Summary
Detta protokoll presenterar en radiomärkt aminosyraupptagsanalys, vilket är användbart för att utvärdera aminosyraförbrukning antingen i primära celler eller i isolerade ben.
Abstract
Benutveckling och homeostas är beroende av differentiering och aktivitet av benbildande osteoblaster. Osteoblastdifferentiering kännetecknas sekventiellt av proliferation följt av proteinsyntes och slutligen benmatrissekretion. Proliferation och proteinsyntes kräver en konstant tillförsel av aminosyror. Trots detta är mycket lite känt om aminosyraförbrukning i osteoblaster. Här beskriver vi ett mycket känsligt protokoll som är utformat för att mäta aminosyraförbrukning med hjälp av radiomärkta aminosyror. Denna metod är optimerad för att kvantifiera förändringar i aminosyraupptag som är associerade med osteoblastproliferation eller differentiering, läkemedels- eller tillväxtfaktorbehandlingar eller olika genetiska manipulationer. Viktigt är att denna metod kan användas omväxlande för att kvantifiera aminosyraförbrukning i odlade cellinjer eller primära celler in vitro eller i isolerade benaxlar ex vivo. Slutligen kan vår metod enkelt anpassas för att mäta transporten av någon av aminosyrorna samt glukos och andra radiomärkta näringsämnen.
Introduction
Aminosyror är organiska föreningar som innehåller en amino (-NH2) och karboxyl (-COOH) funktionella grupper med en variabel sidokedja som är specifik för varje aminosyra. I allmänhet är aminosyror välkända som den grundläggande beståndsdelen i protein. På senare tid har nya användningsområden och funktioner hos aminosyror belysts. Till exempel kan enskilda aminosyror metaboliseras för att generera mellanliggande metaboliter som bidrar till bioenergetik, fungerar som enzymatiska kofaktorer, reglerar reaktiva syrearter eller används för att syntetisera andra aminosyror 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Många studier visar att aminosyrametabolism är avgörande för cellpluripotens, proliferation och differentiering i olika sammanhang 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblaster är sekretoriska celler som producerar och utsöndrar kollagentyp 1-rik extracellulär benmatris. För att upprätthålla höga proteinsynteshastigheter under benbildning kräver osteoblaster en konstant tillförsel av aminosyror. För att möta denna efterfrågan måste osteoblaster aktivt förvärva aminosyror. I överensstämmelse med detta avslöjar nyligen genomförda studier vikten av aminosyraupptag och metabolism vid osteoblastaktivitet och benbildning 15,16,17,18,19,20.
Osteoblaster förvärvar cellulära aminosyror från tre huvudkällor: extracellulär miljö, intracellulär proteinnedbrytning och de novo aminosyrabiosyntes. Detta protokoll kommer att fokusera på utvärdering av aminosyraupptag från extracellulär miljö. De vanligaste metoderna för att mäta aminosyraupptag är beroende av antingen radiomärkta (t.ex. 3H eller 14C) eller tunga isotopmärkta (t.ex. 13C) aminosyror. Tunga isotopomeranalyser kan analysera aminosyraupptag och metabolism mer noggrant och säkert men är mer tidskrävande att ta flera dagar att slutföra eftersom det tar en dag att förbereda och härleda prover och flera dagar att analysera på masspektrometern beroende på antalet prover21,22. Som jämförelse är radiomärkta aminosyraupptagsanalyser inte informativa om nedströms metabolism men är billiga och relativt snabba och kan slutföras inom 2-3 timmar från experimentets början23,24. Här beskriver vi ett lätt modifierbart grundprotokoll utformat för att utvärdera radiomärkt aminosyraupptag i odlade primära celler eller cellinjer in vitro eller enskilda benaxlar ex vivo. Tillämpningen av dessa två protokoll kan utvidgas till andra radiomärkta aminosyror och andra benassocierade celltyper och vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musprocedurer som beskrivs häri godkändes av djurstudiekommittéerna vid University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas. Strålningsprotokollet godkändes av strålsäkerhetskommittén vid University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas.
1. Aminosyraupptag i celler (protokoll I)
- Platta 5 x 104 ST2-celler i varje brunn i en 12-brunns vävnadsodlingsplatta. Plattceller i α-MEM innehållande 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 0,1 μg / ml streptomycin (Pen / Strep). Platta extra brunnar av celler för att kvantifiera cellantalet per villkor för normaliseringarna i steg 1.12. Inkubera celler i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 %CO2.
- Odla cellerna i 2-3 dagar tills de är sammanflytande.
- På experimentdagen, förbered följande lösningar: 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 och Krebs Ringers HEPES (KRH) buffert, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glukos). Förvärm till 37 °C.
- Aspirera mediet och tvätta cellerna två gånger med 1 ml 1x PBS, pH 7,4.
OBS: Detta protokoll är också lämpligt för att snabbt dela icke-konfluenta celler. I detta fall är det viktigt att normalisera radioaktiviteten till antingen absolut cellnummer eller DNA-innehåll. Överväg dessutom att öka storleken på odlingsplattan eller kolven för att öka det totala cellantalet och cpm-värdena. Detta är viktigt att bestämma empiriskt på individuell basis. - Aspirera 1x PBS och tvätta cellerna en gång med 1 ml KRH.
- Gör 4 μCi / ml L-[3,4-3 H] -glutaminbearbetningsmedium genom att späda 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H] -glutaminstam per 1 ml KRH.
OBS: Innan du använder radioaktiva ämnen, kontakta strålsäkerhetsbyrån vid din heminstitution för att få godkännanden. Alla åtgärder i samband med strålning ska utföras bakom plexiglasskärmen. - Inkubera celler med 0,5 ml KRH innehållande 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-glutaminarbetsmedier i 5 minuter.
- Samla upp det radioaktiva mediet och dosera i behållaren för flytande avfall. Tvätta cellerna tre gånger kort med iskall KRH för att avsluta reaktionen. Samla och kassera alla tvättar i behållaren för radioaktivt flytande avfall.
- Tillsätt 1 ml 1% SDS till varje brunn och triturate 10x för att lysera och homogenisera cellerna. Överför celllysaterna till 1,5 ml rör. Kassera cellodlingsplattor, serologiska pipetter och pipettspetsar i behållaren för fast radioaktivt avfall.
- Centrifugera vid >10 000 x g i 10 min. Överför supernatanterna till scintillationsflaskor som innehåller 8 ml scintillationslösning. Blanda genom att skaka scintillationsflaskorna kraftigt. Kassera rör och pipettspetsar i fast radioaktivt avfall.
- Läs radioaktivitet i antal per minut (cpm) med hjälp av en Scintillation-räknare. Kassera scintillationsflaskor i scintillationsflaskans avfallsbehållare.
- Trypsinisera, återuppliva och räkna cellerna från de återstående icke-radioaktiva cellplattorna (se steg 1.1) för att uppskatta antalet celler i de lyserade, radioaktiva kulturerna. Använd en hemocytometer, räkna antalet celler per icke-radioaktiv brunn för varje experimentellt tillstånd. Normalisera cpm från steg 1.11 till det uppskattade cellantalet från de icke-radioaktiva plattorna.
- Efter avslutat experiment, dekontaminera cellodlingshuven, bänken och alla instrument med en radioaktivitetsdekontaminantspray. Slutligen utför torktester för att säkerställa att arbetsområdet är strålningsfritt.
2. Aminosyraupptag i nyligen isolerade benvävnader (protokoll II)
- Förvärm KRH till 37 °C.
- Avliva en 3 dagar gammal mus och ta bort huden på armarna. Disartikulera humeri från axeln med sax och dissekera ut båda humeri. Ta bort alla extemporevävnader med en skalpell och pincett. Ta bort epifyserna från benet.
OBS: Förutom humerii kan detta protokoll anpassas till neonatal femora, tibiae och calvariae samt humerii, femora och tibiae isolerade från 2- och 4 månader gamla möss (opublicerade data). - Spola ut märg från benet och väg benaxlarna för att normaliseras i steg 2.14.
- Koka en humerus i 1x PBS vid 100 °C i 10 min för att decellularisera benet. Det decellulariserade kokta benet används som en negativ kontroll.
OBS: Som en kvalitetskontroll bäddar paraffin in de kokta och icke-kokta benen för histologiska fläckar för att visuellt bekräfta att kokning var effektiv vid decellularisering av benet. - Balansera båda humerierna i 1 ml KRH i 30 minuter i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C.
- Gör en arbetslösning på 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-arginin i KRH genom att späda ut 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Argininstam per 1 ml KRH.
OBS: Detta protokoll är lämpligt för att utvärdera upptaget av vilket radiomärkt näringsämne som väljs. L-[2,3,4-3 H]-glutamin, L-[14CU]-alanin och L-[2,3-3 H]-prolin har testats med liknande resultat. Arginindata visas för att markera nyttan av detta protokoll.
VARNING: Alla procedurer som använder strålning måste utföras bakom plexiglasskärmen med lämplig personlig skyddsutrustning (PPE). - Inkubera både experimentellt och kokt kontrollben separat i KRH innehållande 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-arginin i upp till 90 min vid 37 °C.
OBS: Det är viktigt att empiriskt bestämma inkubationstiderna för olika tillstånd inklusive mössens ålder, olika skelettelement och typerna av radiomärkta aminosyror genom att utföra en tidskurs. Mättnad sker oftast efter cirka 3-4 timmar. Upptaget bör utvärderas vid en tidpunkt i det linjära upptaget av upptag. - Ta bort det radioaktiva mediet och kasta det i behållaren för flytande radioaktivt avfall. Tvätta humeri tre gånger med iskall 1 ml KRH för att avsluta reaktionen. Kassera alla tvättar i behållaren för flytande radioaktivt avfall.
- Överför varje ben till ett 1,5 ml rör. Tillsätt 500 μL RIPA-buffert [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (w/v); 0,1% SDS (w/v)]. Kassera odlingsplattorna, serologiska pipetterna och pipettspetsarna i en behållare för radioaktivt fast avfall.
- Homogenisera humeri genom att hugga 100 gånger med sax i en RIPA-buffert.
- Sonicate (Amplitud: 35%, Puls 1 s) det resulterande homogeniserade benet för 10 s.
OBS: Ultraljudsbehandling är också känd för att producera aerosoler. Ultraljudsbehandling steg kan utföras i en biologisk säkerhet skåp. För att minska aerosolbildningen är det viktigt att inte överfylla rören. Ultraljudsbehandling av små provvolymer kan resultera i ofullständig ultraljudsbehandling eller provförlust på grund av skumning. Om skumbildning uppstår, centrifugera provet i 5 minuter för att sedimentera. - Klargör lysatet genom centrifugering i 10 min vid >10 000 x g vid rumstemperatur. Överför 200 μl av supernatanten till scintillationsflaskor som innehåller 8 ml scintillationslösning. Blanda genom att skaka scintillationsflaskorna kraftigt. Kassera allt fast radioaktivt avfall (t.ex. använda rör, pipettspetsar, plattor etc.) i behållaren för fast radioaktivt avfall.
- Läs radioaktivitet (cpm) med hjälp av Scintillation-räknaren. Kassera använda scintillationsflaskor i behållaren för radioaktivt avfall som är avsedd för injektionsflaskor med scintillation.
- Subtrahera cpm för kokt ben (basalvärde) från cpm av experimentellt ben. Normalisera radioaktiviteten med benvikt från steg 2.3.
- Spraya cellodlingshuven, instrumenten och bänken med radioaktivitetsdekontaminant. Utför torktester för att bekräfta att arbetsområdet är strålningsfritt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aminosyratransport regleras av många membranbundna aminosyratransportörer som har kategoriserats i distinkta transportsystem baserat på många egenskaper, inklusive substratspecificitet, kinetik samt jon- och pH-beroende25. Till exempel kan glutaminupptag förmedlas av de Na+-beroende transportsystemen A, ASC, γ+L och N eller det Na+-oberoende systemet L. De Na+-beroende systemen kännetecknas av förmågan att ersätta Li+ med Na+ (System N) eller känslighet för aminosyraanalogen 2-(metylamino)isosmörsyra (MeAIB) (System A). Syftet med detta experiment var att definiera mängden glutaminförbrukning hänförlig till varje transportsystem. L-[3,4-3 H] glutaminupptag mättes i sammanflytande ST2-celler i normal KRH innehållande 120 mM NaCl, Na+ fri KRH innehållande 120 mM Kolinklorid, normal KRH innehållande 5 mM MeAIB eller Na+ fri KRH innehållande 120 mM LiCl. Total radioaktivitet (antal per minut) normaliserades till cellnummer. Na + borttagning ledde till 90% minskning av glutaminupptaget. Detta indikerade att System L står för 10% av glutaminupptaget medan 90% av glutaminupptaget är Na + beroende av ST2-celler (Figur 2). Närvaron av Li+ ökade endast glutaminupptaget med 2% jämfört med det Na+ fria tillståndet medan 5 mM MEAIB inte påverkade glutaminupptaget. Dessa data indikerar att majoriteten av glutaminupptaget förmedlas av system ASC och γ + L medan system N och system A står för ungefär 2% respektive 0% av Na +-beroende glutaminupptag.
Vi modifierade protokoll I för att karakterisera aminosyraupptag i benaxlar ex vivo. I detta experiment följde vi protokoll II för att karakterisera argininkall upptagskinetik i isolerade långa ben från 3-dagars gamla (p3) möss. För att göra detta dissekerade vi först båda humeri från p3-möss. Epifesserna avlägsnades och märgen snurrades ut och varje humerus vägdes för normalisering. Den kontralaterala humerusen betecknades som en negativ kontroll och kokades för att döda cellulär aktivitet. Den experimentella och kokta humeri inkuberades sedan med radiomärkt 4μCi / ml L-[2,3,4-3 H] -arginin i upp till 2 timmar. Argininupptaget ökade linjärt under loppet av detta experiment (figur 3A). Som jämförelse uppvisade den kokta humeri inte en dynamisk ökning av argininupptag i detta experiment, utan hade snarare en basal radioaktivitet som tillskrivs adsorption av sonden i benmatrisen. Det normaliserade och korrigerade argininupptaget visas i figur 3B.
Figur 1: Arbetsflöde för radiomärkta aminosyraupptagsanalyser. Schematisk översikt över aminosyraupptagsanalyser in vitro (protokoll I) och i ben ex vivo (protokoll II). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kinetiska egenskaper hos L-[3,4-3 H]-glutaminupptag vid ST2 in vitro. (A) L-[3,4-3 H]-Glutaminupptagsanalyser utförda i närvaro (+) eller frånvaro (-) av natrium (Na+), MeAIB eller litium (Li+) i ST2-celler. (B) Procentandel av uppskattade bidrag från system A, N, L eller ASC och γ + L till glutaminupptag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ex vivo L-[2,3,4-3 H]-Argininupptag i neonatal humeri. ( A) L-[2,3,4-3 H]-argininupptag utfört under en tidsförlopp på 2 timmar i levande och kokt humeri isolerade från 3 dagar gamla C57BL/6 möss. (B) Normaliserat L-[2,3,4-3 H]-argininupptag med kokt humeri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs häri ger ett snabbt och känsligt tillvägagångssätt för att utvärdera aminosyraupptag som svar på olika experimentella permutationer antingen in vitro eller ex vivo. Jämfört med kommersiellt tillgängliga kit (t.ex. glutamin och glutamat bestämning kit) är denna metod mycket känsligare, snabbare och mindre arbetsintensiv16,17,25. I vårt protokoll utvärderar vi upptag i Krebs Ringers HEPES-buffert. Vi använder detta medium eftersom det är en basal formel som möjliggör snabba och enkla modifieringar för att testa en mängd olika förhållanden för att karakterisera aminosyraupptag. Till exempel, för att testa om transportsystemet är Na + beroende, kan vi helt enkelt ersätta NaCl med kolinklorid för att göra Na + fri KRH. Denna flexibilitet är fördelaktig för att förhöra de olika transportsystem som förmedlar upptaget av enskilda aminosyror. Basala tillväxtmedier som alfa-MEM är också lämpliga för denna analys. I det här fallet köper vi vanligtvis alfa-MEM som saknar den enskilda aminosyran i fråga, som ersätts med den radiomärkta aminosyran för experimentet. Till exempel, för att utvärdera glutaminupptag använder vi glutaminfri alfa-MEM i primära benmärgsstromaceller15. KRH har vissa begränsningar på grund av sin enkla sammansättning. KRH är inte ett idealiskt alternativ om målet är att studera sekundära aktiva transportsystem som symporters och antiporters. Till exempel sker leucinupptag genom Slc7a5/Slc3a2 i utbyte mot glutamin. I detta fall kan leucinupptaget underskattas på grund av bristen på glutamin i KRH; snarare skulle användningen av leucinfritt alfa-MEM-medium vara att föredra i detta fall. Det är också viktigt att notera att användningen av en Geiger-räknare inte är obligatorisk vid arbete med isotop 3H. Det rekommenderas dock att hålla Geiger-räknaren på som en artighet för att varna människor om att du arbetar med strålning.
En kritisk och obligatorisk kontroll för det andra protokollet är kokningen av det kontralaterala benet. Detta är nödvändigt eftersom benmatrisen kan absorbera radioaktiva aminosyror oberoende av underlättad transport av benceller. Genom att decellularisera benet kan vi uppskatta mängden strålning som fångas av benmatrisen och använda den som baslinjeradioaktivitet för att normalisera upptaget. En annan viktig kontroll är att väga benen efter avlägsnande av epifyser och märg. Benets vikt används för att normalisera upptaget i förhållande till benaxelns storlek. Detta är viktigt eftersom storleken på benen kan variera på grund av många faktorer, allt från variabilitet under avlägsnandet av epifyserna till genetiska mutationer som påverkar tillväxten. En alternativ metod är att kvantifiera DNA-halten i benaxeln för normalisering. Enligt vår erfarenhet är normalisering av DNA-innehåll jämförbart med benvikt men lägger till fler steg som hanterar radioaktiva material. Således föredrar vi att normalisera till benvikt.
Dessa protokoll kan anpassas till cellinjer, inklusive ATDC5, MC3T3, 293 eller andra primära celler såsom calvarial osteoblaster, kondrocyter, benmärgsstromala celler, benmärgsmakrofager och osteoklaster. Dessutom är protokollen lätt anpassningsbara för att utvärdera andra radioaktiva isotoper (t.ex. 14C och 35S) samt olika näringsämnen, inklusive aminosyror, glukos och fettsyror. Dessutom kan protokoll II också anpassas till vuxna ben och pelletskulturer, med hänsyn till justering av inkubationstiden. Även om detta protokoll är mycket anpassningsbart är det viktigt att karakterisera kinetiken hos de nya isotopmärkta molekylerna eller i nya cellinjer innan experiment utförs. Transportkinetiken kan variera drastiskt mellan olika molekyler, olika isotoper eller olika celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Acknowledgments
Karner-labbet stöds av National Institute of Health R01-bidrag (AR076325 och AR071967) till C.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
