Summary
Este protocolo apresenta um ensaio de captação de aminoácidos radiomarcado, que é útil para avaliar o consumo de aminoácidos em células primárias ou em ossos isolados.
Abstract
O desenvolvimento ósseo e a homeostase dependem da diferenciação e da atividade dos osteoblastos formadores de ossos. A diferenciação de osteoblastos é caracterizada sequencialmente por proliferação seguida de síntese proteica e, finalmente, secreção da matriz óssea. A proliferação e a síntese de proteínas requerem um fornecimento constante de aminoácidos. Apesar disso, muito pouco se sabe sobre o consumo de aminoácidos em osteoblastos. Aqui descrevemos um protocolo muito sensível que é projetado para medir o consumo de aminoácidos usando aminoácidos radiomarcados. Este método é otimizado para quantificar as mudanças na absorção de aminoácidos que estão associadas à proliferação ou diferenciação de osteoblastos, tratamentos com drogas ou fatores de crescimento ou várias manipulações genéticas. É importante ressaltar que este método pode ser usado de forma intercambiável para quantificar o consumo de aminoácidos em linhagens celulares cultivadas ou células primárias in vitro ou em eixos ósseos isolados ex vivo. Finalmente, nosso método pode ser facilmente adaptado para medir o transporte de qualquer um dos aminoácidos, bem como glicose e outros nutrientes radiomarcados.
Introduction
Os aminoácidos são compostos orgânicos que contêm um grupo funcional amino (-NH2) e carboxila (-COOH) com uma cadeia lateral variável que é específica para cada aminoácido. Em geral, os aminoácidos são bem conhecidos como o constituinte básico da proteína. Mais recentemente, novos usos e funções dos aminoácidos foram elucidados. Por exemplo, aminoácidos individuais podem ser metabolizados para gerar metabólitos intermediários que contribuem para a bioenergética, funcionam como cofatores enzimáticos, regulam espécies reativas de oxigênio ou são usados para sintetizar outros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muitos estudos demonstram que o metabolismo de aminoácidos é crítico para a pluripotência, proliferação e diferenciação celular em vários contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Os osteoblastos são células secretoras que produzem e secretam a rica matriz óssea extracelular rica em colágeno tipo 1. Para sustentar altas taxas de síntese de proteínas durante a formação óssea, os osteoblastos exigem um suprimento constante de aminoácidos. Para atender a essa demanda, os osteoblastos devem adquirir ativamente aminoácidos. Consistente com isso, estudos recentes revelam a importância da absorção e metabolismo de aminoácidos na atividade dos osteoblastos e na formação óssea 15,16,17,18,19,20.
Os osteoblastos adquirem aminoácidos celulares de três fontes principais: meio extracelular, degradação de proteínas intracelulares e biossíntese de aminoácidos de novo. Este protocolo se concentrará na avaliação da absorção de aminoácidos do ambiente extracelular. Os métodos mais comuns para medir a absorção de aminoácidos dependem de aminoácidos marcados radiomarcados (por exemplo, 3H ou 14C) ou isotopos pesados (por exemplo, 13C). Ensaios pesados de isotopômeros podem analisar a absorção e o metabolismo de aminoácidos de forma mais completa e segura, mas são mais demorados, levando vários dias para serem concluídos, pois leva um dia para preparar e derivar amostras e vários dias para analisar no espectrômetro de massa, dependendo do número de amostras21,22. Em comparação, os ensaios de captação de aminoácidos radiomarcados não são informativos sobre o metabolismo a jusante, mas são baratos e relativamente rápidos, podendo ser concluídos dentro de 2-3 h a partir do início do experimento23,24. Aqui, descrevemos um protocolo básico facilmente modificável projetado para avaliar a captação de aminoácidos radiomarcados em células primárias cultivadas ou linhagens celulares in vitro ou eixos ósseos individuais ex vivo. A aplicação desses dois protocolos pode ser estendida a outros aminoácidos radiomarcados e outros tipos de células e tecidos associados ao osso.
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Protocol
Todos os procedimentos de camundongos aqui descritos foram aprovados pelos Comitês de Estudos Animais do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas. O protocolo de radiação foi aprovado pelo Comitê Consultivo de Segurança de Radiação do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas.
1. Absorção de aminoácidos nas células (Protocolo I)
- Placa 5 x 104 células ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços. Células de placa em α-MEM contendo 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 0,1 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep). Placas de poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações na etapa 1.12. Incubar células em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C com 5% de CO2.
- Cultive as células por 2-3 dias até ficarem confluentes.
- No dia do experimento, preparar as seguintes soluções: 1x Fosfato Tamponado Salino (PBS), pH 7,4 e Krebs Ringers HEPES (KRH) tamponamento, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glicose). Pré-aqueça a 37 °C.
- Aspirar o meio e lavar as células duas vezes com 1 mL de 1x PBS, pH 7,4.
NOTA: Este protocolo também é apropriado para a divisão rápida de células não confluentes. Neste caso, é importante normalizar a radioatividade para o número absoluto de células ou conteúdo de DNA. Além disso, considere aumentar o tamanho da placa de cultura ou do frasco para aumentar o número total de células e os valores de cpm. Isso é importante para determinar empiricamente em uma base individual. - Aspirar 1x PBS e lavar as células uma vez com 1 mL de KRH.
- Fazer 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-Glutamina meio de trabalho diluindo 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamina por 1 mL de KRH.
NOTA: Antes de usar materiais radioativos, entre em contato com o Escritório de Segurança de Radiação em sua instituição de origem para obter aprovações. Todos os procedimentos relacionados à radiação devem ser realizados atrás do escudo de plexiglass. - Incubar células com 0,5 mL de KRH contendo 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-Glutamina por 5 min.
- Recolher o meio radioactivo e dispensar no recipiente de resíduos líquidos. Lave as células três vezes brevemente com KRH gelado para terminar a reação. Recolha e descarte todas as lavagens no recipiente de resíduos líquidos radioactivos.
- Adicione 1 mL de SDS de 1% a cada poço e triture 10x para lisar e homogeneizar as células. Transfira os lisados celulares para tubos de 1,5 mL. Descarte placas de cultura celular, pipetas sorológicas e pontas de pipeta no recipiente de resíduos radioativos sólidos.
- Centrífuga a >10.000 x g durante 10 min. Transfira os sobrenadantes para frascos para injetáveis de cintilação contendo 8 ml da solução de cintilação. Misture agitando vigorosamente os frascos para injetáveis de cintilação. Descarte tubos e pontas de pipeta em recipiente de resíduos radioativos sólidos.
- Leia a radioatividade em contagens por minuto (cpm) usando um contador de cintilação. Rejeitar frascos para injetáveis de cintilação no recipiente de resíduos de frascos para injetáveis de cintilação.
- Tripsinar, ressuspender e contar as células das restantes placas não radioactivas de células (ver passo 1.1) para estimar o número de células nas culturas radioactivas lisadas. Usando um hemocitômetro, conte o número de células por poço não radioativo para cada condição experimental. Normalize o cpm da etapa 1.11 para o número estimado de células das placas não radioativas.
- Após a conclusão do experimento, descontaminar o exaustor de cultura celular, a bancada e todos os instrumentos com um spray descontaminante de radioatividade. Finalmente, realize testes de limpeza para garantir que a área de trabalho esteja livre de radiação.
2. Absorção de aminoácidos em tecidos ósseos recém-isolados (Protocolo II)
- Pré-aqueça KRH a 37 °C.
- Eutanasie um rato de 3 dias de idade e remova a pele dos braços. Desarticule o úmero do ombro usando uma tesoura e disseque os dois úmeros. Remova todos os tecidos extemporâneos usando um bisturi e fórceps. Remova as epífises do osso.
NOTA: Além dos úmeros, este protocolo pode ser adaptado para fêmures, tíbias e calvárias neonatais, bem como úmeros, fêmures e tíbias isolados de camundongos de 2 e 4 meses de idade (dados não publicados). - Lavar a medula do osso e pesar as hastes ósseas para normalizar na etapa 2.14.
- Ferva um úmero em 1x PBS a 100 °C por 10 min para descelularizar o osso. O osso fervido descelularizado é usado como um controle negativo.
NOTA: Como controle de qualidade, a parafina incorpora os ossos cozidos e não fervidos para coloração histológica para confirmar visualmente que a ebulição foi eficaz na descelularização do osso. - Equilibrar ambos os úmeros em 1 mL de KRH por 30 min na incubadora de cultura celular a 37 °C.
- Fazer uma solução de trabalho de 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginina em KRH diluindo 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- estoque de arginina por 1 mL de KRH.
NOTA: Este protocolo é apropriado para avaliar a absorção de qualquer nutriente radiomarcado que seja escolhido. L-[2,3,4-3 H]-glutamina, L-[14CU]-alanina e L-[2,3-3 H]-prolina foram testados com resultados semelhantes. Os dados de arginina são mostrados para destacar a utilidade deste protocolo.
ATENÇÃO: Todos os procedimentos que utilizam radiação devem ser realizados atrás do escudo de plexiglass enquanto se utiliza equipamento de proteção individual (EPI) adequado. - Incubar o osso controle experimental e fervido separadamente em KRH contendo 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginina por até 90 min a 37 °C.
NOTA: É importante determinar empiricamente os tempos de incubação para diferentes condições, incluindo a idade dos camundongos, diferentes elementos esqueléticos e os tipos de aminoácidos radiomarcados, realizando um curso de tempo. A saturação ocorre principalmente após aproximadamente 3-4 h. A captação deve ser avaliada em um ponto de tempo na raiva linear da absorção. - Remova o meio radioativo e descarte no recipiente de resíduos radioativos líquidos. Lave o úmero três vezes usando 1 mL gelado de KRH para encerrar a reação. Descarte todas as lavagens no recipiente de resíduos radioativos líquidos.
- Transfira cada osso para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 500 μL de tampão RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Descarte as placas de cultura, pipetas sorológicas e pontas de pipeta em um recipiente de resíduos sólidos radioativos.
- Homogeneize o úmero cortando 100 vezes com uma tesoura em um tampão RIPA.
- Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) o osso homogeneizado resultante por 10 s.
NOTA: Sonication também é conhecido por produzir aerossóis. As etapas de sonicação podem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica. Para reduzir a formação de aerossóis, é importante não encher demais os tubos. Sonicação de pequenos volumes de amostra pode resultar em sonicação incompleta ou perda de amostra devido à formação de espuma. Se ocorrer formação de espuma, centrifugar a amostra durante 5 minutos para assentar. - Clarificar o lisado por centrifugação durante 10 min a >10.000 x g à temperatura ambiente. Transferir 200 μL do sobrenadante para frascos para frascos de cintilação contendo 8 ml da solução de cintilação. Misture agitando vigorosamente os frascos para injetáveis de cintilação. Rejeitar todos os resíduos radioactivos sólidos (por exemplo, tubos usados, pontas de pipeta, placas, etc.) no contentor de resíduos radioactivos sólidos.
- Leia a radioatividade (cpm) usando o contador de cintilação. Rejeitar frascos para injetáveis de cintilação utilizados no recipiente de resíduos radioativos designado para frascos para frascos de cintilação.
- Subtraia o cpm do osso fervido (valor basal) do cpm do osso experimental. Normalize a radioatividade com o peso ósseo a partir da etapa 2.3.
- Pulverize o exaustor de cultura celular, os instrumentos e a bancada com descontaminante de radioatividade. Realize testes de limpeza para confirmar que a área de trabalho está livre de radiação.
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Representative Results
O transporte de aminoácidos é regulado por muitos transportadores de aminoácidos ligados à membrana que foram categorizados em sistemas de transporte distintos com base em inúmeras características, incluindo especificidade do substrato, cinética, bem como dependência de íons e pH25. Por exemplo, a absorção de glutamina pode ser mediada pelos sistemas de transporte dependentes de Na+ A, ASC, γ+L e N ou pelo Sistema L independente de Na+. Os sistemas dependentes de Na+ distinguem-se pela capacidade de substituir Li+ por Na+ (Sistema N) ou sensibilidade ao análogo de aminoácidos ácido 2-(metilamino)isobutírico (MeAIB) (Sistema A). O objetivo deste experimento foi definir a quantidade de consumo de glutamina atribuível a cada sistema de transporte. A captação de glutamina L-[3,4-3H] foi medida em células ST2 confluentes em KRH normal contendo 120 mM de NaCl, Na+ livre de KRH contendo 120 mM de cloreto de colina, KRH normal contendo 5 mM de MeAIB ou Na+ KRH livre contendo 120 mM de LiCl. A radioatividade total (contagens por minuto) foi normalizada para o número de células. A remoção de Na+ levou a uma redução de 90% na absorção de glutamina. Isso indicou que o Sistema L é responsável por 10% da absorção de glutamina, enquanto 90% da absorção de glutamina é dependente de Na+ nas células ST2 (Figura 2). A presença de Li+ apenas aumentou a absorção de glutamina em 2% em comparação com a condição livre de Na+, enquanto 5 mM MEAIB não afetou a absorção de glutamina. Esses dados indicam que a maior parte da captação de glutamina é mediada pelos Sistemas ASC e γ + L, enquanto o Sistema N e o Sistema A são responsáveis por aproximadamente 2% e 0% da absorção de glutamina dependente de Na+, respectivamente.
Modificamos o Protocolo I para caracterizar a captação de aminoácidos em eixos ósseos ex vivo. Neste experimento seguimos o Protocolo II para caracterizar a cinética de captação de arginina em ossos longos isolados de camundongos de 3 dias de idade (p3). Para fazer isso, primeiro dissecamos os dois úmeros de camundongos p3. As epífises foram removidas, a medula foi girada para fora e cada úmero foi pesado para normalização. O úmero contralateral foi designado como controle negativo e fervido para matar a atividade celular. Os úmeros experimentais e cozidos foram então incubados com arginina radiomarcada com 4μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginina por até 2 h. A captação de arginina aumentou de forma linear ao longo deste experimento (Figura 3A). Para comparação, os úmeros cozidos não apresentaram um aumento dinâmico da captação de arginina neste experimento, mas sim uma radioatividade basal que é atribuída à adsorção da sonda na matriz óssea. A captação de arginina normalizada e corrigida é mostrada na Figura 3B.
Figura 1: Fluxo de trabalho dos ensaios de absorção de aminoácidos radiomarcados. Visão geral esquemática dos ensaios de absorção de aminoácidos in vitro (Protocolo I) e in bones ex vivo (Protocolo II). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Propriedades cinéticas da captação de L-[3,4-3 H]-glutamina em ST2 in vitro. (A) Ensaios de captação de L-[3,4-3H]-glutamina realizados na presença (+) ou ausência (-) de sódio (Na+), MeAIB ou lítio (Li+) em células ST2. (B) Porcentagem das contribuições estimadas do Sistema A, N, L ou ASC e γ + L para a absorção de glutamina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Captação ex vivo de L-[2,3,4-3 H]-arginina em úmeros neonatais. (A) Captação de L-[2,3,4-3 H]-Arginina realizada ao longo de um curso de tempo de 2 h em úmeros vivos e cozidos isolados de camundongos C57BL/6 de 3dias de idade. (B) Captação normalizada de L-[2,3,4-3 H]-arginina com úmeros cozidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito fornece uma abordagem rápida e sensível para avaliar a absorção de aminoácidos em resposta a várias permutações experimentais in vitro ou ex vivo. Quando comparado aos kits comercialmente disponíveis (por exemplo, Kit de Determinação de Glutamina e Glutamato), esse método é muito mais sensível, mais rápido e menos trabalhoso16,17,25. Em nosso protocolo, avaliamos a captação no buffer Krebs Ringers HEPES. Utilizamos este meio, pois é uma fórmula basal que permite modificações rápidas e fáceis para testar uma gama diversificada de condições para caracterizar a absorção de aminoácidos. Por exemplo, para testar se o sistema de transporte é dependente de Na +, podemos simplesmente substituir NaCl por cloreto de colina para tornar o KRH livre de Na+. Esta flexibilidade é vantajosa para interrogar os vários sistemas de transporte que mediam a absorção de aminoácidos individuais. Meios de crescimento basais, como alfa-MEM, também são apropriados para este ensaio. Neste caso, normalmente compramos alfa-MEM sem o aminoácido individual em questão, que é substituído pelo aminoácido radiomarcado para o experimento. Por exemplo, para avaliar a absorção de glutamina, utilizamos alfa-MEM livre de glutamina em células estromais primárias da medula óssea15. KRH tem algumas limitações devido à sua composição simples. O KRH não é uma opção ideal se o objetivo for estudar sistemas de transporte ativos secundários, como simcarregadores e antiportadores. Por exemplo, a captação de leucina através de Slc7a5/Slc3a2 ocorre em troca de glutamina. Neste caso, a captação de leucina pode estar subestimada devido à falta de glutamina na KRH; em vez disso, o uso de meio alfa-MEM livre de leucina seria preferível neste caso. Também é importante notar que o uso de um contador Geiger não é obrigatório quando se trabalha com o isótopo 3H. No entanto, é aconselhável manter o contador Geiger ligado como uma cortesia para alertar as pessoas de que você está trabalhando com radiação.
Um controle crítico e obrigatório para o segundo protocolo é a ebulição do osso contralateral. Isso é necessário, pois a matriz óssea pode absorver aminoácidos radioativos independentemente do transporte facilitado pelas células ósseas. Ao descelularizar o osso, podemos estimar a quantidade de radiação aprisionada pela matriz óssea e usá-la como radioatividade basal para normalizar a absorção. Outro controle importante é pesar os ossos após a remoção das epífises e da medula. O peso do osso é usado para normalizar a absorção em relação ao tamanho do eixo ósseo. Isso é importante, pois o tamanho dos ossos pode variar devido a muitos fatores que vão desde a variabilidade durante a remoção das epífises até mutações genéticas que afetam o crescimento. Um método alternativo é quantificar o conteúdo de DNA da diáfise óssea para normalização. Em nossa experiência, a normalização do conteúdo de DNA é comparável ao peso ósseo, mas adiciona mais etapas que lidam com materiais radioativos. Assim, preferimos normalizar para o peso ósseo.
Esses protocolos podem ser adaptados a linhagens celulares, incluindo ATDC5, MC3T3, 293 ou outras células primárias, como osteoblastos calvariais, condrócitos, células estromais da medula óssea, macrófagos da medula óssea e osteoclastos. Além disso, os protocolos são facilmente adaptáveis para avaliar outros isótopos radioativos (por exemplo, 14C e 35S), bem como diferentes nutrientes, incluindo aminoácidos, glicose e ácidos graxos. Além disso, o protocolo II também pode ser adaptado para culturas de ossos adultos e pellets, com a consideração de ajuste ao tempo de incubação. Embora este protocolo seja altamente adaptável, é importante caracterizar a cinética das novas moléculas marcadas com isótopos ou em novas linhagens celulares antes de realizar experimentos. A cinética de transporte pode variar drasticamente entre diferentes moléculas, diferentes isótopos ou diferentes tipos de células.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações.
Acknowledgments
O laboratório Karner é apoiado por subsídios R01 do Instituto Nacional de Saúde (AR076325 e AR071967) para C.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
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