sigma S6014
sodium chloride Sigma S9888
Sodium Deoxycholate Sigma D6750
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Sonicator Sonic&Materials VCX130
Tris Base Sigma 648311
Ultima Gold (Scintillation solution) PerkinElmer 6013329
α-(Methylamino)isobutyric acid Sigma M2383

References

  1. Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
  2. Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
  3. Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
  4. Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
  5. Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
  6. Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
  7. Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
  8. Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
  9. Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
  10. Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
  11. Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
  12. Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
  13. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  14. Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
  15. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  16. Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
  17. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  18. Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
  19. Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
  20. Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
  21. Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
  22. Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
  23. Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
  24. Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
  25. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).

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Cite This Article
Shen, L., Karner, C. M. Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts. J. Vis. Exp. (182), e62995, doi:10.3791/62995 (2022).

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